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RNA hat neben der Rolle als Informationsüberträger wichtige Aufgaben in regulatorischen Prozessen. Sie kann komplexe Strukturen ausbilden und ähnlich wie Proteine Liganden binden oder enzymatische Reaktionen katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollten zwei Beispiele von RNA-Liganden-Interaktionen untersucht werden. Im ersten Abschnitt wurde die Interaktion des TetR-bindenden Aptamers 12-1 mit dem Tetracyclin-Repressorprotein (TetR) biochemisch charakterisiert. Über Gelverzögerungs- experimente wurde gezeigt, dass das Aptamer 12-1K delta A TetR mit hoher Affinität und Spezifität bindet. Es wurde ein KD von 22 nM bestimmt. Die Bindung ist dabei ebenso stark wie die Bindung von TetR an die Operatorsequenz tetO. In Anwesenheit von Tetracyclin (Tc) nimmt die Affinität des TetR/Aptamer-Komplexes um das sechsfache ab. Des Weiteren konnten die Bindeepitope des Aptamers durch eine Analyse von verschiedenen TetR-Mutanten im DNA-Bindebereich bestimmt werden. Die Aminosäuren T27, N47 und K48 sind dabei essentiell für die RNA-Bindung und führen bei einem Austausch zum Verlust der RNA-Bindung. Der Bindebereich des Aptamers überlappt mit Aminosäureresten, die für die tetO-Bindung essentiell sind. Die Stöchiometrie der TetR/Aptamer-Bindung wurde durch LILBID-Messungen auf eine molare Verteilung von 2:1 festgelegt. Ein TetR-Dimer bindet dabei ein Aptamermolekül. Durch die umfassende biochemische Analyse der TetR/Aptamer-Bindung kann das Aptamer 12-1 nun als Expressionssonde für RNAs in bakteriellen Zellen genutzt werden. Des Weiteren kann das Aptamer als alternativer, artifizieller Transkriptionsregulator im tet on / tet off-System verwendet werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollten miRNAs identifiziert werden, die an der posttrans- kriptionellen Regulation der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der Cyclooxygenase-2 (COX-2) beteiligt sind. Mit bioinformatischen Vorhersageprogrammen wurden die 3’-UTR- Bereiche von 5-LO und COX-2 nach putativen Bindestellen abgesucht. Im Fall der 5-LO wurden durch eine zusätzliche Microarray-Expressionsanalyse miRNAs ausgewählt, welche in 5-LO positiven Zellen hoch exprimiert sind und Bindestellen im 3’-UTR aufweisen. Es konnten verschiedene miRNAs detektiert werden, jedoch keine Regulation der 5-LO Aktivität beobachtet werden. Für COX-2 wurde neben der Suche nach putativen miRNA-Bindestellen zudem die Stabilität des 3’-UTR untersucht. Mit Hilfe des auf Perl basierenden Programms SignificanceScoreAssignment (Florian Groher, Diplomarbeit 2011) konnte der 3’-UTR von COX-2 als generell destabilisierend analysiert werden. In Colonkarzinom- spezifischen HT-29-Zellen wurden miRNAs untersucht, welche Bindestellen im 3’-UTR von COX-2 aufweisen. In diesem Kontext sollte der Einfluss einer Interaktion von HT- 29-Zellen mit aktivierten Thrombozyten sowie daraus isolierten Bestandteilen wie Mikropartikeln und PDGF analysiert werden. MiR-16, miR-26b, miR-199a und miR- 199a* konnten in HT-29-Zellen nachgewiesen werden. Bei einer Stimulation von HT-29- Zellen mit PDGF-BB werden miR-16 und miR-26b konzentrationsabhängig stärker exprimiert, während die Expression von miR-199a und miR-199a* signifikant abnimmt. Eine direkte Regulation von COX-2 durch die untersuchten miRNAs konnte durch Überexpressions- und Reportergenanalysen jedoch nicht festgestellt werden. Die Analysen der 5-LO- und COX-2-Regulation durch miRNAs stellen Vorarbeiten dar. Die etablierten Methoden können nun für eine detaillierte Betrachtung weiterer miRNAs verwendet werden.
