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There is a renewed interest in pseudoreceptor models which enable computational chemists to bridge the gap of ligand- and receptor-based drug design. We developed a pseudoreceptor model for the histamine H4 receptor (H4R) based on five potent antagonists representing different chemotypes. Here we present the selection of potential ligand binding pockets that occur during molecular dynamics (MD) simulations of a homology-based receptor model. We present a method for prioritizing receptor models according to their match with the consensus ligand-binding mode represented by the pseudoreceptor. In this way, ligand information can be transferred to receptor-based modelling. We use Geometric Hashing to match three-dimensional points in Cartesion space. This allows for the rapid translation- and rotation-free comparison of atom coordinates, which also permits partial matching. The only prerequisite is a hash table, which uses distance triplets as hash keys. Each time a distance triplet occurring in the candidate point set which corresponds to an existing key, the match is represented by a vote of the respective key. Finally, the global match of both point sets can be easily extracted by selection of voted distance triplets. The results revealed a preferred ligand-binding pocket in H4R, which would not have been identified using an unrefined homology model of the protein. The key idea was to rely on ligand information by pseudoreceptor modelling.
We developed the Pharmacophore Alignment Search Tool (PhAST), a text-based technique for rapid hit and lead structure searching in large compound databases. For each molecule, a two-dimensional graph of potential pharmacophoric points (PPPs) is created, which has an identical topology as the original molecule with implicit hydrogen atoms. Each vertex is coloured by a symbol representing the corresponding PPP. The vertices of the graph are canonically labelled. The symbols associated with the vertices are combined to a so-called PhAST-Sequence beginning with the vertex with the lowest canonical label. Due to the canonical labelling the created PhAST-Sequence is characteristic for each molecule. For similarity assessment, PhAST-Sequences are compared using the sequence identity in their global pairwise alignment. The alignment score lies between 0 (no similarity) and 1 (identical PhAST-Sequences). In order to use global pairwise sequence alignment, a score matrix for pharmacophoric symbols was developed and gap penalties were optimized. PhAST performed comparably and sometimes superior to other similarity search tools (CATS2D, MOE pharmacophore quadruples) in retrospective virtual screenings using the COBRA collection of drugs and lead structures. Most importantly, the PhAST alignment technique allows for the computation of significance estimates that help prioritize a virtual hit list.
The representation of small molecules as molecular graphs is a common technique in various fields of cheminformatics. This approach employs abstract descriptions of topology and properties for rapid analyses and comparison. Receptor-based methods in contrast mostly depend on more complex representations impeding simplified analysis and limiting the possibilities of property assignment. In this study we demonstrate that ligand-based methods can be applied to receptor-derived binding site analysis. We introduce the new method PocketGraph that translates representations of binding site volumes into linear graphs and enables the application of graph-based methods to the world of protein pockets. The method uses the PocketPicker algorithm for characterization of binding site volumes and employs a Growing Neural Gas procedure to derive graph representations of pocket topologies. Self-organizing map (SOM) projections revealed a limited number of pocket topologies. We argue that there is only a small set of pocket shapes realized in the known ligand-receptor complexes.
