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Metal-ion binding and metal-ion induced folding of the adenine-sensing riboswitch aptamer domain
(2007)
Divalent cations are important in the folding and stabilization of complex RNA structures. The adenine-sensing riboswitch controls the expression of mRNAs for proteins involved in purine metabolism by directly sensing intracellular adenine levels. Adenine binds with high affinity and specificity to the ligand binding or aptamer domain of the adenine-sensing riboswitch. The X-ray structure of this domain in complex with adenine revealed an intricate RNA-fold consisting of a three-helix junction stabilized by long-range base-pairing interactions and identified five binding sites for hexahydrated Mg2+-ions. Furthermore, a role for Mg2+-ions in the ligand-induced folding of this RNA was suggested. Here, we describe the interaction of divalent cations with the RNA–adenine complex in solution as studied by high-resolution NMR spectroscopy. Paramagnetic line broadening, chemical shift mapping and intermolecular nuclear Overhauser effects (NOEs) indicate the presence of at least three binding sites for divalent cations. Two of them are similar to those in the X-ray structure. The third site, which is important for the folding of this RNA, has not been observed previously. The ligand-free state of the RNA is conformationally heterogeneous and contains base-pairing patterns detrimental to ligand binding in the absence of Mg2+, but becomes partially pre-organized for ligand binding in the presence of Mg2+. Compared to the highly similar guanine-sensing riboswitch, the folding pathway for the adenine-sensing riboswitch aptamer domain is more complex and the influence of Mg2+ is more pronounced.
The Nep1 (Emg1) SPOUT-class methyltransferase is an essential ribosome assembly factor and the human Bowen–Conradi syndrome (BCS) is caused by a specific Nep1D86G mutation. We recently showed in vitro that Methanocaldococcus jannaschii Nep1 is a sequence-specific pseudouridine-N1-methyltransferase. Here, we show that in yeast the in vivo target site for Nep1-catalyzed methylation is located within loop 35 of the 18S rRNA that contains the unique hypermodification of U1191 to 1-methyl-3-(3-amino-3-carboxypropyl)-pseudouri-dine (m1acp3Psi). Specific 14C-methionine labelling of 18S rRNA in yeast mutants showed that Nep1 is not required for acp-modification but suggested a function in Psi1191 methylation. ESI MS analysis of acp-modified Psi-nucleosides in a DeltaNep1-mutant showed that Nep1 catalyzes the Psi1191 methylation in vivo. Remarkably, the restored growth of a nep1-1ts mutant upon addition of S-adenosylmethionine was even observed after preventing U1191 methylation in a deltasnr35 mutant. This strongly suggests a dual Nep1 function, as Psi1191-methyltransferase and ribosome assembly factor. Interestingly, the Nep1 methyltransferase activity is not affected upon introduction of the BCS mutation. Instead, the mutated protein shows enhanced dimerization propensity and increased affinity for its RNA-target in vitro. Furthermore, the BCS mutation prevents nucleolar accumulation of Nep1, which could be the reason for reduced growth in yeast and the Bowen-Conradi syndrome.
High-resolution NMR structure of an RNA model system : the 14-mer cUUCGg tetraloop hairpin RNA
(2009)
We present a high-resolution nuclear magnetic resonance (NMR) solution structure of a 14-mer RNA hairpin capped by cUUCGg tetraloop. This short and very stable RNA presents an important model system for the study of RNA structure and dynamics using NMR spectroscopy, molecular dynamics (MD) simulations and RNA force-field development. The extraordinary high precision of the structure (root mean square deviation of 0.3 Å) could be achieved by measuring and incorporating all currently accessible NMR parameters, including distances derived from nuclear Overhauser effect (NOE) intensities, torsion-angle dependent homonuclear and heteronuclear scalar coupling constants, projection-angle-dependent cross-correlated relaxation rates and residual dipolar couplings. The structure calculations were performed with the program CNS using the ARIA setup and protocols. The structure quality was further improved by a final refinement in explicit water using OPLS force field parameters for non-bonded interactions and charges. In addition, the 2'-hydroxyl groups have been assigned and their conformation has been analyzed based on NOE contacts. The structure currently defines a benchmark for the precision and accuracy amenable to RNA structure determination by NMR spectroscopy. Here, we discuss the impact of various NMR restraints on structure quality and discuss in detail the dynamics of this system as previously determined.
