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- Article (2)
- Doctoral Thesis (1)
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Production, characterization and determination of the real catalytic properties of the putative "succinate dehydrogenase" from Wolinella succinogenes
(2009)
- Both the genomes of the epsilonproteobacteria Wolinella succinogenes and Campylobacter jejuni contain operons (sdhABE) that encode for so far uncharacterized enzyme complexes annotated as ‘non-classical’ succinate:quinone reductases (SQRs). However, the role of such an enzyme ostensibly involved in aerobic respiration in an anaerobic organism such as W. succinogenes has hitherto been unknown. We have established the first genetic system for the manipulation and production of a member of the non-classical succinate:quinone oxidoreductase family. Biochemical characterization of the W. succinogenes enzyme reveals that the putative SQR is in fact a novel methylmenaquinol:fumarate reductase (MFR) with no detectable succinate oxidation activity, clearly indicative of its involvement in anaerobic metabolism. We demonstrate that the hydrophilic subunits of the MFR complex are, in contrast to all other previously characterized members of the superfamily, exported into the periplasm via the twin-arginine translocation (tat)-pathway. Furthermore we show that a single amino acid exchange (Ala86→His) in the flavoprotein of that enzyme complex is the only additional requirement for the covalent binding of the otherwise non-covalently bound FAD. Our results provide an explanation for the previously published puzzling observation that the C. jejuni sdhABE operon is upregulated in an oxygen-limited environment as compared with microaerophilic laboratory conditions.
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Interplay of ‘induced fit’ and preorganization in the ligand induced folding of the aptamer domain of the guanine binding riboswitch
(2007)
- Riboswitches are highly structured elements in the 50-untranslated regions (50-UTRs) of messenger RNA that control gene expression by specifically binding to small metabolite molecules. They consist of an aptamer domain responsible for ligand binding and an expression platform. Ligand binding in the aptamer domain leads to conformational changes in the expression platform that result in transcription termination or abolish ribosome binding. The guanine riboswitch binds with high-specificity to guanine and hypoxanthine and is among the smallest riboswitches described so far. The X-ray-structure of its aptamer domain in complex with guanine/ hypoxanthine reveals an intricate RNA-fold consisting of a three-helix junction stabilized by longrange base pairing interactions. We analyzed the conformational transitions of the aptamer domain induced by binding of hypoxanthine using highresolution NMR-spectroscopy in solution. We found that the long-range base pairing interactions are already present in the free RNA and preorganize its global fold. The ligand binding core region is lacking hydrogen bonding interactions and therefore likely to be unstructured in the absence of ligand. Mg2+-ions are not essential for ligand binding and do not change the structure of the RNA-ligand complex but stabilize the structure at elevated temperatures. We identified a mutant RNA where the long-range base pairing interactions are disrupted in the free form of the RNA but form upon ligand binding in an Mg2+-dependent fashion. The tertiary interaction motif is stable outside the riboswitch context.
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Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Komplexen mittels organischer Synthese und NMR-Spektroskopie
(2008)
