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Die Bedeutung von Zelltod-Prozessen während der Alterung des filamentösen Ascomyzeten Podospora anserina
(2011)
- Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. In-silico Analysen von putativen Apoptose-Faktoren im Genom von P. anserina Es konnten mehrere Gene, die in einer Apoptose-Maschinerie involviert sein könnten, im Genom von P. anserina identifiziert werden. Diese Homologen wurden in zwei Ka-tegorien unterteilt: (i) die nicht-mitochondrialen Proteine PaMCA1, PaMCA2 und PaPARP und (ii) die Homologen des Apoptose-induzierenden Faktors AIF. 2. Einfluss der Metacaspase-Aktivität auf programmierte Zelltodprozesse Mithilfe von Aktivitätsmessungen konnte eine Arginin-spezifische Aktivität der Meta-caspasen nachgewiesen werden. Diese Metacaspase-Aktivität nimmt in seneszenten Kulturen und nach H2O2-Behandlung signifikant zu. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese eines programmierten, ROS-induzierten Zelltods im letzten Entwicklungs-stadium des Alternsmodell P. anserina. 3. Die Rolle von AIF-Homologen in der Entwicklung von P. anserina GFP-Fusionsproteine identifizierten eine mitochondriale Lokalisation der AIF-Homologen PaAIF2, PaAMID2 und PaPRG3. Desweiteren konnte eine altersabhängige PaAIF2-Translokation von den Mitochondrien zum Zellkern gezeigt werden, ähnlich der Apoptose-induzierenden Translokation von humanem AIF. Die Deletion von PaAif2 und PaAmid2 führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber oxidativem Stress und zu einer Verlängerung der Lebensspanne. Diese Befunde weisen auf einen ROS-induzierten, AIF-vermittelten Zelltod hin, der an der Lebensspannen-Kontrolle von P. anserina beteiligt ist. 4. Die Funktion des Proteins PaCYPD bei Seneszenz und programmiertem Zelltod Membranpotential-Messungen konnten einen Rückgang des mitochondrialen Memb-ranpotentials von 21 % bei den PaCYPD-Überexpressionsstämmen nachweisen. Durch die Behandlung mit dem spezifischen PaCYPD-Inhibitor CSA konnte das Membranpo-tential wieder normalisiert werden. Zusammen mit dem detektierten Verlust von 7 Zusammenfassung 125 Cytochrom c in den Mitochondrien der Überexpressionsstämme wird durch diese Studi-en die Vermutung einer PaCYPD-abhängigen Öffnung der mPTP untermauert. Die Pa-PaCypD-Deletion führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber mitochondrial-abhängigem, oxidativem Stress und gegenüber verschiedenen Apoptose-Induktoren. Die Überexpression von PaCypD hingegen führte zu einem beschleunigten Alterungspro-zess (Präseneszenz), einem verschlechterten Resistenzverhalten gegenüber Stress- und Apoptose-Induktoren und zu einer massiven Verkürzung der Lebensspanne. Die Le-bensspanne konnte aber durch die Behandlung mit CSA wieder auf Wildtyp-Niveau verbessert werden. Dies weist auf einen PaCYPD-vermittelte Zelltod hin. Interessan-terweise konnte durch das Wachstum auf CSA-haltigem Medium auch die Lebensspanne des Wildtyps verlängert werden. Um die hier nachgewiesene, lebensver-längernde Wirkung von CSA zu verifizieren, könnte diese Studie leicht auf andere Modellorganismen übertragen werden.
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Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
- Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.
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Taxonomie, Biologie und Feindartenkomplex ausgewählter Gallmückenarten (Diptera: Cecidomyiidae) auf Weiden (Salix spp.)
