OPUS 4 | Search

Super-Resolution Microscopy Reveals Specific Recruitment of HIV-1 Envelope Proteins to Viral Assembly Sites Dependent on the Envelope C-Terminal Tail (2013)

Walter Muranyi Sebastian Malkusch Barbara Müller Mike Heilemann Hans-Georg Kräusslich

The inner structural Gag proteins and the envelope (Env) glycoproteins of human immunodeficiency virus (HIV-1) traffic independently to the plasma membrane, where they assemble the nascent virion. HIV-1 carries a relatively low number of glycoproteins in its membrane, and the mechanism of Env recruitment and virus incorporation is incompletely understood. We employed dual-color super-resolution microscopy visualizing Gag assembly sites and HIV-1 Env proteins in virus-producing and in Env expressing cells. Distinctive HIV-1 Gag assembly sites were readily detected and were associated with Env clusters that always extended beyond the actual Gag assembly site and often showed enrichment at the periphery and surrounding the assembly site. Formation of these Env clusters depended on the presence of other HIV-1 proteins and on the long cytoplasmic tail (CT) of Env. CT deletion, a matrix mutation affecting Env incorporation or Env expression in the absence of other HIV-1 proteins led to much smaller Env clusters, which were not enriched at viral assembly sites. These results show that Env is recruited to HIV-1 assembly sites in a CT-dependent manner, while Env(ΔCT) appears to be randomly incorporated. The observed Env accumulation surrounding Gag assemblies, with a lower density on the actual bud, could facilitate viral spread . Keeping Env molecules on the nascent virus low may be important for escape from the humoral immune response, while cell-cell contacts mediated by surrounding Env molecules could promote HIV-1 transmission through the virological synapse.

Perfluoraryl-substituierte Borate und Borane zur Hydroborierung und Katalyse von Diels-Alder-Reaktionen (2012)

