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Metallorganische Netzwerke (engl. metal-organic frameworks, MOFs) sind eine neuartige Klasse mikro/mesoporöser Materialien, für die eine Vielzahl von möglichen Anwendungen demonstriert werden konnte. Das Ziel dieser Arbeit besteht in der Synthese von MOF Mikro/Nanopartikeln sowie der Herstellung von sogenannten Oberflächen-deponierten MOFs (engl. surface-attached metal-organic frameworks, SURMOFs). MOF Partikel mit kontrollierbarer Morphologie und Größe wurden unter milden Bedingungen synthetisiert. Um MOFs als Sensoren, intelligente Membrane, oder in nanotechnologischen Bauelementen verwenden zu können, ist die Integration auf der jeweiligen Oberfläche wichtig. Daher beschäftigt sich der Großteil dieser Arbeit mit der kontrollierten Abscheidung von SURMOFs auf verschiedenartigen Trägermaterialien. Etliche interessante Eigenschaften (z.B. die Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Gegenwart von Gastmolekülen und die dynamische Gasadsorptionskapazität) der SURMOFs wurden untersucht.
C-Typ Lektin-ähnliche Rezeptoren (CTLRs) auf Lymphozyten des Immunsystems modulieren deren Effektorfunktionen wie Zytotoxizität oder Zytokinsekretion. Die Gene dieser Immunrezeptoren befinden sich in einer definierten genomischen Region, dem Natürlichen Killer Genkomplex (NKC), welcher im Menschen auf Chromosom 12 und in der Maus auf Chromosom 6 lokalisiert ist. Namensgebend für diesen Gencluster ist die erste Beschreibung von CTLRs auf Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), den Effektorlymphozyten des angeborenen Immunsystems. Einige NKC-kodierte CTLR, insbesondere Vertreter der C-Typ Lektin Familie 2 (CLEC2)-Rezeptorfamilie, werden jedoch auch in nicht-lymphozytären Zellen (z.B. humanes KACL in Keratinozyten, Maus Clr-f in Darmepithelzellen) vorgefunden und in Zusammenhang mit einer gewebsspezifischen Immunüberwachung gebracht. Bemerkenswerterweise sind die Lymphozytenassoziierten Rezeptoren dieser CLEC2-Proteine ebenso CTLRs, welche zudem eng benachbart zu den CLEC2-Proteinen im NKC kodiert sind, sodass es sich um genetisch gekoppelte Rezeptor-Liganden-Paare mit immunologischer Funktion handelt.
Zu Beginn der vorliegenden Arbeit richtete sich das Interesse auf ein bislang uncharakterisiertes Mitglied der CLEC2-Proteinfamilie (CLEC2L), das jedoch außerhalb des NKC und in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem weiteren und ebenso uncharakterisierten CTLR (KLRG2) kodiert ist. Im Unterschied zu anderen Mitgliedern der CLEC2-Familie ist CLEC2L (wie auch KLRG2) in Säugetieren hochkonserviert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob CLEC2L wie andere Mitglieder der CLEC2-Proteinfamilie eine gewebsspezifische Expression aufweist, mit einem genetisch gekoppelten CTLR, d. h. mit KLRG2, interagiert und funktionell in Verbindung mit dem Immunsystem gebracht werden kann. Ziel dieser Arbeit war es somit, eine detaillierte Expressions- und Funktionsstudie zu CLEC2L durchzuführen.