Dicer and Drosha are the major enzymes involved in microRNA processing. Using siRNA targeting Dicer and Drosha, thereby downregulating a substantial number of microRNAs in EC, we demonstrate a crucial role of both enzymes in angiogenic processes. Interestingly, Dicer inhibition exerts more profound effects on processes like migration and viability of EC in comparison to Drosha inhibition. Moreover, Dicer effects in vivo angiogenesis, a process which is unaffected by Drosha. This discrepancy might be partially due to the involvement of Dicer in other cellular processes like heterochromatin formation and to the fact that Dicer and Drosha target mainly different subsets of microRNAs. In addition, we identified miR-92a as a novel endogenous repressor of the angiogenic program in EC, which impairs their angiogenic functions in vitro and in vivo. Consistent with these data, blocking miR-92a by systemic infusion of antagomirs enhances neovascularization and functional recovery after ischemia in vivo. At first sight, the anti-angiogenic function of miR-92a in EC appears to contradict the previously identified anti-apoptotic and pro-angiogenic activities of the miR-17~92 cluster in tumor cells. However, this apparent discrepancy might be well rationalized by a predominant function of miR-18a and miR-19a in tumor cells, which are responsible for the tumorigenic and non-cell autonomous pro-angiogenic functions of the miR-17~92 cluster. Instead, miR-92a expression is specifically upregulated in ischemic tissues and appears to cell-autonomously repress the angiogenic potential of EC. Among the various targets and verified regulated genes identified by microarray, we confirmed the downregulation of Integrin a5 in vitro and in vivo. The relevance of this miR-92a target is evidenced by severe vascular defects in the absence of Integrin a5. In addition, endothelial miR-92a interferes with the expression pattern of genes controlling key EC functions at various levels, some of which, e.g. eNOS, might be secondarily affected by directly targeted genes. Obviously, our data do not formally exclude effects of antagomir-92a on perivascular and other cell types, but surely include effects on EC. Regardless of this, the capacity of miR-92a to target various downstream effectors might be an advantage of miRNA-based therapeutic strategies and may overcome the limited therapeutic capacity of single growth factor or single gene therapies in ischemic diseases, since the highly organized process of vessel growth, maturation and functional maintenance is well known to require the fine-tuned regulation of a set of genes.
Obwohl zahlreiche zelluläre Funktionen von RNAs in direktem Zusammenhang mit Proteinen stehen, wurde auch eine Vielzahl von, unter anderem regulatorischen, RNA-Motiven identifiziert, die ihre Funktion ohne eine initiale Beteiligung von Proteinen ausüben. Das detaillierte Verständnis der zu Grunde liegenden Regulationsmechanismen beinhaltet die Charakterisierung von beteiligten RNA-Architekturen und deren funktionaler Stabilitäten, von dynamischen Aspekten der RNA-Faltungsprozesse sowie die Korrelation dieser Charakteristika mit zellulären Funktionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden strukturelle, thermodynamische und kinetische Aspekte der Ligand-bindenden Guanin Riboswitch-RNA Aptamerdomäne des xpt-pbuX Operons aus B. subtilis und eines Cofaktor-abhängigen katalytischen RNA-Motivs, des 'Adenin-abhängigen Hairpin Ribozyms', untersucht. ...