(2003)
- 11 mit Salix spp. assoziierte Gallmücken-Arten (Diptera: Cecidomyiidae: Oligotrophini) wurden einer morphometrischen Analyse unterzogen. Dabei fanden 18 allgemeine und 10 geschlechtsspezifische Merkmale Berücksichtigung. Von sechs Arten wurden darüber hinaus 10 larvale Merkmale morphometrisch erfasst. Insgesamt wurden 325 Imagines und 45 Larven vermessen. Die Ergebnisse lassen eine neue systematische Einteilung auf Gattungs- und Artebene zu. Neben der morphologisch und biologisch bereits vorher eindeutig zu differenzierenden Gattung Iteomyia ist eine Aufteilung des verbleibenden Artenschwarms in drei Gruppen erkennen. Als wesentliche trennende Merkmale zeigen sich Antennen und geschlechtspezifische Charakteristika wie die Länge des Ovipositors bei den Imagines und die Ausbildung der für die Larven charakteristischen Spatula. Die morphologische Differenzierung findet ihre Entsprechung in qualitativen, biologischen Merkmalen der Tiere. Aus diesem Grund wird die Aufteilung der auf Salix spp. gallenbildenden Cecidomyiidae in mindestens vier Gattungen vorgeschlagen. Die Gattung Iteomyia behält ihren aktuellen Status und wird von der einzigen Art repräsentiert, die auf der Blattflächen von Weiden Gallen erzeugt (I. capreae). Die Dasineura-Gruppe enthält die sich in Blattrandgallen entwickelnden Gallmücken (D. auritae, D. marginemtorquens und D. roskami) sowie die inquilinen Arten, die zur Verpuppung einen Kokon anlegen und mindestens zwei Generationen im Jahr realisieren (in der vorliegenden Arbeit untersucht: D. schreiteri). In Rabdophaga werden jene Taxa integriert, die sich im Sproßbereich ihrer Wirtspflanzen unmittelbar unter der Rindeentwickeln, ohne ausgeprägte Gallenbildungen auszulösen (in der vorliegenden Arbeit untersucht: R. saliciperda und R. repentiperda) Ihre Entwicklung ist univoltin, die Verpuppung erfolgt ohne Anfertigung eines Kokons. In einer noch genauer zu definierenden vierten Gruppierung (hier provisorisch mit dem Gattungsnamen „Salicicola“ bezeichnet) fasst die Arten zusammen, die an den Sprossen ihrer Wirtspflanzen deutliche Gallenbildungen hervorrufen. Auch sie sind univoltin und verpuppen sich im Sproßbereich ohne Anfertigung eines Kokons. Die Zuordnung des in der vorliegenden Studie nicht untersuchten Artenkomplexes, den Knospengallenerzeugern, ist noch nicht geklärt. Eine endgültige Klärung der hier vorgeschlagenen systematischen Einteilung kann nur das Ergebnis einer umfassenden Revision sämtlicher mit Salix spp. assoziierten Gallmücken sein. Die polyphage Weidenrosenmücke Rabdophaga rosaria lässt sich mit Hilfe einer Hauptkomponenten-Analyse morphometrisch in vier Cluster gruppieren, die in der systematischen Aufteilung der von ihnen genutzten Salix spp. (alba, aurita/caprea/cinerea, purpurea und repens) ihre Entsprechung finden. Die festgestellte Auftrennung der Weidenrosenmücke illustriert anschaulich die Idee der sequentiellen Evolution, nach der aufgrund der engen phänologischen, biochemischen und physiologischen Interaktionen zwischen spezialisierten Phytophagen und ihren Wirtspflanzen eine schrittweise hochgradige Anpassung der beteiligten Organismengruppen zu erwarten ist. Wie im vorliegenden Fall steht am Ende solch einer Entwicklung die Herausbildung sogenannter Biotypen, deren Eigenständigkeit durch morphologische Unterschiede untermauert wird. Die Cecidomyiidae Iteomyia capreae ruft je nach genutzter Wirtspflanzenart verschiedene Gallenformen mit unterschiedlichem