SIVsmmPBj-derived lentiviral vectors are capable of efficient primary human monocyte transduction, a capacity which is linked to the viral accessory protein Vpx. To enable novel gene therapy approaches targeting monocytes, in this thesis it was aimed to generate enhanced lentiviral vectors that meet the required standards for clinical applications with respect to gene transfer efficiency and safety. The vectors were tested for their suitability in a relevant therapeutic gene transfer approach. At first, it was investigated whether vectors derived from another Vpx-carrying lentivirus reveal the same capacity for monocyte transduction as SIVsmmPBj-derived vectors. A transduction experiment using HIV-2-derived vectors in comparison to PBj-derived vectors revealed a comparable transduction capacity, thus disproving the assumed uniqueness of the PBj vectors. The further generation and analysis of expression constructs for the vpx genes of HIV-2 and SIVmac demonstrated a similar functionality in monocyte transduction as the Vpx of PBj. As VpxPBj, both Vpx proteins facilitated monocyte transduction of a vpx-deficient PBj-derived vector system. For the generation of enhanced SIVsmmPBj and HIV-2 vector systems, only the transfer vectors were optimized, since the packaging vectors available already meet current standards. At first, several modifications were introduced into an available preliminary PBj-derived transfer vector by conventional cloning. The modifications included insertions of cPPT/CTS and WPRE as well as the deletions of the remaining pol sequence, the second exons of tat end rev, and the U3-region within the 3’LTR to generate a SIN vector. Thus, beside safety enhancement, the vector titers were also increased from 9.1x105 TU/ml achieved after concentration with the initial transfer vector up to 1.1x107 TU/ml with the final transfer vector. The PBj vector retained its capability of monocyte transduction when supplemented with Vpx. This conventional method of vector enhancement is time-consuming and may result in only sub-optimal vectors, since it depends on the presence of restriction sites which may not allow deletion of all needless sequences. Moreover, mutations may accumulate during the high number of cloning and amplification steps. Therefore, a new and easier method for lentiviral transfer vector generation was conceived. Three essential segments of the viral genome (5‘ LTR, RRE, ΔU3-3’ LTR) are amplified on the template of the lentiviral wild-type genome and fused by Fusion-PCR. Further necessary elements namely the cPPT/CTS-element, MCS, and PPT are included into the resulting vector by extension of the nucleotide primers used for the PCRs. The amplified and fused vector-scaffold can easily be integrated into a plasmid backbone, followed by insertion of the expression cassette of choice. By applying this approach, two novel lentiviral transfer vectors, based on the non-human SIVsmmPBj and the human HIV-2, were derived. Vector titers achieved for PBj and HIV-2 vectors supplemented with Vpx reached up to 4.0x108 TU/ml and 5.4x108 TU/ml, respectively. The capacity for monocyte transduction was maintained. Thus, safe and efficient, state of the art HIV-2- and PBj-derived vector systems are now available for future gene therapy strategies. Finally, the new vectors were used to set up an approach for gene correction of gp91phox-deficient monocytes for the treatment of X-linked chronic granulomatous disease (xCGD). The administration of autologous, gene-corrected monocytes to counteract systemic and acute infections could lead to a decreased infection load, dissolve granulomas and therefore improve the survival rate of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) which is the current treatment of choice for this disease. First, methods for analysis of gp91phox function were established. Next, they were employed to demonstrate the capacity of monocytes, obtained from healthy humans or mice, for phagocytosis, oxidative burst, and Staphylococcus aureus killing. The in vivo half-life of murine monocytes in the bloodstream and their distribution to specific tissues was determined. Lastly, HIV-1 vectors were used to transfer the gp91phox gene into monocytes from gp91phox-deficient mice. This resulted in the successful restoration of the oxidative burst ability in the cells. In summary, the general suitability of the new vectors for treatment of CGD by monocyte transduction was demonstrated. The results of the mouse experiments provide the foundation for future challenge experiments to evaluate the capability of gene-corrected monocytes to kill off microbes in vivo.