RNA interference (RNAi) is triggered by recognition of double-stranded RNA (dsRNA), and elicits the silencing of gene(s) complementary to the dsRNA sequence. RNAi is thought to have emerged as a way of safeguarding the genome against mobile genetic elements and viral infection, thus maintaining genomic integrity. dsRNA is first processed into small interfering RNAs (siRNA) by the enzyme Dicer. siRNAs are ~21 to 25 -nt long, and contain a signature 5’ phosphate group and a two nucleotide long 3’ overhang (Bernstein et al., 2001). The siRNA is then loaded into the RNA-induced si-lencing complex (RISC), of which Argonaute is the primary catalytic component (Liu et al., 2004). Energetic asymmetry of the siRNA ends allows for its directional loading into RISC (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Argonaute cleaves the passen-ger strand of the siRNA, leaving the guide strand of the siRNA bound to RISC (Gregory et al., 2005; Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005). This single-stranded guide strand siRNA bound to Argonaute is able to recognize target mRNA in a sequence-specific manner, and cleaves the mRNA. Argonaute 2 in complex with single-stranded siRNA is sufficient for mRNA recognition and cleavage, thus forming a minimal RISC (Rivas et al., 2005). miRNAs, endogenously expressed small RNA genes which typically contain mismatches and non-Watson-Crick base pairing, are processed by this general pathway, although typically modulate gene expression by translational repression as opposed to cleavage of their target mRNA. The number of Argonaute genes is highly variable between species, ranging from one in S. pombe to twenty-seven in C. elegans. Earlier crystal structures of Argonaute apoen-zymes show the architecture of Argonaute to be a multidomain protein composed of N terminal, PAZ, MID, and PIWI domains (Song et al., 2004; Yuan et al., 2005). These multi-domain proteins are present in both prokaryotic and eukaryotic organisms. The role of Argonaute proteins in prokaryotes is still unknown, but based similarity to eu-karyotic Argonautes, they may also be involved in nucleic acid-directed regulatory pathways. These proteins have served as excellent models for learning about the struc-ture and function of this family of proteins. RNAi has found a widespread application for the simple yet effective knockdown of genes of interest. The catalytic cycle of RISC requires the binding of a number of different nucleotide structures to Argonaute, and we expect Argonaute to undergo a number of conforma-tional changes during the cycle of mRNA recognition by RISC (Filipowicz, 2005; Tom-ari and Zamore, 2005). Nevertheless, it remains unclear how the multi-domain ar-rangement of Argonaute recognizes and distinguishes between single-stranded and dou-ble-stranded oligonucleotides, which correspond to the Dicer-processed siRNA product, guide strand siRNA, and the guide strand / mRNA duplex. The Argonaute protein from Aquifex aeolicus was cloned, expressed, crystallized and solved by molecular replacement. Relative to earlier Argonaute structures, a 24° reorientation of the PAZ domain in this structure opens a basic cleft between the N-terminal and PAZ domains, exposing the guide strand binding pocket of PAZ. A 5.5-ns molecular dynamics simulation of Argonaute showed a strong tendency of the PAZ and N-terminal domains to be mobile. Binding of single-stranded DNA to Argonaute was monitored by total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). The experi-ments showed biphasic kinetics indicative of large conformational changes, and re-vealed a hotspot of binding energy corresponding to the first 9 nucleotides, the so-called “seed region” most crucial for sequence-specific target recognition. As RNAi may have evolved as a way of safeguarding the genome viral infection, it is not surprising that viruses have evolved different strategies to suppress the host RNAi response in the form of viral suppressor protein. (Hock and Meister, 2008; Lecellier and Voinnet, 2004; Rashid et al., 2007; Song et al., 2004; Vastenhouw and Plasterk, 2004). These viral suppressors are widespread, having been identified in a number of different viral families. Not surprisingly, they generally share little sequence homology with one another, although they appear to exist as oligomers built upon a ~ 100-200 amino acid protomer. Tomato aspermy virus, a member of the Cucumoviruses, encodes for protein 2B (TAV 2B, 95 a.a., ~11.3 kDa) that acts as an RNAi suppressor. Intriguingly, a similar genomic arrangement is seen in RNAi suppressors in the Nodaviruses, a family of viruses that can infect both plants and animals, such as Flock house virus b2 (FHV b2). The 2B and b2 proteins are both derived from a frameshifted ORF within the RNA polymerase gene (Chao et al., 2005). In spite of this genomic similarity, the 2B and b2 proteins share little sequence identity, and it is not well understood how the Cucumovirus 2B proteins suppress RNAi. To address how TAV 2B suppresses RNAi, the oligonucleotide-binding properties of TAV 2B were studied. TAV 2B shows a preference for double-stranded RNA oligonucleotides corresponding to siRNAs and miRNAs, and also binds to single-stranded RNA oligonucleotides. A stretch of positively charged residues between amino acids 20-30 are critical for RNA binding. Binding to RNA oligomerizes and induces a conformational change in TAV 2B into a primarily helical structure. These studies sug-gest that suppression of RNAi by TAV 2B may occur by targeting different stages of the RNAi pathway. TAV 2B falls under the category of more general RNAi suppres-sors, with potentially multiple targets for suppression.