Verteilungsmuster auf den Blattflächen hervor. Die sich in den beiden Gallentypen entwickelnden Tiere unterscheiden sich morphologisch und lassen sich in Abhängigkeit der von ihnen genutzten Wirtspflanze ähnlich wie Rabdophaga rosaria in zwei Biotypen einteilen. Die auf Salix caprea lebenden Tiere weisen eine geringere Gallenzahl pro Blatt auf als die auf S. cinerea lebenden Tiere. Die beiden Biotypen zeigen signifikante Unterschiede hinsichtlich ihrer Fertilität. Der S. caprea-Typus, der seine einkammrigen Gallen über die gesamte Blattfläche verteilt, zeigt eine höhere Fruchtbarkeit als der S. cinerea-Typus, der ein- bis mehrkammrige Gallen entlang des Blattmittelnervs anlegt. Gleichzeitig zeigen sich signifikante Unterschiede in der durch Parasitoiden hervorgerufenen Mortalität. Die kleinen, über die gesamte Blattfläche verstreuten Gallen des S. caprea-Typs weisen eine geringere Parasitierungsrate auf als die großen, am Mittelnerv konzentrierten Gallen des S. cinerea-Typs. Von acht der elf untersuchten Gallmückenspezies wurde der Feindartenkomplex analysiert. Zu diesem Zweck wurden an 30 Standorten in Deutschland und Dänemark über 7500 Gallen gesammelt und in Zucht genommen. Aufgrund der vielkammrigen Gallen einzelner Arten konnten insgesamt mehr als 12500 Gallenkammern auf ihre Artenzusammensetzung hin analysiert werden. Insgesamt konnten 57 Parasitoiden-Arten nachgewiesen werden, die sich auf sieben Familien parasitischer Hymenopteren verteilen. Am artenreichsten vertreten sind die Pteromalidae und Platygasteridae mit einem Anteil von jeweils 24,56 % (14 spp). Der Artenreichtum ist mit fast zehn Spezies pro Gegenspielerkomplex ungewöhnlich hoch und liegt deutlich über den Werten anderer Gallenerzeuger-Gruppen. 27 Spezies (47,37 %) konnten keiner bekannten Art zugeordnet werden. Es wird vermutet, dass sich darunter zahlreiche, für die Wissenschaft neue Arten befinden. Insgesamt 42 spp. (73,7 %) der nachgewiesenen Parasitoidenarten wurden nur aus einer der untersuchten Wirtsarten gezüchtet, lediglich fünf Arten attackierten mehr als zwei der untersuchten Wirtsarten. Das Verhältnis von Idiobionten (töten den Wirt zum Zeitpunkt der Parasitierung ab) zu Koinobionten (erlauben dem Wirt zunächst ein weiteres Wachstum) ist mit 53,3 % zu 46,7 % annähernd gleich. Für 37 Taxa (64,91 %) konnten Angaben über ihre Wirtsbindung gemacht werden. Es zeigte sich, daß der Feindkomplex der untersuchten Gallmücken von stark spezialisierten Arten dominiert wird. Alle Arten sind bisher nur an gallenerzeugenden oder zumindest endophytisch lebenden Wirten nachgewiesen worden, 28 spp. sind darüber hinaus auf gallenbildende Cecidomyiidae spezialisiert, 10 spp. parasitieren nur cecidogene Gallmücken auf Weiden. Am artenreichsten war mit 24 spp. der Gegenspielerkomplex des Blattgallenerzeugers Iteomyia capreae, gefolgt von den Blattrandgallenerzeugern Dasineura auritae (12 spp.) und D. marginemtorquens (11 spp.), dem Sproßgallenerzeugern Rabdophaga salicis (10 spp.) und der Inquilinen-Art Dasineura schreiteri (10 spp.) sowie der unmittelbar unter der Rinde ihrer Wirtspflanzen lebenden sogenannten Schrotschuß-Gallmücke R. saliciperda (6 spp.). Mit nur drei bzw. vier Arten erwiesen sich die Gegenspielerkomplexe der Weidenrosen-Gallmücke Rabdophaga rosaria und der Sproßgallen erzeugenden R. degeeri am artenärmsten. Die Ähnlichkeits-Analyse der jeweiligen Gegenspielerspektren ließ eine große Eigenständigkeit erkennen, die geringen Ähnlichkeiten sprechen für einen hohen Anteil von Spezialisten in den Parasitoidenkomplexen. In den Gegenspielerspektren dominierten nur jeweils zwei bis fünf Arten. 