Mittels quantitativer Echtzeit-PCR und in situ Hybridisierung konnte CLEC2L-RNA im humanen und Maus-Gehirn nachgewiesen werden. Da die Mengen dort das Expressionsniveau in anderen Organen bei Weitem überstiegen, wurde das CLEC2L-kodierte Protein als BACL (engl. Brain-Associated C-type Lectin) neu benannt. Ektop exprimiertes BACL bildet ähnlich wie viele andere CLEC2-Mitglieder ein disulfid-verknüpftes Homodimer auf der Zellmembran von Säugetierzellen. Um die endogene Proteinexpression dieses gehirnassoziierten „Waisen"-Rezeptors zu charakterisieren, wurde die BACL-Ektodomäne rekombinant produziert und als Immunogen zur Herstellung BACLspezifischer Antikörper eingesetzt. Mit diesen Antikörpern und einer Kombination immunologischer Techniken wie Immunhistochemie, Immunfluoreszenz und Immunpräzipitation konnte die Präsenz von BACL auf humanen und Maus-Neuronen des Gehirns mit einer besonders ausgeprägten Expression in Purkinje-Zellen zum ersten Mal gezeigt werden. Neben dem Gehirn wurden andere Bereiche des Nervensystems, darunter Spinalganglien und Retina, auf die Expression des BACL-Proteins untersucht. Hierbei konnte mittels Immunfluoreszenz und hochauflösender konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass BACL mit Neuronenmembranen assoziiert ist. Die durchflusszytometrische Analyse von in vitro kultivierten Neurosphären untermauerte die Expression von endogenem BACL als membranständiges Oberflächenprotein.
Diverse Ansätze zur Identifizierung von Interaktionspartnern von BACL erbrachten letztlich keine eindeutigen Ergebnisse. KLRG2 wurde ursprünglich aufgrund seiner benachbarten genomischen Lokalisation als möglicher Rezeptor von BACL favorisiert, jedoch konnten weder Reporterassays noch durchflusszytometriebasierte Bindungsanalysen eine Interaktion dieser beiden Proteine aufzeigen. Auch die aus den massenspektrometrischen Analysen von humanen und Maus BACL-Immunpräzipitaten erhaltenen Kandidatenproteine konnten letztendlich nicht als Interaktionspartner von BACL eindeutig verifiziert werden.
Eine mögliche immunologische Bedeutung von BACL in vivo wurde im Rahmen von Tumorimplantationsexperimenten mit BACL-exprimierenden Tumorzellen untersucht. Hierbei wurde das Tumorwachstum von BACL- mit Kontroll-Transfektanten in C57BL/6 Mäusen verglichen. Der beobachtete Effekt des verlangsamten Tumorwachstums nach BACL-Überexpression war jedoch nicht auf BACL-Erkennung durch Lymphozyten zurückzuführen, wie anhand von immundefizienten Rag1-k.o. und NOD-SCID-gammak.o. Mäusen gezeigt werden konnte.
Insgesamt liefert diese Arbeit die Erstbeschreibung des bislang uncharakterisierten CTLRs BACL. Das Protein teilt strukturelle Merkmale mit Mitgliedern der CLEC2-Familie, unterscheidet sich jedoch deutlich durch (i) seine hohe Konservierung in Säugetieren, (ii) seine Kodierung außerhalb des NKC und (iii) seine pan-neuronale Expression. Die Erkenntnis, dass BACL in Maus- und in humanen Neuronen exprimiert wird, wirft die Frage nach seiner funktionellen Relevanz auf. Als Membranprotein könnte es eine wichtige Rolle in der neuronalen Kommunikation und bei zellulären Kontakten spielen. Die Frage nach der Funktion von BACL wird in zukünftigen Forschungsarbeiten zu klären sein.