Die anaerobe Atmung mit Nitrat und Nitrit als terminalen Elektronenakzeptoren bildet einen wichtigen Teil des biologischen Stickstoff-Zyklus. Beispiele sind Denitrifikation und respiratorische Nitrat-Ammonifikation, wobei in beiden Fällen in einem ersten Schritt Nitrat zu Nitrit reduziert wird. In der Denitrifikation entstehen dann verschiedene gasförmige Produkte (NO, N2O, N2), wogegen Nitrit in der Ammonifikation ohne die Freisetzung weiterer Zwischenprodukte direkt zu Ammonium reduziert wird. Während die terminalen Reduktasen dieser Atmungsketten gut untersucht sind, ist das Wissen über die Zusammensetzung kompletter Elektronentransportketten sowie die Interaktion einzelner Proteine als auch zwischen den Proteinen und Chinonen in der Membran begrenzt. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der membranständigen Chinol-Dehydrogenasen NapGH und NrfH in der respiratorischen Nitrat-Ammonifikation von Wolinella succinogenes. Dieses Epsilonproteobakterium ist ein etablierter Modellorganismus der anaeroben Atmung und wächst durch respiratorische Nitrat-Ammonifikation mit Formiat oder H2 als Elektronendonoren. Als terminale Reduktasen werden dabei die periplasmatische Nitratreduktase NapA und die Cytochom c-Nitritreduktase NrfA benötigt. Die Genomsequenz weist keine weiteren typischen Nitrat- und Nitritreduktasen auf, und napA- und nrfA-defiziente Mutanten sind nicht in der Lage durch Nitrat- bzw. Nitritatmung wachsen. Das Operon des Nap-Systems (napAGHBFLD) von W. succinogenes kodiert Proteine, die an der Nitrat-Reduktion durch Menachinol beteiligt sind (NapA, -B, -G und -H) und Proteine, die für die Reifung und Prozessierung von NapA benötigt werden (NapF, -L und –D). Im Gegensatz zu vielen anderen Bakterien läuft die Nitrat-Atmung unabhängig von einem NapC-ähnlichen Protein ab, das als membrangebundenes Tetrahäm-Cytochrom c für die Chinol-Oxidation zuständig ist und Elektronen über den Elektronenüberträger NapB an die terminale Reduktase NapA liefert. Zwar sind im Genom zwei NapC-Homologe kodiert (FccC und NrfH), doch die Deletion beider Gene hatte keinen Einfluss auf die Nitrat-Atmung. Es wurde vermutet, dass die Funktion von NapC in W. succinogenes stattdessen durch die beiden Fe/S-Cluster Proteine NapG und NapH übernommen wird. Die Reduktion von Nitrit zu Ammonium wird durch den NrfHA-Komplex katalysiert. Das Pentahäm-Cytochrom c NrfA bildet dabei die katalytische Untereinheit, die über das membranständige Tetrahäm-Cytochrom c auf der periplasmatischen Seite der Membran gebunden ist. NrfH gehört zur NapC/NirT-Familie und überträgt Elektronen von Menachinol auf NrfA. Mittels gerichteter Mutagenese von nrfH wurden in früheren Arbeiten bereits Aminosäure-Reste identifiziert, die essentiell für die Elektronentransportaktivität von Formiat zu Nitrit sind.
RNA-Aptamere sind kurze einzelsträngige Oligonukleotide, die ein Zielmolekül spezifisch erkennen und über ihre 3D-Struktur binden. Die Identifizierung von Aptameren erfolgt mittels in vitro Selektion nach dem Kriterium einer hohen Bindungsaffinität und/oder -spezifität. Das Tetracyclin-bindende Aptamer gehört zu den Aptameren mit der höchsten bekannten Liganden-Affinität. Darüber hinaus gehört es zu den wenigen RNA-Aptameren, die in vivo als artifizieller Riboswitch zur Modulation der Genexpression eingesetzt werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das Tetracyclin-bindende Aptamer mittels NMR-spektroskopischer und biophysikalischer Methoden im ligandfreien sowie im ligandgebundenen Zustand untersucht, um neben der bereits bekannten Kristallstruktur des RNA-Tetracyclin-Komplexes Aufschlüsse über den dynamischen Ligandenbindungsprozess und die damit verbundene genregulatorische Aktivität des Aptamers zu erhalten. Hierfür wurde der Einfluss von Mg2+-Ionen auf die globale und lokale Strukturausbildung des ligandfreien Aptamers analysiert. Durch