Channelrhodopsine sind blaulichtsensitive, Retinal-bindende Proteine aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Channelrhodopsin 2 (ChR2) wurde als heptahelikaler, kationenselektiver Ionenkanal charakterisiert (Nagel et al., 2003). Wie die zur selben Proteinfamilie gehörende Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) wird ChR2 durch Licht aktiviert; allerdings wird hierbei ein passiver Strom ausgelöst, bei dem Kationen entsprechend ihres elektrochemischen Gradienten fließen. Aufgrund dieser Eigenschaft eignet sich ChR2 zur lichtinduzierten Depolarisation von Zellen und zur Auslösung von Aktionspotentialen in Neuronen, über deren Membran ein Konzentrationsgradient von Kationen anliegt (Boyden et al., 2005). Die Stimulation elektrischer Aktivität von ChR2-exprimierenden Neuronen im Hirngewebe von Mäusen, die ChR2 transgen exprimieren, kann beispielsweise genutzt werden, um die Konnektivität von Neuronen und Hirnbereichen zu untersuchen (z.B. Wang et al., 2007). Für diese und weitere Anwendungen war es interessant, ChR2 zelltyp- oder regionenspezifisch in Mäusen zu exprimieren. Zu diesem Zweck sollte ChR2/eGFP bicistronisch oder ChR2-YFP als Fusionsprotein unter einem ubiquitären Promotor exprimiert werden; die Expression sollte aber durch ein Stop-Element unterbunden werden, das von loxP-sites flankiert ist (unaktiviertes Transgen). Das Enzym Cre- Rekombinase entfernt durch Rekombination das Stop-Element an diesen Erkennungssequenzen, wodurch die ChR2-Expression ermöglicht werden sollte (aktiviertes Transgen). Die Cre-Rekombinase kann dabei sowohl viral als auch transgen unter zelltyp- und regionenspezifischen Promotoren exprimiert werden und damit die regionale Spezifität und den Zeitpunkt der ChR2-Expression bestimmen. Es wurden drei Mauslinien über Pronukleus-Injektionen erhalten, die den Reporter β-Galactosidase des unaktivierten Transgens exprimierten. Die Verpaarung von Mäusen dieser Linien mit Cre-Rekombinase-exprimierenden Mauslinien führte aber nur zu einer ineffizienten Aktivierung des Transgens, so dass ChR2-Expression einzig mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte. Nach viraler Expression der Cre-Rekombinase im Hippokampus konnte eine Aktivierung des ChR2-Transgens auch mittels Immunfluoreszenz gezeigt werden. Mangels GFP-Fluoreszenz waren die transgenen Linien aber nicht für gezielte elektrophysiologische Ableitungen verwendbar. In einem zweiten Ansatz wurden transgene Mäuse über embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert. Bei diesem Ansatz wird eine geringere Kopienzahl des Transgens ins Genom integriert. In den ES-Zellen konnte durch transiente Cre-Rekombinase-Expression gezeigt werden, dass das Transgen effizient aktiviert werden konnte. Aus mehreren ES-Zell-Klonen wurden chimäre Mäuse erhalten, die zum jetzigen Zeitpunkt auf Keimbahntransmission getestet werden. Wie ChR2 einen Kationenkanal bildet und welche Transmembrandomänen und Aminosäuren daran beteiligt sind, ist unbekannt. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Positionen E90, E97 und E101, welche in der zweiten Transmembranhelix untereinander zu liegen scheinen, Teil einer Ionenpore sein könnten. Um den Einfluss dieser Aminosäuren auf die Kationenleitung und/ oder – selektivität zu untersuchen, wurden diese Positionen substituiert und die resultierenden ChR2-Mutantenproteine in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch analysiert. Um Na+- bzw. Protonen-mediierte Ströme unterscheiden zu können, wurden Na+-haltige und Na+-freie Puffer verschiedener pH-Werte verwendet. Lichtinduzierte Ströme von ChR2E97A, ChR2E97Q, ChR2E97K und ChR2E101K waren im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert, ausschließlich bei pH 4 zu detektieren und wohl hauptsächlich durch Protonen getragen. Die isofunktionale, aber ladungsneutrale Mutation ChR2E90Q zeigte nur geringe Unterschiede zum Wildtyp. Alaninsubstitution (E90A) als auch Ladungsinversion (E90K) führte zu starken Veränderungen des ChR2-Stroms im Vergleich zum Wildtyp. ChR2E90A zeigte im Vergleich zum Wildtyp reduzierte Protonenströme sowie einen erhöhten Natriumstrom, der durch Protonen inhibierbar war. Die Ladungsinversion ChR2E90K führte zu allgemein stark verminderten Leitfähigkeiten, lediglich bei pH 4 konnten noch Ströme gemessen werden. Die Ergebnisse sind der erste Hinweis auf eine Beteiligung von Glutamatresten an der Ionenleitfähigkeit in der Transmembranhelix 2 von ChR2.
Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielt der Major Histocompatibility Complex (MHC)-Klasse I-Weg der Antigenpräsentation eine essenzielle Rolle bei der Erkennung und Zerstörung Virus-infizierter Zellen. Ein grundlegender Schritt innerhalb dieses Prozesses ist die Translokation endogener Peptide durch den transporter associated with antigen processing (TAP) in das ER-Lumen. Der TAP-Transporter ist zusammen mit verschiedenen Chaperonen und weiteren Faktoren in einem Peptidbeladungskomplex (PLC) assoziiert. Insbesondere Herpesviren, die durch eine lebenslange Persistenz im Wirt und wiederkehrende Reaktivierung unter Stresssituationen gekennzeichnet sind, interferieren direkt mit dem PLC und dem TAP-Transporter. Das varicellovirale Typ-I-Membranprotein UL49.5 inhibiert den TAP-Komplex, wobei das Protein des Rinderherpesvirus (Bovines Herpesvirus 1, BHV-1) zusätzlich die proteasomale Degradation verschiedener Komponenten des PLCs einleitet. Dieser Mechanismus wird durch die C-terminale Domäne des UL49.5-Proteins vermittelt und ist von keinem anderen Virusprotein bekannt. Welche Aminosäuren des Virusproteins jedoch für diese Inhibition und Degradation essenziell sind, wurde bisher nicht aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die Funktionsweise des BHV-1 UL49.5-Proteins zu verstehen und insbesondere zu analysieren, welche Bereiche des Proteins für die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes verantwortlich sind. Das UL49.5-Protein wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgreich in Insektenzellen und in HeLa-Zellen exprimiert. Mittels Coimmunpräzipitation (Co-IP) wurde daraufhin die Bindung verschiedener UL49.5-Varianten an den TAP-Komplex analysiert. Unterstützt wurden diese Daten durch einen in vivo Interaktionsscreen (BiFC) und in vitro translatiertes UL49.5. Hierbei stellte sich heraus, dass das UL49.5-Protein in Abwesenheit sämtlicher Komponenten des Immunsystems an beide Untereinheiten des TAP-Transporters bindet. Die Bindung erfolgt sowohl an vollständige TAP-Untereinheiten als auch an den sogenannten coreTAP-Komplex, der nur die inneren sechs Transmembranhelices besitzt. Weiterhin wurden systematisch verkürzte UL49.5-Varianten generiert, um wichtige Reste für TAP-Inhibition und proteasomale Degradation zu identifizieren. Interessanterweise sind weder die N-terminale noch die C-terminale Domäne von UL49.5 für die Bindung an den TAP-Komplex zwingend notwendig. Die Bindung an den TAP-Transporter wird demnach über die Transmembrandomäne von UL49.5 vermittelt. Mit Hilfe von Peptidtransport-Analysen wurde die inhibitorische Aktivität verschiedener UL49.5-Mutanten eingehend untersucht. Zusätzlich wurde eine Untersuchung der MHC I-Oberflächenexpression in transient transfizierten HeLa-Zellen etabliert. In diesen Zellen wurde nach Sortierung eine drastisch reduzierte TAP-Konzentration nachgewiesen, die auf proteasomale Degradation des TAP-Komplexes zurückzuführen war. Die Untersuchung von C-terminal verkürzten UL49.5-Mutanten zeigte, dass die letzten zwei C-terminalen Aminosäuren essenziell für die Induktion der TAP-Degradation sind. Die C-terminale Domäne von UL49.5 konnte jedoch, nach Übertragung auf andere Proteine, keine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleiten. Demnach ist ein weiterer Bereich des Proteins für diesen Prozess zwingend notwendig. Erstaunlicherweise waren auch N-terminal verkürzte UL49.5-Proteine deutlich in ihrer inhibitorischen Funktion beeinträchtigt. Bereits nach der Deletion von 10 N-terminalen Aminosäuren war das Protein nicht mehr in der Lage, eine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einzuleiten. Demnach spielt auch die ER-luminale Domäne von UL49.5 eine wichtige Rolle bei der UL49.5-induzierten TAP-Degradation. Somit wurde ein bisher noch nicht beschriebener neuartiger Inhibitionsmechanismus für das BHV-1 UL49.5-Protein entdeckt. Nach Bindung von UL49.5 über die Transmembrandomäne an beide Untereinheiten des TAP-Transporters scheint die ER-luminale Domäne von UL49.5 ein Signal über die ER-Membran an die zytoplasmatische Domäne zu übertragen, die dann die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleitet. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals gezeigt werden, dass additive Effekte eines sehr kleinen Virusproteins auf zwei unterschiedlichen Seiten der ER-Membran zu einer proteasomalen Degradation eines sehr großen Membran-Komplexes führen.