Anna Schnurr

Lewis-azide Organoborverbindungen finden Verwendung als Anionensensoren und als (Co)katalysatoren in der Metallocen-vermittelten Olefinpolymerisation bzw. in elektrocyclischen Reaktionen. Mit Lewis-Basen, die sterisch anspruchsvolle Reste tragen, können sie keine stabilen Addukte ausbilden. Solche Systeme werden als „frustrierte Lewispaare“ (FLPs) bezeichnet. Diese zeigen eine besondere kooperative Reaktivität gegenüber kleinen Molekülen und haben sich insbesondere in der metallfreien Aktivierung molekularen Wasserstoffs bewährt. Ein Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer kostengünstigen, ungefährlichen und einfachen Synthese von (C6F5)2BH („Piers' Boran“). Dieses stark elektrophile Reagenz wird in der FLP-Chemie eingesetzt und monohydroboriert selektiv terminale C≡C-Funktionen. Die literaturbekannten Darstellungsmethoden dieses Borans sind präparativ aufwendig oder erfordern kostspielige Startmaterialien. Die Hydrid-Abstraktion aus dem [(C6F5)2BH2]−-Anion, welches aus einer Eintopfreaktion zwischen BH3·SMe2, C6F5MgBr und ClSiMe3 erhalten wurde und je nach Aufarbeitung in der Zusammensetzung [Mg2(Et2O)3Br2Cl][(C6F5)2BH2] bzw. [Mg(Et2O)2][(C6F5)2BH2]2 kristallisiert, bietet eine Methode zur insitu-Präparation von Piers' Boran. Es kann mit terminalen Alkinen als Monohydroborierungsprodukt oder mit Dimethylsulfid als Lewis-Säure-Base-Addukt abgefangen werden (Abbildung 1). Zusätzlich sind sowohl das Salz [Mg2(Et2O)3Br2Cl][(C6F5)2BH2] als auch das Addukt (C6F5)2BH·SMe2 geeignete Präkursoren für die literaturbekannten FLPs I und II...Mit dem Ziel der Synthese eines Methylen-verbrückten Boran-Phosphans zur H2-Aktivierung wurde der Borinsäureester (C6F5)2BOEt mit dem Lithiumorganyl LiCH2PtBu2 umgesetzt. Dies lieferte nicht die Zielverbindung (C6F5)2BCH2PtBu2, sondern in sehr selektiver Reaktion das bicyclische Phosphoniumborat (EtO)(C6F5)B(CH2)(C6F4)PtBu2 ((III)OEt), welches mit HCl quantitativ zum Chlorid-Addukt (III)Cl reagiert (Abbildung 2). Dadurch wird am (chiralen) Borzentrum eine bessere Abgangsgruppe eingeführt und die luftund wasserstabile Spezies (III)OEt aktiviert. Der Fluorierungsgrad in (III)Cl kann durch Austausch des exocyclischen C6F5-Restes gegen eine Phenylgruppe oder durch eine F/H- bzw. F/tBu-Substitution am verbrückenden C6F4-Ring variiert werden. Nach Ersatz einer tBu-Funktion am Phosphoratom gegen eine Methylgruppe wurde ein zweites Chiralitätszentrum in das Molekülgerüst des Phosphoniumborats eingeführt. Mit Silbersalzen schwach koordinierender Anionen (AgA) reagiert (III)Cl quantitativ zu den entsprechenden Addukten (III)A (A = Acetat, Trifluoracetat, Nitrat, Tosylat, Triflat). Ungeladene Donoren (Do) verdrängen den Triflat-Rest in (III)OTf und führen zu den Salzen [(III)Do]+[OTf]− (Do = OPEt3, Pyridin, H2O)...Das freie Boran [III]+ existiert nur in Gegenwart des sehr schwach koordinierenden Anions [Al[OC(CF3)3]4]–. Mit einer Gutmann-Akzeptornummer (AN) von AN = 87.3 ist es eine stärkere Lewis-Säure als die ungeladene Verbindung (C6F5)3B (AN = 80.0). Auch die – im Vergleich zu (C6F5)3B·Do – kürzeren B–O/N-Bindungslängen in [(III)Do][OTf] (Do = OPEt3, Pyridin, H2O) bestätigen diese Beobachtung. Sowohl die freie Lewis-Säure [III]+ als auch ihr Triflat-Addukt (III)OTf katalysieren die Diels-Alder-Reaktion zwischen Cyclopentadien und 2,5-Dimethyl-,4-benzochinon. Die Reaktion läuft in Gegenwart von [III]+ schneller ab als in Anwesenheit von (III)OTf. Dennoch hat das Triflat-Addukt gegenüber [III]+ den Vorteil, dass im Laufe der Cycloaddition keine konkurrierende Polymerisation des Cyclopentadiens auftritt.

HuR promotes tumorigenic characteristics in hepatocellular carcinoma (2012)