die Bindung von Mg2+-Ionen an die RNA wird eine kompakte RNA-Struktur stabilisiert, die neben zahlreichen komplexen Tertiärinteraktionen eine starre Bindungstasche ausbildet, in der der Ligand nach einem „Schlüssel-Schloss-Prinzip“ bindet. Die Ligandbindung zieht nur noch kleinere strukturelle Änderungen nach sich. Mittels der Stopped-Flow-Technik wurden die kinetischen Aspekte der Ligandbindung in Abhängigkeit der Mg2+-Konzentration untersucht. Diese Methode ermöglichte die Analyse der Zusammenhänge zwischen RNA-Faltung und anschließender Komplexbildung in Echtzeit. Die Analyse der Stopped-Flow-Messungen ergab, dass die Geschwindigkeit des Ligandbindungsprozesses wesentlich von der Mg2+-induzierten Strukturausbildung abhängig ist. Die Mg2+-vermittelte globale Organisation der RNA-Struktur ist somit der geschwindigkeitsbestimmende Schritt des Ligandbindungsprozesses. Die RNA-Mg2+-Interaktionen bestimmen also nicht nur die 3D-Struktur des Tetracyclin-bindenden Aptamers, sondern auch die Kinetik des Ligandbindungsprozesses. Der detaillierte Vergleich des Tetracyclin-Aptamers in seiner ligandfreien und ligandgebundenen Form ergab, dass trotz der stark ausgeprägten strukturellen Ähnlichkeit, lediglich die ligandgebundene Form in einer thermisch stabilen Konformation vorliegt. Die signifikante Erhöhung der Thermostabilität durch die Ligandbindung ist die essentielle Voraussetzung für die genregulatorische Funktion des Aptamers. Basierend auf diesen Ergebnissen ist also nicht die Struktur, sondern die strukturelle Stabilität ausschlaggebend für die regulatorische Aktivität des Tetracyclin-bindenden Aptamers.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung des Bindungsmodus von GTP an die GTP-bindenden Aptamere 9-4, 10-10, Klasse II und Klasse V. Durch den direkten NMR-spektroskopischen Nachweis von Wasserstoffbrückenbindungen konnte eine intermolekulare G:C-Watson-Crick-Basenpaarung zwischen GTP und den GTP-bindenden Aptameren 9-4, 10-10 und Klasse II gezeigt werden. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte durch eine C zu U Mutation die Bindungsspezifität des Aptamers Klasse II von GTP zu 2-Amino-ATP verändert werden.
Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit ein intermolekularer G-Quadruplex als Ligandbindungsmodus zwischen GTP und dem GTP-bindenden Aptamer Klasse V beschrieben werden. Hierbei bildet GTP mit sieben Guanin-Basen der RNA eine intermolekulare G-Quadruplexstruktur, bestehend aus zwei übereinanderliegenden Guanin-Tetraden, aus. Durch den Einsatz von 15N-markiertem NH4+ konnte eine spezifische Kaliumbindungsstelle im Zentrum der Quadruplexstruktur lokalisiert werden, die zur Stabilisierung des RNA-Ligand-Komplexes dient. Die beobachteten NOE-Kreuzsignale zwischen den Protonen des gebundenen NH4+ und den Protonen der RNA bestätigten dabei die Ausbildung eines intermolekularen G-Quadruplexes. Zusätzlich ergab die Analyse der NMR-Spektren, dass die G-Quadruplexstruktur erst im Zuge der Ligandbindung ausgebildet wird. Die Bildung eines G-Quadruplexes, in der der Ligand einen integralen Bestandteil der Quadruplexstruktur darstellt, ist ein bislang unbeschriebener Bindungsmechanismus.
By far not all genetic information is expressed by mRNA coding regions of the DNA. 98% of the human genome is not encoding for proteins. Therefore, these non-coding regions have been considered as “junk DNA” for a long time [1, 2]. The last years, new high throughput sequencing techniques have allowed the elucidation of the heterogeneous population of non-coding RNAs (ncRNAs, Table 1). RNAs longer than 200 nucleotides (nt) belong to the family of long non-coding RNAs (lncRNAs). They can exhibit numerous functions: The biggest family of RNAs is represented by the ribosomal RNAs (rRNAs). Together with the transfer RNAs (tRNAs) they are essential for the translation of mRNA into an amino acid sequence.