The CUG-binding protein 1 (CUG-BP1) is a member of the CUG-BP1 and ETR-like factors (CELF) family or the Bruno-like family and is involved in the control of splicing, translation and mRNA degradation. Several target RNA sequences of CUG-BP1 have been predicted, such as the CUG triplet repeat, the GU-rich sequences and the AU-rich element of nuclear pre-mRNAs and/or cytoplasmic mRNA. CUG-BP1 has three RNA-recognition motifs (RRMs), among which the third RRM (RRM3) can bind to the target RNAs on its own. In this study, we solved the solution structure of the CUG-BP1 RRM3 by hetero-nuclear NMR spectroscopy. The CUG-BP1 RRM3 exhibited a noncanonical RRM fold, with the four-stranded b-sheet surface tightly associated with the N-terminal extension. Furthermore, we determined the solution structure of the CUG-BP1 RRM3 in the complex with (UG)3 RNA, and discovered that the UGU trinucleotide is specifically recognized through extensive stacking interactions and hydrogen bonds within the pocket formed by the b-sheet surface and the N-terminal extension. This study revealed the unique mechanism that enables the CUG-BP1 RRM3 to discriminate the short RNA segment from other sequences, thus providing the molecular basis for the comprehension of the role of the RRM3s in the CELF/Bruno-like family.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein CtaG aus Paracoccus denitrificans eingehend charakterisiert. Es wurde überprüft, ob dieses 21 kDa große Membranprotein als Kupferchaperon und Assemblierungsfaktor für die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase, das heißt für die Biogenese des CuB-Zentrums, in Frage kommt. Eine bioinformatische Analyse zeigte zunächst, dass CtaG, ein Homolog des eukaryotischen Proteins Cox11, zu den am stärksten konservierten Assemblierungsfaktoren der Cytochrom c Oxidase gehört. Interessanterweise sind diese Proteine alle an der Biogenese der redoxaktiven Metallzentren beteiligt, und nur sie sind auch in Paracoccus denitrificans konserviert. Somit stellt Paracoccus ein ideales Modellsystem dar, um die essentiellen Schritte der Biogenese der Cytochrom c Oxidase zu untersuchen. Ein lösliches Fragment von CtaG (CtaGLF) wurde heterolog in E. coli exprimiert und mit Hilfe eines spaltbaren His6-tags aufgereinigt. Es wurde ein Protokoll entwickelt, mit dessen Hilfe die Aggregation des löslichen Fragments minimiert und das Protein in hochreiner, aggregatfreier Form isoliert werden kann. Rekonstitutionsversuche zeigten, dass CtaGLF ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist. Nach der heterologen Expression in E. coli ist CtaGLF kofaktorfrei. Ein Protokoll zur in vitro Rekonstitution mit Kupferionen wurde entwickelt, mit welchem ein stöchiometrisches Kupfer/Protein-Verhältnis erreicht wird. Gelfiltrations- und ICP-MS-Analysen zeigten, dass CtaGLF Kupferionen ausschließlich als Dimer bindet. Rekonstitutionen bei denen Cu(I), Cu(II), Co(II), Fe(II), Mn(II), Mg(II) und Ni(II) sowohl einzeln als auch simultan angeboten wurden, führten zwar zu wenig reproduzierbaren absoluten Stöchiometrien, bestätigten aber, dass CtaGLF bevorzugt Cu(I) bindet. Mutagenesestudien bewiesen einerseits, dass drei Cysteinreste maßgeblich für die Kupferbindung verantwortlich sind und deuteten andererseits darauf hin, dass zwei identische, punktsymmetrische Bindungsstellen des CtaGLF-Dimers die Kupferionen koordinieren. Mit Hilfe einer Multiseq-Analyse wurden zunächst hochkonservierte Oberflächenreste von CtaG identifiziert. Eine Auswahl dieser Aminosäuren wurde per gerichteter Mutagenese ersetzt und der Effekt dieser Mutationen auf Stöchiometrie, Affinität und Dimerisierung von CtaGLF wurde untersucht. Die Affinitäten