19 der 57 Arten wiesen eudominante oder dominate Abundanz-Werte auf. Dabei waren vor allem die Arten der Gattungen Synopeas, Torymus, Platygaster und Aprostocetus von größerer Bedeutung für die Mortalitätsraten ihrer Wirte. Die Erreger der verschiedenen Gallentypen waren unterschiedlichen Mortalitätsraten durch Parasitoide unterworfen. Dasineura auritae und D. marginemtorquens, die Erzeuger von Blattrandgallen, wiesen die höchsten durchschnittlichen Parasitierungsraten auf (43,04 %), die Inquiline D. schreiteri die geringste (20,25 %). Die Sproßgallenerzeuger Rabdophaga salicis und R. degeerii wiesen nur eine geringfügig höhere Mortalität durch Parasitierung (24,31 %) auf, gefolgt von der Weidenrosen-Gallmücke Rabdophaga rosaria (25,47 %) und den Blattgallen von Iteomyia capreae (31,26 %). Der Feindkomplex der untersuchten Cecidomyiidae wurde mit dem der an Salix spp. gallenbildenden Tenthredinidae verglichen. Bislang sind für die mit Salix spp. assoziierten cecidogenen Gallmücken und Blattwespen in Nord- und Mitteleuropa über Gegenspielerarten nachgewiesen worden, von denen lediglich sieben in beiden Wirtsfamilien auftreten. Brutparasiten, die vor allem bei den Blattgallenerzeugern (Pontania spp.) vorhanden sind, fehlen bei den Gallmücken völlig. Sowohl Cecidomyiidae als auch Tenthredinidae werden vor allem von spezialisierten Parasitoiden attackiert, deren Wirtskreis sich auf diese gallenbildenden Herbivoren-Gruppen beschränkt. Innerhalb der Gegenspielerspektren sind jeweils über 80 % der Parasitoidenarten bislang nur in einem Gallentyp nachgewiesen worden. Der Artenpool der Blattwespen-Parasitoiden wird mit fast 60 % von den Ichneumonoidea dominiert. Bei den Gallmücken fehlt diese ParasitoidenÜberfamilie völlig, hier sind die Chalcidoidea mit über 70 % der Arten das bestimmende Element. Dagegen stellen die in den Tenthrediniden-Gallen lediglich mit zwei Arten vertretenen Platygasteroidea im Gegenspielerspektrum der Cecidomyiidae mehr als 25 % aller Spezies. Bei den Blattwespen tritt nur ein knappes Drittel der Parasitoidenarten, deren Biologie näher bekannt ist, als Koinobionten auf. Bei den Gallmücken erhöht sich der Anteil dieser Feindarten-Gilde auf über 50 %. Vergleicht man die einzelnen Gallentypen, so sind auch in der Parasitierungs-Strategie der beteiligten Arten große Unterschiede zu verzeichnen. Die meisten Parasitoide der Tenthredinidae befallen junge Wirtslarven, bei den Gallmücken ist dagegen der Typ des Junglarven-Parasitoiden nur selten anzutreffen: Wird ein frühes Wirtsstadium angegriffen (in der Regel durch Koinobionten), so erfolgt bereits die Belegung des Wirtseies. Blattwespen weisen höhere Mortalitätsraten als Gallmücken auf. Darüber hinaus zeigt sowohl bei den Blattwespen als auch bei den Gallmücken die durch Parasitierung hervorgerufene Mortalität prägnante Unterschiede zwischen den einzelnen Wirtsarten und Gallentypen, aber auch innerhalb einer Art gibt es je nach Lokalität und Untersuchungsjahr deutliche Schwankungen. Bei den Tenthredinidae liegt die durchschnittliche Parasitierungsrate der Blattgallenerzeuger (53,3 %) deutlich über den Werten der Sproßgallenerzeuger (41,7 %) Entsprechende große Unterschiede lassen sich für die Blattrandgallenerzeuger (43,04 %) und Sproßgallenerzeuger (24,31 %) der Cecidomyiidae feststellen.