5-Lipoxygenase (5-LO) catalyzes the two initial steps in the biosynthesis of leukotrienes, a group of inflammatory lipid mediators derived from arachidonic acid. Here, the regulation of 5-LO mRNA expression by alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay (NMD) was investigated. In the present study, the identification of two truncated transcripts and four novel 5-LO splice variants containing premature termination codons (PTC) was reported. The characterization of one of the splice variants, 5-LOΔ3, revealed that it is a target for NMD since knockdown of the NMD factors UPF1, UPF2 and UPF3b in the human monocytic cell line Mono Mac 6 (MM6) altered the expression of 5-LOΔ3 mRNA up to 2-fold in a cell differentiation-dependent manner suggesting that cell differentiation alters the composition or function of the NMD complex. In contrast, the mature 5-LO mRNA transcript was not affected by UPF knockdown. Thus, the data suggest that the coupling of alternative splicing and NMD is involved in the regulation of 5-LO gene expression.
RT-PCR analysis of different cell types revealed the existence of a large number of 5-LO splice variants. The most interesting splice variants were observed in BL41-E95A cells, which give a raise to novel 5-LO protein isoforms. This leads to the hypothesis of a novel regulatory mechanism in which the dimerization of 5-LO with 5-LO isoforms might regulate the 5-LO activity.
The 5-LO protein expression was reduced on translational level in UPF1 knock down cells, suggesting that UPF1 has a positive influence on 5-LO translation. Therefore, a mass spectrometry based proteomics study was started to identify compartment specific protein expression changes upon UPF1 knockdown in differentiated and undifferentiated MM6 cells. The proteomics analysis demonstrated that the knockdown of UPF1 results in numerous protein changes in the microsomal fraction (~ 21%) but not in the soluble fraction (< 1%). Western blot data confirmed the trend of the proteomics analysis. This data suggest that UPF1 is a critical gene expression regulator in a compartment specific way. During differentiation by TGFβ and calcitriol the majority of UPF1 regulated proteins was adjusted to normal level. It appears that that not only the NMD mechanism alters its composition during differentiation. Also the gene expression regulation on translational level by UPF1 seems to be also cell differentiation dependent. An interesting group of UPF1 target genes represent the downregulated proteins. qRT-PCR analysis of randomly chosen genes revealed no effect on mRNA expression upon UPF1 knockdown, suggesting that UPF1 positively influences the translation of these genes. Computational sequence analysis identified a conserved C-rich sequence which might be a hnRNP E2-binding site. hnRNP E2 has been characterized as a translational repressor in myeloid cells. Western blot analysis revealed a differentiation independent up regulation of hnRNP E2 by UPF1 knockdown. Additionally, microRNA-328 (miR-328) has been described as an RNA decoy modulating hnRNP E2 regulation. Due to this, stem loop qRT-PCR showed an up regulation of miR-328 in TGFβ and calcitriol differentiated MM6 cells. Based on this data we suggest a model in which downregulation of UPF1 increases hnRNP E2 expression, leading to translation inhibition. During differentiation, miRNA-328 is upregulated thereby competing with hnRNP E2 leading to an efficient translation