wurden dabei mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten mit dem Cu(I)-spezifischen Chelator BCA analysiert. Insgesamt vier mögliche Szenarien für die Kupferbindung von CtaG wurden postuliert und anhand der Datenlage diskutiert. Das Szenario III, welches die Datenlage am besten zu erklären vermag, sieht eine trigonale Koordination der Kupferionen vor, an welcher die Cysteine des hochkonservierten CFCF-Motivs einer Polypeptidkette ein gemeinsames Koordinationsfeld mit dem nahe der Transmembranhelix gelegenen Cystein 38 der jeweils anderen Polypeptidkette bilden. Mit Hilfe von UV/Vis-spektroskopischen Messungen wurde gezeigt, dass die Bindung von Kupferionen an CtaGLF zu einer Absorption bei 358 nm führt. Diese kann mit einem Extinktionskoeffizienten von E delta 358 nm = 936 M-1cm-1 zur Beobachtung des Kupfertransfers von CtaGLF auf einen Akzeptor verwendet werden. Um eine Beteiligung von CtaG bei der Insertion des CuB-Ions in die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase (UE I) zu beweisen, wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt und empirisch untersucht: Die erste Hypothese geht von einer posttranslationalen Kupferinsertion aus. Die UE I wird laut dieser Hypothese zunächst vollständig exprimiert und in die Membran inseriert, bevor das Kupferion über einen Kanal in das 13 Å unterhalb der Membranoberfläche gelegene aktive Zentrum der Oxidase inseriert wird. Drei Ansätze wurden zur empirischen Überprüfung dieser Hypothese verfolgt: Erstens wurde ein in vitro Transferassay etabliert, bei dem heterolog exprimierte, kofaktorfreie UE I als Akzeptor für Kupferionen von CtaGLF diente. Zweitens wurden bioinformatische Analysen durchgeführt um potentielle Interaktionsflächen zwischen CtaG und UE I zu identifizieren. Und drittens wurde mit Hilfe koaffinitätschromatographischer Versuche eine Interaktion zwischen CtaG und kofaktorfreier UE I untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sprechen allesamt gegen eine posttranslationale CtaG-vermittelte Insertion von Kupferionen in die UE I der Cytochrom c Oxidase. Die zweite Hypothese geht davon aus, dass die prosthetischen Häm- und Kupfergruppen bereits vor der vollständigen Membraninsertion, das heißt kotranslational auf die UE I übertragen werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden ebenfalls mehrere Ansätze verfolgt: Erstens wurde die UE I in Gegenwart und Abwesenheit von CtaG heterolog in E. coli exprimiert und anschließend aufgereinigt. In Abwesenheit weiterer Assemblierungsfaktoren ist CtaG in diesem System nicht dazu in der Lage den Kupfergehalt der UE I zu erhöhen. Zweitens wurde mit Hilfe von Blau-Nativ Gelen und Crosslinking-Versuchen im nativen Wirt Paracoccus denitrificans nach einer Wechselwirkung zwischen CtaG und UE I gesucht. Insbesondere die Ergebnisse der Crosslinking-Versuche deuten auf einen Assemblierungskomplex hin, der sowohl CtaG als auch die UE I der Cytochrom c Oxidase enthält. In einem dritten Ansatz wurde ein zellfreies Expressionssystem etabliert, welches direkten Zugang zu naszierenden Ketten der UE I ermöglicht. Dieses System erscheint vielversprechend und dient derzeit als Basis für weitere Biogenesestudien. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass CtaG ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist, das im Zuge der Kupferbindung dimerisiert und in Paraoccus denitrificans in einem hochmolekularen Komplex gemeinsam mit UE I vorliegt. Die gegenwärtige Datenlage spricht dafür, dass CtaG als Kupferchaperon an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt ist und das CuB-Ion in einem kotranslationalen Mechanismus in die UE I der Cytochrom c Oxidase inseriert.