Kathrin Schulz

In the absence of apparent mutations, alteration of gene expression patterns represents the key mechanism by which normal cells evolve to cancer cells. Gene expression is tightly regulated by posttranscriptional processes. Within this context, RNA-binding proteins (RBPs) represent fundamental factors, since they control mechanisms, such as mRNA-stabilization, -translation and -degradation. Human antigen R (HuR) was among the first RBPs that have been directly associated to carcinogenesis. HuR modulates the stability and translation of mRNAs which encode proteins facilitating various ‘hallmarks of cancer’, namely proliferation, evasion of growth suppression, angiogenesis, cell death resistance, invasion and metastasis. Furthermore, it is well established that tumor-promoting inflammation contributes to tumorigenesis. In this process, monocytes are attracted to the site of the tumor and educated towards a tumor-promoting macrophage phenotype. While HuR has been extensively studied in various tumor cell types, little is known about HuR in hepatocellular carcinoma (HCC). Thus, the aim of my work was to characterize the contribution of HuR to the development of cancer characteristics in HCC. I was particularly interested to investigate if HuR facilitates tumor-promoting inflammation, since a role for HuR has not been described in this context. To this end, I depleted HuR in HepG2 cells (HuR k/d) and used a co-culture model of HepG2 tumor spheroids and infiltrating monocytes to study the impact of HuR on the tumor microenvironment. I could show that depletion of HuR resulted in the reduction of cell numbers. Additionally, the expression of proliferation marker KI-67 and proto-oncogene c-Myc was reduced, supporting a proliferative role of HuR. Furthermore, exposure to cytotoxic staurosporine elevated apoptosis in HuR k/d cells compared to control cells. Concomitantly, the expression of the anti-apoptotic mediator B-cell lymphoma protein-2 (Bcl-2) was markedly reduced in the HuR k/d cells, pointing to an involvement of HuR in cell survival processes. Accordingly, a pro-survival function of HuR was also observed in tumor spheroids, since HuR k/d spheroids exhibited a larger necrotic core region at earlier time points and showed elevated numbers of dead cells compared to control (Ctr.) spheroids. Interestingly, HuR k/d spheroids isplayed reduced numbers of infiltrated macrophages, suggesting that HuR contributes to a tumor-promoting, inflammatory microenvironment by recruiting monocytes/macrophages to the tumor site. Aiming at identifying HuR-regulated factors responsible for the recruitment of monocytes, I found reduced levels of the chemokine interleukin 8 (IL-8) in supernatants of HuR k/d spheroids, supporting a critical involvement of HuR in the chemoattraction of monocytes. Analyzing supernatants of co-cultures of macrophages and HuR k/d or Ctr. spheroids revealed additional differences in chemokine secretion patterns. Interestingly, protein levels of many chemokines were elevated in co-cultures of HuR k/d spheroids compared to control co-cultures. Albeit enhanced chemokine secretion was observed, less monocytes are recruited into HuR k/d spheroids, further underlining the necessity of HuR in cancer related monocyte/macrophage attraction and infiltration. Differences between chemokine profiles of mono- and co-cultured spheroids could be attributable to changes in spheroid-derived chemokines as a result of the crosstalk with the immune cells. Provided the chemokines originate from monocytes/macrophages, the different secretion patterns suggest that HuR contributes to the modulation of the functional phenotype of infiltrated macrophages, since the tumorenvironment is critically involved in the shaping of macrophage phenotypes. Regions of low-oxygen (hypoxia) represent another critical feature of tumors. Therefore, I next analyzed the impact of HuR on the hypoxic response. Loss of HuR attenuated hypoxia-inducible factor (HIF) 2α expression after exposure to hypoxia, while HIF-1α protein levels remained unaltered. Considering previous results of our group, showing that HIF-2α depletion (HIF-2α k/d) resulted in the enhanced expression of HIF-1α protein, I aimed to determine the involvement of HuR in the compensatory upregulation of HIF-1α protein in HIF-2α k/d cells. I could demonstrate that not only total HuR protein levels, but specifically cytoplasmic HuR was elevated in HIF-2α depleted cells pointing to enhanced HuR activity. Silencing HuR in HIF-2α deficient cells attenuated enhanced HIF-1α protein expression, thus confirming a direct role of HuR in the compensatory upregulation of HIF-1α. This as also reflected on HIF-1α target gene expression. I further investigated the mechanism underlying the compensatory HIF-1α expression in HIF-2α deficient cells. Analyzing HIF-1α mRNA expression, I excluded enhanced HIF1-α transcription and stability to account for elevated HIF-1α expression in HIF-2α k/d cells. HIF-1α promoter activity assays confirmed the mRNA data. Furthermore, HIF-1α protein half-life was not elevated in HIF-2α k/d cells compared to control cells, indicating that HIF-1α protein stability is not altered in HIF-2α k/d cells. Analysis of the association of HIF-1α with the translational machinery using polysomal fractionation finally revealed an increased istribution of HIF-1α mRNA in the heavier polysomal fractions in HIF-2α k/d cells compared to control cells. Since augmented ribosome occupancy is an indicator for more efficient translation, I propose enhanced HIF-1α translation as underlying principle of the compensatory increase in HIF-1α protein levels in HIF-2α k/d cells. In summary, my results demonstrate that HuR is critical for the development of cancer characteristics in HCC. Future work analyzing the impact of HuR on tumor-promoting inflammation, specifically macrophage attraction and activation could provide new trategies to inhibit macrophage-driven tumor progression. Furthermore, I provide evidence that HuR contributes to the hypoxic response by regulating the expression of HIF-1α and HIF-2α. Targeting single HIF-isoforms for tumor therapy should be carefully considered, because of their compensatory regulation when one α-subunit is depleted. Thus, therapeutic strategies targeting factors such as HuR that control both α-subunits and at the same time prevent compensation might be more promising.