Die nicht-konventionelle Hefe P. ciferrii produziert große Mengen der tetra-acetylierten Sphingoidbase Phytosphingosin (TAPS). Sphingoidbasen sind essentielle Komponenten des stratum corneums, der multilamellaren Barriere der menschlichen Haut, und daher in der Kosmetik-Industrie von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die biotechnologische Produktion der Sphingoidbasen Phytosphingosin, Sphinganin und Sphingosin auf molekularbiologischer Ebene in P. ciferrii charakterisiert und optimiert werden. Die Hefe P. ciferrii konnte durch Etablierung einer einfachen und hoch-effizienten Transformations-Methode auf genetischer Ebene leicht zugänglich gemacht werden. Durch Inaktivierung des für NHEJ essentiellen PcLIG4 Gens konnte die Effizienz zielgerichteter genomischer Integrationen von transformierten DNA-Konstrukten von 1 % auf 87 % erhöht werden. Die Etablierung des Cre-loxP Systems erlaubte das mehrfache Verwenden eines Selektions-Markers wodurch sukzessiv mehrere genomische Integrationen in einem Stamm ermöglicht wurden. Durch diese Errungenschaften konnte das Ziel „Optimierung der Sphingoidbasen-Produktion der nicht-konventionellen Hefe P. ciferrii“ im Folgenden erfolgreich verfolgt werden. Der initiale Schritt der Sphingoidbasen-Biosynthese ist die von der Serin-Palmitoyl-Transferase katalysierte Kondensation von L-Serin und Palmitoyl-CoA. Durch die Deletion von Genen, die am L-Serin-Katabolismus von P. ciferrii beteiligt sind (PcSHM1, PcSHM2und PcCHA1), konnte die de novo Sphingoidbasen-Biosynthese optimiert werden und führte in einem lig4? Stamm zu einer etwa dreifachen Erhöhung der TAPS-Produktion. Weitere Ansätze den (vermutlich durch L-Serin feed back regulierten) L-Serin-Biosyntheseweg bzw. die in vivo L-Serin-Verfügbarkeit zu optimieren, führten nicht zu einer gesteigerten TAPS-Produktion. Durch weitere Deletion und Überexpression von Genen des Sphingolipid-Stoffwechsels konnte die TAPS-Produktion jedoch um ein Vielfaches verbessert werden. So konnte ein Stamm konstruiert werden, der die Gene PcLCB1, PcLCB2 und PcSYR2 überexprimiert und Deletionen der Gene PcSHM1, PcSHM2, PcCHA1, PcLCB4 und PcORM12 trägt. Dieser Stamm (CSS.L4.O.L2.L1.S2) wies eine mehr als fünffach erhöhte maximale spezifische TAPS-Produktbildungsrate (q Pmax ) auf und produzierte mit 2 g * L rund siebenmal mehr TAPS als der lig4? Ausgangsstamm, weshalb ein Einsatz dieses Stammes für die industrielle TAPS-Produktion denkbar wäre. Ausgehend von einem für die TAPS- (und somit Sphingoidbasen-) Produktion optimierten Stamm sollten Stämme mit optimierter TriASa- oder TriASo-Produktion für industrielle Zwecke generiert werden. Es stellte sich allerding heraus, dass erhöhte Mengen dieser Sphingoidbasen wahrscheinlich wachstumshemmend für P. ciferrii sind, weshalb eine weitere Produktions-Optimierung nicht ohne Weiteres möglich ist. In einem Laborstamm gelang es jedoch, durch Konstruktion und anschließende Transformation eines optimierten integrativen Plasmids (trägt die Gene, die für die Produktion von Sphingosin bzw. TriASo nötig sind) eine TriASo-Produktion von bis zu 30 mg * g (BTM) zu erzielen, wobei gleichzeitig die Bildung des Nebenprodukts TriASa auf weniger als 4 mg * g (BTM)reduziert wurde. Weiterhin konnte durch Deletion von PcSCS7 in einem TriASo-Produktionsstamm die TriASa-Produktion mehr als vierfach reduziert werden. Die Bildung eines weiteren von P. ciferrii gebildeten Nebenproduktes [Tri-Acetyl-Sphingadienin (TriASd)] konnte durch Deletion des PcSLD1 Gens unterbunden werden. Nach Inaktivierung von PcSCH9 konnte eine fast 20 %ige Verbesserung der TriASo-Produktion erreicht werden. Es konnten zwei putative Acetyl-Transferasen identifiziert werden (PcAft2 und PcSli1), die an der Acetylierung von Phytosphingosin (zu TAPS), Sphinganin (zu TriASa) und Sphingosin (zu TriASo) beteiligt sind. Die Aufklärung und Optimierung dieser von PcAtf2 und PcSli1 katalysierten Schritte sind vielversprechende Ansatzpunkte die Sphingoidbasen-Produktion in P. ciferrii weiter zu optimieren.