Long-range tertiary interactions determine the three-dimensional structure of a number of metabolite-binding riboswitch RNA elements and were found to be important for their regulatory function. For the guanine-sensing riboswitch of the Bacillus subtilis xpt-pbuX operon, our previous NMR-spectroscopic studies indicated pre-formation of long-range tertiary contacts in the ligand-free state of its aptamer domain. Loss of the structural pre-organization in a mutant of this RNA (G37A/C61U) resulted in the requirement of Mg2+ for ligand binding. Here, we investigate structural and stability aspects of the wild-type aptamer domain (Gsw) and the G37A/C61U-mutant (Gswloop) of the guanine-sensing riboswitch and their Mg2+-induced folding characteristics to dissect the role of long-range tertiary interactions, the link between pre-formation of structural elements and ligand-binding properties and the functional stability. Destabilization of the long-range interactions as a result of the introduced mutations for Gswloop or the increase in temperature for both Gsw and Gswloop involves pronounced alterations of the conformational ensemble characteristics of the ligand-free state of the riboswitch. The increased flexibility of the conformational ensemble can, however, be compensated by Mg2+. We propose that reduction of conformational dynamics in remote regions of the riboswitch aptamer domain is the minimal pre-requisite to pre-organize the core region for specific ligand binding.
Die Genexpression in prokaryotischen Organismen unterliegt einer Vielzahl von Regulationsmechanismen, deren Aufgabe darin besteht, die Zelle an sich ändernde Umweltbedingungen anzupassen, um so das Überleben des prokaryotischen Organismus zu gewährleisten. Eine Reihe von Hitzeschock- und Virulenzgenen unterliegen temperaturabhängiger Regulation, mit dem Ziel, die Zelle an die sich ändernde Umgebung anzupassen. Die Messung der Temperatur erfolgt dabei über temperatursensitive RNA-Elemente, sogenannte RNA-Thermometer, die sich üblicherweise in der 5’-untranslatierten Region der Gene befinden, die sie regulieren. Sie unterdrücken die Translationsinitiation, indem sie die Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bei niedrigen Temperaturen über Basenpaarung blockieren und dadurch die Bindung des Ribosoms verhindern. In Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit wurde die thermodynamische Stabilität der temperatursensitiven Haarnadelschleife 2 des Salmonella FourU RNA-Thermometers über einen breiten Temperaturbereich analysiert. Freie Enthalpie-, Enthalpie- und Entropie-Werte für die Basenpaaröffnung der einzelnen Nukleobasen innerhalb der RNA wurden über die temperaturabhängige Messung von Iminoprotonen-Austauschraten mittels NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Austauschraten wurden für die Wildtyp-RNA und die A8C-Mutante bestimmt und miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass die Wildtyp-RNA durch das außergewöhnlich stabile Basenpaar G14-C25 stabilisiert wird. Dies konnte durch die Untersuchung der Entfaltung der destabilisierenden G14A-C25U-Doppelmutante verifiziert werden. Über CD-spektroskopsiche Untersuchungen konnte der globale Entfaltungsübergang der jeweiligen RNA analysiert werden. Das Mismatch-Basenpaar innerhalb des Wildtyp-RNA-Thermometers (A8-G31) erwies sich als Ursache für die geringere Kooperativität des Entfaltungsübergangs der Wildtyp-RNA im Vergleich zur A8C-Mutante. Enthalpie- und Entropie-Werte für die Basenpaaröffnung einzelner Nukleotide sind für beide RNAs linear korreliert. Die Steigungen dieser Korrelationen stimmen mit den Schmelzpunkten der RNAs überein, die über CD-Spektroskopie bestimmt wurden. Entfaltung der RNA tritt also genau dann auf, wenn alle Nukleotide gleiche thermodynamische Stabilitäten besitzen. Die Resultate sind mit einem Reißverschluss-Mechanismus für die RNA-Helix Entfaltung konsistent und erklärbar, in dem die Stapelinteraktionen der benachbarten Nukleobasen innerhalb der RNA-Helix verantwortlich für die beobachtete Kooperativität sind. Die Ergebnisse weisen auch auf die Wichtigkeit der RNA-Lösungsmittel-Interaktion für die Stabilität der RNA-Struktur hin. So konnten langreichweitige Wechselwirkungen der A8C-Mutation auf die Stabilität der G14-Nukleobase identifiziert werden, die