Eine Infektion mit dem Hepatitis B Virus (HBV) kann bei 5-10 % der infizierten Erwachsenen und 70-90 % der infizierten Kinder chronisch verlaufen. Trotz einer verfügbaren Impfung gegen die Erkrankung sind heute nach Angaben der WHO weltweit etwa 350 Mio. Menschen chronisch HBV-infiziert [Lupberger and Hildt, 2007, Hollinger and Liang, 2001]. In 5-10 % der Fälle führt eine chronische Infektion zu einer Leberfibrose und Zirrhose, welche letztlich zur Ausbildung eines hepatozellulären Karzinoms (HCC) führen kann. HCCs sind die dritthäufigste karzinomassoziierte Todesursache weltweit [Blum, 2005]. Um Therapien gegen eine HBV-Infektion und das damit erhöhte Risiko einer HCC-Entstehung entwickeln zu können, müssen die einzelnen Schritte des HBV-Replikationszyklus verstanden sein. Wesentliche Schritte der frühen Infektionsphase, insbesondere der Rezeptor bzw. Rezeptorkomplex, welcher den Zelleintritt des Virus vermittelt sowie der Transport des Virusgenoms in den Zellkern, sind bisher noch unklar. Auch der Exportprozess und die Freisetzung der Viruspartikel ist bisher noch nicht im Detail verstanden. Es ist jedoch bekannt, dass die Viruspartikel unter Nutzung der zellulären ESCRT (endosomal sorting complex required for transport)-Maschinerie aus der Zelle freigesetzt werden [Lambert et al., 2007]. Auf der Suche nach Faktoren, die in diese Vorgänge involviert sind, konnte in dieser Arbeit das vesikeltransportassoziierte Protein α-Taxilin identifiziert werden. Der Einfluss von HBV auf die α-Taxilin-Bildung und seine mögliche Beteiligung am viralen Export wurden dabei näher charakterisiert. In HBV-positiven Zellen konnte in vivo und in vitro eine signifikante Steigerung der α-Taxilin-Expression nachgewiesen werden. Diese wird hierbei durch die HBV-Proteine HBx und LHBs über den Raf/Mek/Erk-Signalweg induziert [Glatzel, 2011]. Mithilfe von knockdown-Experimenten konnte beobachtet werden, dass α-Taxilin für den Export der Viruspartikel, nicht aber für den Export subviraler Partikel (SVPs) essentiell ist. Der Export der Virionen findet hierbei über das ESCRT-System statt. Den HBV-Strukturproteinen fehlen jedoch die für die Interaktion mit dem ESCRT-System essentiellen late-Domänen. Die Proteinstruktur von α-Taxilin dagegen weist diese late-Domänen auf. In dieser Arbeit konnte diese interaktionsvermittelnde Funktion von α-Taxilin zwischen dem Virus und dem ESCRT-System charakterisiert werden. Über eine Interaktion von α-Taxilin mit dem viralen LHBs-Protein auf der einen Seite und der tsg101-Komponente des ESCRT-I-Komplexes auf der anderen Seite agiert α-Taxilin als eine Art Linker zwischen dem ESCRT-System und HBV.
Darüber hinaus wurde Annexin A5 als zellulärer Interaktionspartner für α-Taxilin identifiziert [Röttger, 2011]. Es dirigiert α-Taxilin in einer Art shuttle-Funktion auf die Zellmembran suszeptibler Zellen und bindet es an deren Zelloberfläche. Diese Exposition von α-Taxilin nimmt während der Dedifferenzierung in Korrelation mit dem Suszeptibilitätsverlust primärer Hepatozyten ab. Eine Maskierung von α-Taxilin durch eine vorherige Inkubation der Zellen mit α-Taxilin-spezifischen Antikörpern konnte die Bindung und die Aufnahme der Viren inhibieren. Überexpressionsstudien bestätigten die essentielle Rezeptorfunktion von α-Taxilin. Die verstärkte Produktion von α-Taxilin führte zur Suszeptibilität der Zellen. Auch die Speziesspezifität der Bindung zwischen humanem α-Taxilin und HBV konnte in einem Co-Immunpräzipitationsexperiment mit den rezeptorbindenden Domänen von HBV, WHV und DHBV identifiziert werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte somit zum ersten Mal eine Rezeptorfunktion von α-Taxilin bei der Aufnahme von HBV in die Wirtszelle nachgewiesen werden. Darüber hinaus schreiben die in dieser Arbeit gemachten Beobachtungen α-Taxilin eine essentielle Funktion für die Vermittlung des ESCRT-abhängigen Exports der Virionen aus der Zelle zu. Die hierbei gewonnen Erkenntnisse sind von hoher Relevanz für die weitere Erforschung der HBV-assoziierten Pathogenese und die Etablierung eines in vivo Infektions-Modells.