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Mitochondrial-nukleäre Interaktionen, oxidativer Stress und Alterungsprozesse bei dem Ascomyzeten Podospora anserina
(2005)
- Mitochondrien, Organellen der oxidativen Phosphorylierung, sind in vielfältiger Weise an Alterungsprozessen in unterschiedlichen Modellorganismen beteiligt. Viele Mechanismen und Faktoren, die das Altern beeinflussen, scheinen konserviert zu sein. In dem in dieser Arbeit untersuchten Ascomyzeten Podospora anserina treten z. B. altersabhängige Reorganisationen der mtDNA auf, die zu einem Verlust lebensnotwendiger Gene führen können. In Menschen wurden ebenfalls Umstrukturierungen des mitochondrialen Genoms in unterschiedlichen Geweben mit fortschreitendem Alter beschrieben. Umgekehrt treten manche Faktoren, die die Lebensspanne beeinflussen, nur in einigen Modellsystemen auf. Hierzu gehört z. B. die Induktion der alternativen Oxidase in vielen langlebigen P. anserina-Mutanten. Diese Modifikation in der Atmungskette kann in S. cerevisiae und Säugern nicht beobachtet werden, da diesen Organismen eine alternative terminale Oxidase der oxidativen Phosphorylierung fehlt. Der Fragestellung, wie die Atmungskette im Falle der exklusiven PaAOX-abhängigen Respiration in der unsterblichen Mutante ex1 hinsichtlich der Zusammensetzung und kinetischer Eigenschaften des Elektronentransports charakterisiert ist, wurde in der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Über die funktionalen Eigenschaften der Mitochondrien hinaus ist auch die Morphologie dieser Organellen altersabhängiger Änderungen unterworfen. Hinsichtlich der Gestalt der Mitochondrien in verschiedenen Altersstadien ist nur sehr wenig bekannt. Bisher steht nur fest, dass der P. anserina-Wildstamm „S“ im mittelalten Stadium filamentöse Mitochondrien aufweist. Ob und in welchem Ausmaß es zu Veränderungen der mitochondrialen Morphologie während des Alterns im Wildstamm „s“ und der Mutante grisea kommt, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus PaDnm1 als putativer mitochondrialer Teilungsfaktor charakterisiert. Insbesondere die Modulation der PaDnm1-Expression durch Überexpression bzw. Deletion soll zeigen, welchen Einfluss PaDnm1 auf die mitochondriale Morphologie und andere phänotypische Parameter wie z. B. die Lebensspanne hat. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Im Wildstamm „s“ wurde im Gegensatz zu ex1 durch enzymkinetische Analysen eine starke Interaktion der Komplexe I und III nachgewiesen. Ein Großteil der Komplexe I und III ist im Wildstamm „s“ in Form von Superkomplexen organisiert. In der Mutante ex1 liegen die Komplexe I und III dagegen hauptsächlich frei vor. Die spezifische Aktivität der Cytochrom-c-Reduktase ist in ex1 niedriger als im Wildstamm „s“. 2. Seneszente Isolate des Wildstammes „s“ und der PaDnm1::ble-Mutante weisen im Gegensatz zur Mutante grisea eine starke Freisetzung von Wasserstoffperoxid auf. 3. Juvenile und mittelalte Wildstamm „s“-Isolate enthalten überwiegend kurze, filamentöse Mitochondrien, die entlang der Hyphenachse im Cytoplasma orientiert sind. Im seneszenten Stadium kommt es zu einer starken mitochondrialen Fragmentierung. Der Übergang von einer filamentösen zu einer sphärischen Morphologie dieser Organellen tritt auch in Mutante grisea auf. In ex1-Hyphen sind hauptsächlich filamentöse Mitochondrien enthalten. Initiale Analysen zur mitochondrialen Feinstruktur zeigen, dass in Wildstamm „s“ und Mutante grisea eine lamellenartige Cristaestruktur erkennbar ist. In der Mutante ex1 hingegen erscheinen die Cristae ungeordneter und weniger zahlreich. 4. Die Mitochondrienfragmentierung im seneszenten Wildstamm „s“ korreliert mit einer Induktion der Transkription von PaDnm1. In Mutante grisea ist die PaDnm1-Transkriptmenge während des Alterns konstant, obwohl sich die mitochondriale Morphologie wie im Wildstamm „s“ verändert. Überexpression von PaDnm1 führt zur Mitochondrienfragmentierung während die gezielte Deletion dieses Gens eine starke Elongation der Mitochondrien zur Folge hat. PaDnm1 ist somit das erste in einem filamentösen Pilz charakterisierte Gen der mitochondrialen Teilungsmaschinerie. 