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Das onkogene Transformationspotential durch die "Gatekeeper"-Mutation T315I in Philadelphia-Chromosom assoziierten BCR/ABL-Fusionsproteinen
(2010)
- Die Entwicklung Philadelphia Chromosom-positiver (Ph+) chronischer myeloischer und akuter lymphatischer Leukämie (CML und ALL) ist auf das Verschmelzen von ABL-und BCR-Gensequenzen zurückzuführen. Die Bildung dieses BCR/ABL-Fusionsprotein führt zu einer konstitutiv gesteigerten ABL-Tyrosinkinase-Aktivität mit der Folge einer Deregulierung vielfältiger intrazellulärer Signalwege und der Induktion des leukämischen Phänotyps. Eine zielgerichtete Inhibierung von BCR/ABL mit Hilfe von ABL-Kinase-Inhibitoren induziert Apoptose in BCR/ABL-transformierten Zellen und hat eine komplette hämatopoetische Remission in Ph+ Leukämie-Patienten in der chronischen Phase zur Folge. Eine große Zahl an Patienten mit fortgeschrittener Ph+ Leukämie erleidet allerdings einen Rückfall und entwickelt Resistenzen gegen die molekularen Therapeutika. Ein Hauptgrund für die Resistenzentwicklung sind Punktmutationen im Bereich der ABL-Tyrosinkinase. Die Punktmutation T315I ist als einzige Mutation gegen alle bisher entwickelten Medikamente resistent. Sie ist auf eine Punktmutation von Threonin zu Isoleucin an einer äußerst kritischen Stelle, der so genannten „Gatekeeper-Position“ zurückzuführen. Die T315I scheint nicht nur die Bindungsaffinität der Kinase- Inhibitoren zu verhindern, sondern erzeugt zusätzliche Eigenschaften, die das leukämogene Potential von BCR/ABL verstärken. Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit war es daher, den Einfluss der T315I auf das transformatorische Potential von BCR/ABL aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass die T315I sowohl bei p185BCR/ABL, als auch bei p210BCR/ABL zu einem gesteigerten und Faktor-unabhängigen Wachstum führt. Zudem wurde im Rahmen einer Struktur- Funktionsanalyse verdeutlicht, dass die T315I unabhängig von BCR-Sequenzen in der Lage ist, Faktor-unabhängiges Zellwachstum in 32D- und Ba/F3-Zellen, aber nicht klassisches Transformationspotential in Fibroblasten zu vermitteln. 106 Ebenfalls war Gegenstand der experimentellen Arbeiten die Untersuchung, ob die durch die T315I-vermittelte Resistenz gegenüber der Hemmung der Oligomerisierung durch kompetitive Peptide von der Präsenz von BCR-Funktionsdomänen abhängt, welche für die Aktivierung der Ras-Signalwege unerlässlich sind. Es konnte nachgewiesen werden, dass die T315I-Punktmutation nur dann Resistenz gegenüber der Hemmung der Oligomerisierung induziert, wenn BCR-Sequenzen als Ausgangspunkt für den Ras-Signalweg (Tyr 177), in den verwendeten Konstrukten vorhanden sind. Fehlen BCR-Sequenzen, so hemmen die kompetitiven Peptide auch T315I-positive BCR/ABL-Deletionsmutanten. Darüber hinaus wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, neue Lösungsansätze in der Grundlagenforschung aufzuzeigen, indem ein neuartiges Zellkultursystem mit drei BALL- Patienten-abgeleiteten Langzeitkulturen (PDLTCs) angewendet wurde. Die CMPDLTC trägt unmutiertes BCR/ABL, während die KÖ-PDLTC BCR/ABL-T315I positiv ist. Als dritte PDLTC stand die CR als BCR/ABL-negative Zellkultur zur Verfügung. Zum ersten Mal war es mit Hilfe dieses relevanten Zellmodells möglich, die inhibitorische Wirkung des Helix-2-Peptids in primären ALL-PDLTCs zu überprüfen. Es konnten die bisherigen Ergebnisse aus den murinen Zelllinien zur Wirkung der Hemmung der Oligomerisierung bestätigt werden, da auch in diesem Modell die Zellen mit T315I-BCR/ABL resistent gegenüber den kompetitiven Peptiden waren. Zusammenfassend lassen die Daten dieser wissenschaftlichen Arbeit die Schlussfolgerung zu, dass die Punktmutation T315I nicht zum Schwerpunkt in der Erforschung weiterer molekularer Therapeutika erklärt werden sollte. Vielmehr scheint es in naher Zukunft von äußerster Bedeutung zu sein, besonders die Kaskade der aberranten Signaltransduktionswegen mit dem Ausgangspunkt in wesentlichen BCRFunktionsdomänen zu inhibieren. Außerdem stellen die primären Patienten-abgeleiteten Langzeitkulturen eine Möglichkeit dar, die Wirkung neuer molekularer Therapeutika effektiv zu überprüfen und die Pathogenese von Ph+ Leukämien noch besser zu verstehen.
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Targeting the Oligomerization of BCR/ABL by Membrane Permeable Competitive Peptides Inhibits the Proliferation of Philadelphia Chromosome Positive Leukemic Cells
(2011)
- The BCR/ABL fusion protein is the hallmark of Philadelphia Chromosome positive (Ph+) leukemia. The constitutive activation of the ABL-kinase in BCR/ABL cells induces the leukemic phenotype. Targeted inhibition of BCR/ABL by small molecule inhibitors reverses the transformation potential of BCR/ABL. Recently, we definitively proved that targeting the tetramerization of BCR/ABL mediated by the N-terminal coiled-coil domain (CC) using competitive peptides, representing the helix-2 of the CC, represents a valid therapeutic approach for treating Ph+ leukemia. To further develop competitive peptides for targeting BCR/ABL, we created a membrane permeable helix-2 peptide (MPH-2) by fusing the helix-2 peptide with a peptide transduction tag. In this study, we report that the MPH-2: (i) interacted with BCR/ABL in vivo; (ii) efficiently inhibited the autophosphorylation of BCR/ABL; (iii) suppressed the growth and viability of Ph+ leukemic cells; and (iv) was efficiently transduced into mononuclear cells (MNC) in an in vivo mouse model. This study provides the first evidence that an efficient peptide transduction system facilitates the employment of competitive peptides to target the oligomerization interface of BCR/ABL in vivo.