- In der vorliegenden Arbeit wird anhand von drei ausgewählten Beispielen die Wechselwirkungen in Rezeptor-Ligand-Komplexen mittels organischer Synthese und NMR-Spektroskopie untersucht. Das erste Kapitel „p38α Kinase-Inhibitor-Wechselwirkung“ behandelt die lipophilen Wechselwirkung des DFG-out Inhibitors BIRB 796 mit der p38α-MAP-Kinase. Die Wechselwirkung wird maßgeblich durch das N-phenyl-1H-pyrazol-Fragment des Inhibitors bestimmt. Es wird vermutet, dass dabei der N-phenyl-1H-pyrazol-Torsionswinkel Ө eine dominierende Rolle für die inhibitorische Wirkung besitzt. Zur Überprüfung der Hypothese und mit dem Ziel, einen neuen Zugang zu potenteren Inhibitoren für die p38α-MAP-Kinase zu finden, wurde der aromatische Aryl-Teil des BIRB 798-Inhibitors durch die gezielte Synthese von BIRB 798-analoga analysiert und modifiziert. Bei diesen Modifikationen stand die sogenannte konformationelle Restriktion (rigid-analog-approach) des N-phenyl-1H-pyrazol-Torsionswinkels Ө im Vordergrund. Die konformationelle Restriktion des Inhibitors wurde durch den bioisosteren Austausch des Phenylrings gegen einen 2-Pyrimidylring verwirklicht. Die kristallographischen Untersuchung der BIRB 796-analoga im Festkörper und in Lösung mittels NMR-Spektroskopie untermauert die Korrelation zwischen dem Torsionswinkel Ө und der inhibitorische Aktivität. Die Daten beschreiben die Interaktion zwischen den BIRB 796-analoga und der p38α-MAPKinase als einen Prozess, der nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip verläuft. Die Untersuchung des N-phenyl-1H-pyrazol-Fragments ist nicht nur auf den BIRB 796-Inhibitor beschränkt, sondern kann auf weitere Wirkstoffe, mit diesem Baustein (Celebrex®, Acomplia® und RO3201195) angewendet werden. Das zweite Kapitel „Cofaktor-Membranprotein-Wechselwirkung“ untersucht die Interaktion zwischen den unterschiedlichen Chinon-Cofaktoren (Menachinon, Methylmenachinon und Ubichinon) mit den Membranproteinen der Atmungskette (bc1-Komplex und SQORs). Zur Beantwortung der biologischen und mechanistischen Fragestellungen wurden Modellsysteme für die natürlich vorkommenden 1,4-Chinonsysteme hergestellt. Im Vordergrund der Untersuchung stand die Elektrochemie der Chinon-analoga; d.h. die experimentelle Bestimmung des Redoxpotentials mittels zyklischer Voltammetrie, ihre theoretische Vorhersage und Faktoren, welche sie beeinflussen. Hierbei wird die Elektrochemie der Chinone, zusätzlich zu dem Substituentenmuster, durch die Wasserstoffbrückenbindung und die Konformation der Substituenten bestimmt. Die so erhaltenen Daten können dazu beitragen, Prozesse wie die ROS-Erzeugung besser zu verstehen und vorherzusagen. Der zweite Teil des zweiten Kapitel „Inhibitor-Membranprotein-Wechselwirkung“ setzt sich zum Ziel, neue und effektive Inhibitoren für die Membranproteine der Atmungskette zu entwickeln. Zwei der hierzu verwendeten Methoden der Leitstruktursuche, die Substratvarianten und die Übergangszustand-Analoga, werden vorgestellt. Die anschließende SAR-Studie zeigt, dass die Inhibition eine klare Korrelation zu der Hydrophobizität der Liganden aufweist. In dem letzten Kapitel „Metabolit-RNA-Wechselwirkung“ wird die Wechselwirkung zwischen Purinen und strukturierten RNA-Elementen beschrieben. Exemplarisch wird die Interaktion zwischen den Hypoxanthin und der strukturierten Aptamer-Domänen der natürlichen RNA (Guanin-Riboswitch) und der artifiziellen RNA (SELEX-Xanthin-Aptamer) untersucht. Auch hier steht die Synthese der Ligand-analoga im Vordergrund. Durch die gezielte Substitution von einzelnen funktionellen Gruppen des Liganden wird zum einen die Möglichkeit aufgezeigt, den Beitrag der einzelnen Gruppen zur Bindung zu untersuchen und zum anderen durch die Fixierung eines Tautomers des Liganden das bindungsaktive-Tautomer zu bestimmen. Dabei wird eine Syntheseroute vorgestellt, die es ermöglicht, für die NMR-spektroskopische Untersuchung die Ligand-analoga in vollständig bzw. selektiv 13C- und 15N-markierten-Form herzustellen. Durch NMR-Spektroskopie wurden die Bindungsmodi der Purin-analoga an der natürlichen- und artifiziellen RNA bestimmt. In den beiden Komplexen wird die Wechselwirkung durch intrermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen vermittelt. Das Wasserstoffbrückenbindungsmuster in Riboswitch-Hypoxanthin-Komplex unterscheidet sich signifikant von dem in SELEX-Aptamer-Hypoxanthin-Komplex. Das Hypoxanthin bindet in zwei unterschiedlichen Tautomeren an den RNA-Elementen. Die hier erhaltenen Strukturdaten können zur Auffinden von neuen antibakteriellen Wirkstoffen dienen.