5. PaDnm1::ble-Isolate zeigen im seneszenten Stadium mitochondriale Fragmentierung wie Wildstamm „s“ und Mutante grisea. Das mitochondriale Genom von PaDnm1::ble ist stabilisiert, d. h. die Bildung der seneszenzfördernden plDNA wird unterdrückt. Die mittlere Lebensspanne der PaDnm1::ble-Mutante ist deutlich (> Faktor 10) gegenüber der des Wild-stammes „s“ erhöht. Bemerkenswerterweise zeigt PaDnm1::ble im Gegensatz zu anderen langlebigen P. anserina-Mutanten nach der Sporenkeimung keine physiologischen Defekte: Wuchsrate, männliche und weibliche Fertilität, Myzelmorphologie und Mitochondrien-segregation während der Ascosporengenese sind nicht eingeschränkt. Allerdings weist PaDnm1::ble eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Ammoniumazetat auf. Dies äußert sich in einer Inhibierung der Sporenkeimung und einer Verringerung der Wuchsrate bei Anzucht der Mutante auf AmAc-haltigem Medium.
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Analyse differentiell-gebildeter mitochondrialer Proteine während des Alterns in dem filamentösen Ascomyceten Podospora anserina und Charakterisierung der O-Methyltransferase PaMTH1
(2009)
- Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Eindimensionale Gelelektrophoresen Die Analyse mitochondrialer Proteine aus juvenilen und seneszenten P. anserina-Wildstämmen mit Hilfe von eindimensionalen SDS- und eindimensionalen Blau-Nativen-Gelelektrophoresen zeigt keine deutlichen, seneszenzspezifischen Unterschiede. Im Gegensatz dazu werden in initialen Versuchen der nicht-radioaktiven 2D-PAGE differentiell gebildete Proteine visualisiert. 2. 2D-PAGE mit radioaktiv-markierten, mitochondrialen Proteinen aus jungen und alten P. anserina-Wildstämmen In der ungerichteten Proteomanalyse wurden 29 differentiell-gebildete Proteine identifiziert und zusätzlich zahlreiche Isoformen einiger Proteine gezeigt. Von der ß-ATPase wurden modifizierte Isoformen gefunden. Außerdem wurde eine seneszenspezifisch verringerte Bildung von ROS-Abwehr-Proteinen in den Mitochondrien detektiert. Im Gegensatz dazu wurde eine größere Menge eines Chaperons gefunden, das bei der Proteinsynthese eine Rolle spielt: eine Protein-Disulfid-Isomerase, die die Umlagerung und Neubildung von Di-Sulfid-Brücken bei der Faltung von Proteinen katalysiert. Zusätzlich wurde eine erhöhte Menge des Proteins SSC1 identifiziert. Dieses gehört zur Hsp70-Hitzeschock-Proteinfamilie. Es wurde ebenfalls eine erhöhte Menge des Apoptosefaktors Cyclophilin D in den mitochondrialen Proben aus den seneszenten Wildstämmen identifiziert. Die Identifizierung dieses Proteins in Mitochondrien von P. anserina stellt neben der Charakterisierung der Metacaspasen (Hamann et al., 2007) einen weiteren Ansatzpunkt für die Apoptoseforschung in P. anserina dar. Die molekularbiologische Analyse dieses Proteins wurde aufgrund dieser Proteomanalyse im Arbeitskreis aufgenommen (Dissertation D. Brust). Ein weiteres Protein, das in stark erhöhter Menge in den Proteinisolaten identifiziert wurde, ist PaMTH1. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur und die Funktion dieser neu identifizierten differentiell-gebildeten Methyltransferase während der Alterung in P. anserina mit Hilfe molekularbiologischer, biochemischer und physiologischen Analysen untersucht. 3. Charakterisierung von PaMTH1 Im Rahmen von Northernblot-Analysen wurde gezeigt, dass die PaMth1-Transkriptmenge in drei unabhängigen alten Wildstämmen im Vergleich zu den entsprechenden jungen Wildtsämmen deutlich erhöht ist. In einer Westernblot-Analyse von Gesamtproteinen und Mitochondrien aus jungen und seneszenten Wildstämmen wird der seneszenzspezifische Anstieg der Proteinmenge verifiziert. Die genauere Einordnung von PaMTH1 in die Klasse I der Methyltransferasen und die Ergebnisse der Analyse der Substratspezifizität geben einen Hinweis auf eine Schutzfunktion durch die Verhinderung einer ROS-Entstehung unter der Beteiligung von