möglicherweise über die Hydrathülle der RNA vermittelt werden. Schließlich konnte für das FourU-Motiv eine Mg2+-Bindestelle identifiziert werden, die die temperaturabhängige Stabilität des RNA-Thermometers beeinflusst. Es besteht also die Möglichkeit, dass Änderungen der intrazellulären Mg2+-Konzentration die Expression des agsA-Gens in vivo modulierend beeinflussen. In Kapitel 3 dieser Arbeit wurden die dynamischen Eigenschaften des Phosphodiesterrückgrats einer perdeuterierten cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA untersucht. Dazu wurden die Relaxationseigenschaften aller 31P-Kerne dieser RNA bei magnetischen Feldstärken von 300, 600 und 900 MHz untersucht. Dipolare Relaxationsbeiträge konnten unterdrückt werden, indem eine perdeuterierte RNA-Probe in einem D2O-Puffer verwendet wurde. Um die 31P-Relaxationsdaten (R1, R2) interpretieren zu können, wurde zusätzlich mittels Festkörper-NMR die Chemische Verschiebungsanisotropie (CSA) der 31P-Kerne des Phosphodiesterrückgrats bestimmt. Die Messungen wurden bei verschiedenen Salzkonzentrationen und unter unterschiedlichen Hydratationsbedingungen durchgeführt. Aus den Daten konnte ein 31P-CSA-Wert von 178.5 ppm im statischen Zustand (S2 = 1) bestimmt werden. Auf der Grundlage der durchgeführten R1- und R2-Messungen wurde eine Modelfree-Analyse durchgeführt, um Informationen über die schnellen Dynamiken des Phosphodiesterrückgrats zu erhalten. Die Resultate zeigen, dass die Dynamiken des Phosphodiesterrückgrats auf der Subnanosekundenzeitskala stärker ausgeprägt sind als die Dynamiken der Ribofuranosylreste und der Nukleobasen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Dynamik einer individuellen Phosphatgruppe zu der jeweiligen 5’-benachbarten Nukleobase korreliert ist. In Kapitel 4 dieser Arbeit wird die Entwicklung neuer Methoden beschrieben, mit denen Torsionswinkelinformation aus der Analyse kreuzkorrelierter Relaxationsraten gewonnen werden können. Im ersten Teil des Kapitels wird die Entwicklung einer neuen NMR-Pulssequenz beschrieben, über die der glykosidische Torsionswinkel Chi in 13C,15N-markierten Oligonukleotiden bestimmt werden kann. Mit dem neuen quantitativen Gamma-HCNCH-Experiment ist es möglich, die dipolaren kreuzkorrelierten Relaxationsraten Gamma-C6H6-C1´H1´ (Pyrimidine) und Gamma-C6H6-C1´H1´ (Purine) zu messen. Die kreuzkorrelierten Relaxationsraten wurden an einer 13C,15N-markierten cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA bestimmt. Die aus den Raten extrahierten Chi-Winkel wurden mit bereits vorhandener Strukturinformation verglichen. Sie stimmen bemerkenswert gut mit den Winkeln der Kristallstruktur des Tetraloops überein. Zusätzlich wurde die neue Methode an einer größeren 30mer-RNA, dem „Stemloop D“ (SLD) aus dem Coxsackievirus-B3-Kleeblatt, getestet. Für die SLD-RNA wurde der Effekt von anisotroper Rotationsdiffusion auf die Relaxationsraten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Chi-Winkelbestimmung besonders für Nukleotide in der anti-Konformation sehr genau ist und die Methode eine eindeutige Unterscheidung von syn- und anti-Konformation zulässt. Im zweiten Teil von Kapitel 4 wird die Entwicklung des Gamma-HCCCH-Experiments beschrieben. Hierbei handelt es sich um eine neue NMR-Pulssequenz zur Messung der Gamma-C1´H1´-C3´H3´-Rate in 13C-markierten RNAs. Die Funktionsfähigkeit der neuen Methode wurde an einer cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA demonstriert. Zusätzlich dazu wurden die analytischen Gamma-C1´H1´-C3´H3´(P,nü_max)-, Gamma-C1´H1´-C4´H4´(P,nü_max)- und Gamma-C2´H2´-C4´H4´(P,nü_max)-Abhängigkeiten mathematisch hergeleitet. Die an der 14mer-RNA gemessenen Gamma-C1´H1´-C3´H3´-Raten wurden mit Hilfe der Gamma-C1´H1´-C3´H3´(P,nü_max)-Beziehung analysiert. Die Ergebnisse für die Pseudorotationsphase P sind konsistent mit Referenzwinkeln aus der 14mer-NMR-Struktur und den bereits bekannten (Gamma-C1´H1´-C2´H2´)/(Gamma-C3´H3´-C4´H4´)-Ratenverhältnissen. Die neue Methode liefert zusätzliche Informationen, um Konformation (P, nü_max) und Dynamik S2(C1´H1´-C3´H3´) der Ribosereste in RNA-Molekülen genauer beschreiben zu können. In Kapitel 5 dieser Arbeit wird die Entwicklung des 3D-HNHC-Experiments, einer neuen NMR-Pulssequenz, beschrieben. Dieses Experiment ermöglicht es, die H2-, C2- und