Keeping track of worm trackers (2012)

Steven J. Husson Wagner Steuer Costa Cornelia Schmitt Alexander Gottschalk

C. elegans is used extensively as a model system in the neurosciences due to its well defined nervous system. However, the seeming simplicity of this nervous system in anatomical structure and neuronal connectivity, at least compared to higher animals, underlies a rich diversity of behaviors. The usefulness of the worm in genome-wide mutagenesis or RNAi screens, where thousands of strains are assessed for phenotype, emphasizes the need for computational methods for automated parameterization of generated behaviors. In addition, behaviors can be modulated upon external cues like temperature, O2 and CO2 concentrations, mechanosensory and chemosensory inputs. Different machine vision tools have been developed to aid researchers in their efforts to inventory and characterize defined behavioral “outputs”. Here we aim at providing an overview of different worm-tracking packages or video analysis tools designed to quantify different aspects of locomotion such as the occurrence of directional changes (turns, omega bends), curvature of the sinusoidal shape (amplitude, body bend angles) and velocity (speed, backward or forward movement).

Elektronentransfer zwischen CdSe-Quantenpunkten und Methylviologen (2012)

Lars Dworak

Es wurde die Photodynamik freier kolloidaler CdSe Quantenpunkte sowie die Elektronentransfer(ET)-Dynamik im System bestehend aus CdSe Quantenpunkten und adsorbiertem Methylviologen mit Hilfe der Femtosekunden-Laserspektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. Die freien CdSe Quantenpunkte wiesen eine multiphasische Rekombinationsdynamik der photoinduzierten Exzitonen auf, was durch das Vorhandensein von Quantenpunkten mit unterschiedlichem Passivierungsgrad innerhalb einer Quantenpunktprobe erklärt wurde. Sowohl die Rekombinationsdynamik des Exzitons als auch die Intraband-Relaxation von Elektron und Loch besaßen eine Abhängigkeit von der Partikelgröße. Die 1P-1S-Relaxationzeit des Elektrons betrug in Partikeln mit Durchmessern von 3 nm und 6,3 nm 0,12 ps bzw. 0,24 ps, woraus sich Energieverlustraten von 1,0 eV/ps und 3,8 eV/ps berechnen ließen. Die sehr schnelle Natur der 1P-1S-Relaxation und die gefundene Größenabhängigkeit stehen im Einklang mit dem vermuteten Auger-artigen Energietransfer vom hochangeregten Elektron auf das Loch. Durch diesen Prozess kann das theoretisch vorhergesagte „phonon bottleneck“ effizient umgangen werden. Zudem konnte eine größenabhängige Biexziton-Bindungsenergie zwischen 40 meV und 28 meV ermittelt werden. Die Untersuchung von Multiexzitonen in CdSe Quantenpunkten zeigte einen schnellen Zerfallskanal. Es handelt es sich um die Auger-Rekombination. Die Rekombination nach 1P-Anregung wurde in Form von sequenziellen Schritten N, N-1, N-2,..., 1 interpretiert. Für das System bestehend aus CdSe Quantenpunkten und adsorbiertem Methylviologen wurde war eine Zunahme der ET-Rate bei steigender Akzeptorkonzentration zu beobachten, die mit der Zunahme von Akzeptorzuständen erklärt werden kann. Ferner wurde eine maximale ET-Rate erreicht, die bei einer