Substanzen mit einer Catecholgruppe. Die Ergebnisse der Analyse der Modulation der PaMth1-Expression in P. anserina deuten ebenfalls auf eine Schutzwirkung von PaMTH1 hin: PaMth1-Überexpressionsstämme zeigen eine verbesserte Wuchsrate auf stress-induzierenden Medien, weniger carbonylierte Proteine und vor allem eine verlängerte Lebensspanne ohne physiologische Nachteile im Vergleich zum Wildstamm. Dagegen lebt die PaMth1-Deletionsmutante kürzer und wächst schlechter auf ROS-induzierenden Medien, sie zeigt allerdings keine erhöhte Menge von carbonylierten Proteinen im eindimensionalen „Oxyblot“. Die beobachtete Lebensspannenverkürzung der PaMth1-Deletionsmutante wird jedoch durch die Reversion dieser Stämme wieder aufgehoben, sodass die Hypothese des Schutzes vor der ROS-Generierung durch die Methylierung von Dihydroxylgruppen anhand der erhaltenen Daten unterstützt wird.
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Development of native electrophoretic techniques for the isolation and characterization of mitochondrial complexes
(2012)
- In the first part of this work, the development of a novel two-dimensional native gel electrophoretic system (2-D BN/hrCNE) is described. This new system simplifies proteomics and biochemical analysis of mega protein complexes that are dissociated into the constituent complexes during 2-D electrophoresis, thereby reducing the complexity of the system considerably. This technique is exceptionally well suited for the in-gel detection of fluorescence-labeled proteins and the identification of individual enzymes and protein complexes by specific in-gel assays on native gels. In the second part, a new technique for the native immunoblotting of blue native gels (NIBN) was developed. This new technique allows for the identification of conformation-specific antibodies and the discrimination of antibodies recognizing linear epitopes of denatured proteins. Identification of conformation-specific antibodies is becoming increasingly important not only for the electron microscopic identification of native proteins but also for structural investigations in general. For this purpose, a commonly used protocol for Western blotting of blue native gels was modified in such a way that the native state of proteins and protein complexes was retained throughout the complete protocol. Instead of using the denaturing methanol in Western blotting protocols, mild detergents such as Tween 20, digitonin and Brij 35 were used for the obligatory removal of protein bound Coomassie-dye. The detection of respiratory complex I by activity staining on the blot membrane demonstrated that all three non-ionic detergents preserved the native state of complex I. The native state of the enzyme on the blot membrane was also monitored and confirmed with the help of a set of conformation-specific antibodies. NIBN can be used as a simple alternative method to the demanding native ELISA to screen for conformation-specific antibodies for structural studies. Unlike the time consuming native ELISA, NIBN does not require introduction of appropriate affinity tags and purification of the target protein by chromatography. Thus, the NIBN technique is especially useful for microscale projects and for proteins not easily accessible to genetic manipulation. The third part aimed at identification of the immediate protein interaction partners of Cox26, a hydrophobic protein that has been identified by our group as a novel component of yeast respiratory supercomplex. Multi-dimensional electrophoretic techniques were applied to identify non-covalent and covalent protein-protein interactions of Cox26. Three-dimensional electrophoresis (BNE/BNE/SDS-PAGE) gave both qualitative and quantitative information on covalent and non-covalent interactions of Cox26 and subunits of cytochrome c oxidase (complex IV), and showed that most of the Cox26 protein was non-covalently bound to the complex IV moiety of the respirasomes. Four-dimensional electrophoresis (BNE/BNE/SDS/SDS-PAGE) applying reducing and non-reducing