Die Aufklärung der dreidimensionalen Helix-Struktur der DNA, des Trägermoleküls der genetischen Information aller Lebewesen, durch Watson und Crick im Jahre 1953 ermöglichte eine ganz neue Sichtweise auf ihre Eigenschaften und viele zelluläre Prozesse. Von besonderem Interesse sind hier u.a. Mechanismen, bei denen die DNA an den Phosphaten nucleophil substituiert wird, wie dies beispielsweise bei der Rekombination oder der Transkription geschieht. Dies ist daher interessant, weil sich die DNA gegenüber nucleophilen Angriffen in verschiedenen Experimenten als überaus stabil und reaktionsträge gezeigt hat. Spezialisierte Enzyme wie die Staphylokokkennuklease oder Restriktionsendonukleasen nutzen u.a. Metall-Ionen, um Phosphoryltransfer-Reaktionen zu katalysieren und in eine akzeptable Zeitskala zu verschieben. Die Topoisomerase vom Typ I zeigt eindrucksvoll, dass Katalyse solcher Reaktionen auch ohne Metall-Ion möglich ist, womit auch gleichzeitig die Quelle für eine potentielle oxidative Schädigung der DNA entfernt ist. Leider ist die Palette der natürlich vorkommenden Enzyme begrenzt. Die Erforschung und Entwicklung von künstlichen Nukleasen ermöglicht daher potentiell den zukünftigen Einsatz neuer, maßgeschneiderter Werkzeuge für die Biochemie und die Biotechnologie, sowie langfristig die Bereitstellung neuartiger Chemotherapeutika. Vom aktiven Zentrum der Staphylokokkennuklease abgeleitete Moleküle auf Bisguanidinium-Naphthol-Basis bzw. deren Derivate zeigten in der Vergangenheit deutliche Aktivität als metallfreie, unspezifische Spalter von Plasmid-DNA. Die vorliegende Arbeit beschreibt die weitere Entwicklung und Charakterisierung neuer unspezifischer und potentiell sequenzselektiver Bisguanidinium-Naphthol-Derivate. Hierbei wurde eine neue, zuverlässige Synthesestrategie für Bisguanidinium-Naphthole und parallel dazu ein neuer und flexibler Weg der Flüssigphasen-Synthese von DNA-bindenden Polyamiden ausgearbeitet, um daraus DNA-bindende Konjugate herzustellen. Vier unspezifische Moleküle (45, 94, 95, 97) und zwei Konjugate (46 und 140) wurden dann bei physiologischen Bedingungen auf ihre Spaltaktivität gegenüber Plasmid-DNA und linearer Duplex-DNA untersucht. Bei allen oben genannten Verbindungen konnte - verglichen mit der Stamm-Verbindung 36 aus Vorgängerarbeiten - eine erhöhte Aktivität gegenüber Plasmid-DNA bestimmt werden, die im Falle der Konjugate zwischen 4000- und 8000-fach liegt. Zur weiteren Charakterisierung wurden Experimente in Anwesenheit von EDTA oder Mg2+, zur pH-Abhängigkeit und zur Kinetik der Spalt-Reaktion durchgeführt. Erste Testreihen zum Nachweis sequenzselektiver DNA-Spaltung lieferten kein abschließendes Ergebnis, gaben jedoch erste Hinweise auf Selektivität, welche zur Zeit näher untersucht und überprüft werden.
Jeder Mensch kämpft täglich erfolgreich mit Krankheitserregern, ohne dass er sich der komplexen molekularen Vorgänge dabei bewusst wäre. Wie in einem Hollywood-Streifen geht es rasant zur Sache. Ist das Immunsystem angeschlagen oder trifft es auf starke Gegner, kann eine Infektion binnen weniger Tage außer Kontrolle geraten und lebensbedrohliche Reaktionen hervorrufen. Der menschliche Organismus benötigt eine effiziente Verteidigungsstrategie gegen die Eindringlinge und muss, ebenso wie der britische Geheimdienst im Bond-Film, in die Ausbildung geübter Agenten investieren, Agenten mit Doppel-Null-Status. Agenten wie James Bond.