weiteren Erhöhung der Akzeptorkonzentration nicht überschritten wird. In weiteren Versuchsreihen konnte gezeigt werden, dass die Größe der Partikel einen Einfluss auf den ET-Prozess zwischen Quantenpunkt und Methylviologen hat. Eine kombinierte Studie, in der sowohl das Quantenpunkt/Methylviologen-Verhältnis als auch die Quantenpunktgröße variiert wurde, verdeutlichte, dass eine Verkleinerung der Partikel zu einem Anstieg der ET-Rate führt. Die Variation der Partikelgröße geht mit einer Veränderung der Triebkraft der ET-Reaktion im gekoppelten System einher. Der gefundene Zusammenhang zwischen der Triebkraft der Reaktion und der ET-Rate ist gut mit der Marcus-Theorie vereinbar. In einer Serie von Experimenten am Quantenpunkt/Methylviologen ET-System wurde die Anregpulsenergie variiert, um den Einfluss von Multiexzitonen auf den Elektronentransfer zu untersuchen. Es zeigte sich, dass nach Mehrfachanregung der Quantenpunkte die Separation von bis zu vier Elektron-Loch-Paaren möglich ist. Für den Elektronentransfer im untersuchten ET-System wurde eine ET-Zeit von ca. 200 fs ermittelt. Diese ist deutlich kürzer als die gefundenen Auger-Rekombinationszeiten, die sich zwischen 1,5 ps und 5 ps bewegen. In einer Studie an CdSe/CdS Kern/Schale Partikeln wurde der Einfluss einer passivierenden anorganischen Schale auf den ET-Prozess untersucht. Bei der gewählten Heterostruktur handelte es sich um Typ I Kern/Schale Partikel, in denen sowohl Elektron und Loch hauptsächlich im Kern eingeschlossen sind. Es wurde ein exponentieller Abfall der ET-Rate mit wachsender Schalendicke beobachtet, weshalb davon auszugehen ist, dass die CdS-Schale als elektronische Barriere wirkt, durch die das photoangeregte Elektron tunneln muss, um mit dem Akzeptor reagieren zu können. Schließlich wurde der Einfluss des Elektronentransfers im ET-System auf die Entstehung von Phononen untersucht. Sowohl in freien Quantenpunkten als auch im gekoppelten System konnte das LO sowie das LA Phonon beobachtet werden, wobei das LA Phonon im gekoppelten System stark unterdrückt ist. Im Falle der freien Quantenpunkte sind die beobachteten Oszillationen eine Folge der Frequenzmodulation der Absorption des angeregten Zustandes. Mit Hilfe des Huang-Rhys-Parameters ließ sich ermitteln, wie stark in freien Quantenpunkten das LO Phonon an das Exziton gekoppelt ist. Der berechnete Huang-Rhys-Parameter betrug 0,012. Im Falle des gekoppelten Systems weist die spektrale Signatur der kohärenten Oszillationen darauf hin, dass diese durch die Frequenzmodulation der linearen QP-Absorption verursacht werden. Im Falle des gekoppelten Systems sind die beobachteten Phononen nicht an das Exziton sondern an die ET-Reaktion gekoppelt, d. h. der ET selbst induziert Gitterschwingungen im Reaktionsprodukt. Der berechnete Huang-Rhys-Parameter, der die ET-Phonon-Kopplung beschreibt, berechnete sich ebenfalls zu 0,012, was verdeutlicht, dass die ET-Phonon-Kopplung ähnlich stark wie die Exziton-Phonon-Kopplung ist. Mit Hilfe der spektralen Abhängigkeit der Oszillationen in freien Quantenpunkten und im gekoppelten System ließ sich eine Biexziton-Bindungsenergie von 35 meV berechnen.