conditions revealed that a minor fraction of Cox26 used a single cysteine residue in the center of a predicted transmembrane helix to form a disulfide bond with the Cox2 subunit of complex IV. A structural role of Cox26 protein in the assembly/stability of respiratory strings or patches has been suggested. The last part of this work focused on the isolation and characterization of native and morphologically intact nucleoids from bovine heart mitochondria, since only a few studies on nucleoid organization and composition have been carried out on mammalian tissues. The nucleoids appeared as distinct bands (apparent mass around 30-36 MDa) in blue native-PAGE on large pore gels. The moderate variation in particle size seems to reflect variations in the binding of loosely nucleoid-associated components like respiratory chain complexes. The estimated 30-36 MDa mass of nucleoids on native gels suggested that each nucleoid contains one mtDNA molecule provided that nucleoids contains equal amounts of DNA, protein and RNA (Miyakawa et al., 1987). Electron microscopic analysis of native nucleoids, which was performed by Dr. Karen Davies from the Max-Planck-Institute of Biophysics, Department of Structural Biology, Frankfurt, showed homogenous pool of particles with dimensions in 85x100 nm (in negative stain) and 100x150 nm (in cryo-tomography). Some of the nucleoids showed dumbbell-shape indicating dimerization of nucleoids. Recent EM and high-resolution light microscopy analysis of mammalian nucleoids have reported that nucleoids have a size of 70 nm in average. We also observed the same size of 70 nm in cryo-tomogramms when we applied harsher treatment of the native nucleoid particles with dimensions 100x150 nm. This observation is in agreement with published nucleoid sizes from both EM and high-resolution light microscopy, if we assume that native nucleoids have been dissociated under harsher treatment. The protein composition of bovine heart mt-nucleoids was analyzed by a number of complementary approaches to identify low and highly abundant, easily dissociating and tightly bound proteins, and to rank the 90 most abundant mt-nucleoid proteins. Native and denaturing gel electrophoresis techniques were coupled to LC-MS/MS to achieve a comprehensive protein component analysis. Qualitative MS analysis of highly purified nucleoids identified more than 400 proteins, including well known nucleoid proteins such as mitochondrial transcription factor and mtDNA-binding protein (TFAM), mitochondrial single-stranded DNA-binding protein (mtSSB), mitochondrial DNA polymerase subunit gamma-2 (POLG2) and mitochondrial helicase C26H10ORF2 protein (Twinkle). These proteins were ranked according to Mascot scores, and sorted according to presumed functional properties. A large group of proteins involved in protein synthesis comprised an almost complete set of subunits of mitochondrial ribosomes suggesting that the nucleoids contained significant amounts of mitochondrial ribosomes. Identification of sixty six proteins from the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system comprising around 100 proteins in total suggested that OXPHOS proteins are also associated with mt-nucleoids. Interestingly, TFAM, described as a main mtDNA packaging factor in human and other mammalian cells, was not confirmed here as a major nucleoid component from bovine heart mitochondria. Fluorescence staining of protein spots on 2-D IEF/SDS gels clearly identified TFAM, but according to the stain intensity, this protein did not rank in the list of the 90 most abundant nucleoid proteins. Western blot analysis of sucrose gradient fractions revealed an enrichment of putative TFAM isoform in nucleoid fractions. Unexpectedly, the uncharacterized mitochondrial protein Es1 was identified as the most abundant nucleoid protein in bovine heart nucleoids instead. This implicates that nucleoid organization may differ between species and tissues. A functional characterization of Es1 is required to clarify its role in mammalian nucleoids.