The long sought molecular function of membrane raft-associated flotillin proteins is slowly becoming resolved, partially owing to the increasing knowledge about their interaction partners. Being ubiquitously expressed and evolutionarily highly conserved, flotillins carry out important cellular functions, one of which is the regulation of signal transduction pathways. This study shows that the signaling adaptor protein fibroblast growth factor receptor substrate 2 (FRS2) directly interacts both in vivo and in vitro with flotillin-1 (flot-1). FRS2 is an important docking protein of many receptor tyrosine kinases. It regulates downstream signaling by forming molecular complexes with other adaptor proteins and tyrosine phosphatases, and seems to be a critical mediator of sustained extracellular signal regulated kinase (ERK) activity. Flot-1 has also been implicated in the regulation of ERK activity upon EGF and FGF stimuli. Furthermore, flot-1 forms signalosomes with EGFR and the downstream components of the MAP kinase pathway. The newly discovered interaction between FRS2 and flot-1 was shown to be mediated by the phosphotyrosine binding (PTB) domain and, to a lesser extent, the C-terminus (CT) of FRS2 and by the C-terminus of flot-1. Flot-1 coprecipitated together with FRS2 from murine tissues and cell lysates, demonstrating that this interaction also takes place in vivo. Interestingly, flot-2, which shows a high homology to flot-1 and forms stable oligomeric complexes with it, does not appear to directly interact with FRS2. Novel insights into the functional role of the interaction between flot-1 and FRS2 were provided by the results showing that depletion of flot-1 affects the cellular localization of FRS2. In hepatocytes stably depleted of flot-1, FRS2 appeared to be more soluble. Furthermore, upon pervanadate stimulation of the cells, a small fraction of FRS2 was recruited into detergent resistant membranes, but the recruitment did not take place in the absence of flot-1. Triggered by the same stimulus, a fraction of FRS2 was translocated to the nucleus independently of flot-1. Overexpression of FRS2 has previously been shown to result in increased ERK activation. However, in cells depleted of flot-1, FRS2 was not able to compensate for the compromised ERK activation after EGF or FGF stimulation. This might imply that FRS2 and flot-1 are functionally interconnected and that FRS2 resides upstream of flot-1. Taken together, the results presented here indicate that this complex may be involved in the control of signaling downstream of receptor tyrosine kinases and is important for ensuring a proper signaling response. In the absence of flot-1, increased Tyr phosphorylation of FRS2 was observed. It is known that Tyr and Thr phosphorylation of FRS2 are reciprocally regulated. Since ERK is a known executor of the FRS2 Thr phosphorylation, and ERK activity was shown to be severely diminished upon flot-1 depletion, the increased Tyr phosphorylation of FRS2 was in agreement with this and might be a direct consequence of a decreased ERK activity upon flot-1 depletion. FRS2 owes its name to the major and the first described function of this protein as a substrate for FGFR. PTB domain of FRS2 was published to constitutively bind the juxtamembrane domain of FGFR. In this study, the PTB domain was mapped to be involved in the constitutive interaction with flot-1 and the competition was shown to exist between flot-1 and FGFR1 for binding to FRS2. Another novel interaction partner of FRS2 was discovered in the present study. Cbl-associated protein (CAP) is an adaptor protein with three SH3 domains and it plays a role during insulin signaling by recruiting the signaling complex to lipid rafts. CAP was previously shown to interact with flot-1 via the SoHo domain, and this interaction was found to be crucial for the lipid raft recruitment of other signaling components. Both the PTB domain and CT of FRS2 were found to mediate the interaction with CAP, whereas in CAP, the SoHo domain, together with the third SH3 domain, seems to bind to FRS2. SH3 domains mediate the assembly of specific protein complexes by binding to proline rich sequences, several of which are present in FRS2. Due to overlapping interaction domains, FRS2 and flot-1 competed for the binding to CAP. However, the interaction with neither CAP nor flot-1 was necessary for the observed nuclear translocation of FRS2. Since CAP is expressed as several tissue- and developmental stage-specific isoforms, a further aim of this study was to analyze the expression of its isoforms in mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Many new isoforms were discovered here which have not been described in the literature so far. They all contain the SoHo domain and three SH3 domains, but differ among themselves by the presence and length of a proline-rich region that preceeds the SoHo domain and by a novel 20-amino acid (AA) stretch between the second and the third SH3 domain. The length of the proline-rich region turned out to be an important factor determining the strength of the interaction with FRS2. The interaction was found to be weakened by the increasing length of this region. The new isoforms possessing the 20-AA stretch are specifically expressed in murine muscular tissues, with the highest level in the heart. During adipogenesis, we observed a shift in the abundance of the isoforms, in that only the isoforms without the insertion were shown to be upregulated on mRNA level. However, during myogenesis, preferentially expressed isoforms were those with the insertion. The collected data implicate that isoforms with the 20-AA insertion might be more ubiquitous in nondifferentiated/embryonic cells and that the observed "isoform-switch" might be dependent on the cell fate and differentiation state.