Actomyosin-based Self-organization of cell internalization during C. elegans gastrulation (2012)

Christian Pohl Michael Tiongson Julia L. Moore Anthony Santella Zhirong Bao

Background: Gastrulation is a key transition in embryogenesis; it requires self-organized cellular coordination, which has to be both robust to allow efficient development and plastic to provide adaptability. Despite the conservation of gastrulation as a key event in Metazoan embryogenesis, the morphogenetic mechanisms of self-organization (how global order or coordination can arise from local interactions) are poorly understood. Results: We report a modular structure of cell internalization in Caenorhabditis elegans gastrulation that reveals mechanisms of self-organization. Cells that internalize during gastrulation show apical contractile flows, which are correlated with centripetal extensions from surrounding cells. These extensions converge to seal over the internalizing cells in the form of rosettes. This process represents a distinct mode of monolayer remodeling, with gradual extrusion of the internalizing cells and simultaneous tissue closure without an actin purse-string. We further report that this self-organizing module can adapt to severe topological alterations, providing evidence of scalability and plasticity of actomyosin-based patterning. Finally, we show that globally, the surface cell layer undergoes coplanar division to thin out and spread over the internalizing mass, which resembles epiboly. Conclusions: The combination of coplanar division-based spreading and recurrent local modules for piecemeal internalization constitutes a system-level solution of gradual volume rearrangement under spatial constraint. Our results suggest that the mode of C. elegans gastrulation can be unified with the general notions of monolayer remodeling and with distinct cellular mechanisms of actomyosin-based morphogenesis.

Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins (2013)

Lei Kai Volker Dötsch Ralf Kaldenhoff Frank Bernhard

An approach for designing individual expression environments that reduce or prevent protein aggregation and precipitation is described. Inefficient folding of difficult proteins in unfavorable translation environments can cause significant losses of overexpressed proteins as precipitates or inclusion bodies. A number of chemical chaperones including alcohols, polyols, polyions or polymers are known to have positive effects on protein stability. However, conventional expression approaches can use such stabilizing agents only post-translationally during protein extraction and purification. Proteins that already precipitate inside of the producer cells cannot be addressed. The open nature of cell-free protein expression systems offers the option to include single chemicals or cocktails of stabilizing compounds already into the expression environment. We report an approach for systematic screening of stabilizers in order to improve the solubility and quality of overexpressed proteins co-translationally. A comprehensive list of representative protein stabilizers from the major groups of naturally occurring chemical chaperones has been analyzed and their concentration ranges tolerated by cell-free expression systems have been determined. As a proof of concept, we have applied the method to improve the yield of proteins showing instability and partial precipitation during cell-free synthesis. Stabilizers that co-translationally improve the solubility and functional folding of human glucosamine 6-phosphate N-acetyltransferase have been identified and cumulative effects of stabilizers have been studied.

IAP-IAP complexes required for apoptosis resistance of C. trachomatis-infected cells (2006)

Krishnaraj Rajalingam Manu Sharma Nicole Paland Robert Hurwitz Oliver Thieck Monique Oswald Nikolaus Machuy Thomas Rudel

Host cells infected with obligate intracellular bacteria Chlamydia trachomatis are profoundly resistant to diverse apoptotic stimuli. The molecular mechanisms underlying the block in apoptotic signaling of infected cells is not well understood. Here we investigated the molecular mechanism by which apoptosis induced via the tumor necrosis factor (TNF) receptor is prevented in infected epithelial cells. Infection with C. trachomatis leads to the up-regulation of cellular inhibitor of apoptosis (cIAP)-2, and interfering with cIAP-2 up-regulation sensitized infected cells for TNF-induced apoptosis. Interestingly, besides cIAP-2, cIAP-1 and X-linked IAP, although not differentially regulated by infection, are required to maintain apoptosis resistance in infected cells. We detected that IAPs are constitutively organized in heteromeric complexes and small interfering RNA-mediated silencing of one of these IAPs affects the stability of another IAP. In particular, the stability of cIAP-2 is modulated by the presence of X-linked IAP and their interaction is stabilized in infected cells. Our observations suggest that IAPs are functional and stable as heteromers, a thus far undiscovered mechanism of IAP regulation and its role in modulation of apoptosis.

Role for caspase-2 during pore-forming toxin-mediated apoptosis (2012)

Gergely Imre Krishnaraj Rajalingam

GCC2011 – 25 years of computational chemistry meetings (2012)

Frank Oellien Uli Fechner Thomas Engel

Refine

Author

Year of publication

Document Type

Language

Has Fulltext

Keywords

Institute

876 search hits