N1-Resonanzen in Adenin-Nukleobasen 13C, 15N-markierter RNA-Oligonukleotide miteinander zu korrelieren. Die Funktionsfähigkeit der neuen Methode wurde an einer mittelgroßen, entsprechend markierten 36mer-RNA demonstriert. Die neue Methode vereinfacht die Zuordnung der Kerne der Adenin-Nukleobasen, da Zuordnungsmehrdeutigkeiten aufgrund überlappender Resonanzen in der 1H-Dimension aufgelöst werden können. In Kombination mit dem TROSY-relayed-HCCH-COSY-Experiment liefert das neue 3D-HNHC-Experiment das fehlende Glied für die Zuordnung der Imino-H3-Resonanzen der Uracil-Nukleobasen über das AU-Basenpaar hinweg zu den H8-Resonanzen der Adenin-Nukleobasen.
In prokaryotes, RNA thermometers regulate a number of heat shock and virulence genes. These temperature sensitive RNA elements are usually located in the 5'-untranslated regions of the regulated genes. They repress translation initiation by base pairing to the Shine–Dalgarno sequence at low temperatures. We investigated the thermodynamic stability of the temperature labile hairpin 2 of the Salmonella fourU RNA thermometer over a broad temperature range and determined free energy, enthalpy and entropy values for the base-pair opening of individual nucleobases by measuring the temperature dependence of the imino proton exchange rates via NMR spectroscopy. Exchange rates were analyzed for the wild-type (wt) RNA and the A8C mutant. The wt RNA was found to be stabilized by the extraordinarily stable G14–C25 base pair. The mismatch base pair in the wt RNA thermometer (A8–G31) is responsible for the smaller cooperativity of the unfolding transition in the wt RNA. Enthalpy and entropy values for the base-pair opening events exhibit linear correlation for both RNAs. The slopes of these correlations coincide with the melting points of the RNAs determined by CD spectroscopy. RNA unfolding occurs at a temperature where all nucleobases have equal thermodynamic stabilities. Our results are in agreement with a consecutive zipper-type unfolding mechanism in which the stacking interaction is responsible for the observed cooperativity. Furthermore, remote effects of the A8C mutation affecting the stability of nucleobase G14 could be identified. According to our analysis we deduce that this effect is most probably transduced via the hydration shell of the RNA.
BACKGROUND: Parkinson's disease (PD), the second most frequent neurodegenerative disorder at old age, can be caused by elevated expression or the A53T missense mutation of the presynaptic protein alpha-synuclein (SNCA). PD is characterized pathologically by the preferential vulnerability of the dopaminergic nigrostriatal projection neurons. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Here, we used two mouse lines overexpressing human A53T-SNCA and studied striatal dysfunction in the absence of neurodegeneration to understand early disease mechanisms. To characterize the progression, we employed young adult as well as old mice. Analysis of striatal neurotransmitter content demonstrated that dopamine (DA) levels correlated directly with the level of expression of SNCA, an observation also made in SNCA-deficient (knockout, KO) mice. However, the elevated DA levels in the striatum of old A53T-SNCA overexpressing mice may not be transmitted appropriately, in view of three observations. First, a transcriptional downregulation of the extraneural DA degradation enzyme catechol-ortho-methytransferase (COMT) was found. Second, an upregulation of DA receptors was detected by immunoblots and autoradiography. Third, extensive transcriptome studies via microarrays and quantitative real-time RT-PCR (qPCR) of altered transcript levels of the DA-inducible genes Atf2, Cb1, Freq, Homer1 and Pde7b indicated a progressive and genotype-dependent reduction in the postsynaptic DA response. As a functional consequence, long term depression (LTD) was absent in corticostriatal slices from old transgenic mice. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: Taken together, the dysfunctional neurotransmission and impaired synaptic plasticity seen in the A53T-SNCA overexpressing mice reflect early changes within the basal ganglia prior to frank neurodegeneration. As a model of preclinical stages of PD, such insights may help to develop neuroprotective therapeutic approaches.