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Die Herstellung von Poly(butylcyanoacrylat)-Nanopartikeln (PBCA-NP) ist seit fast 25 Jahren bekannt. Sie erfolgt meist durch anionische Emulsionspolymerisation von Butylcyanoacrylat unter Verwendung von Dextran 70.000 als Stabilisator. Vereinzelt wurde in früheren Arbeiten bereits Pluronic® F68 als Emulgator für die Polymerisationsreaktion verwendet. Diese Arbeit hat ihren Schwerpunkt in der Herstellung von PBCA-NP mit F68 als Stabilisator. Es konnte gezeigt werden, dass sich mit diesem Hilfsstoff ebenfalls nanopartikuläre Trägersysteme reproduzierbar und im gewünschten Größenbereich um 200 nm herstellen lassen. Diese Partikel besitzen im Gegensatz zu Dextran-stabilisierten NP eine sehr enge Größenverteilung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die hergestellten NP im Bezug auf ihr Molekulargewicht und ihre Dichte charakterisiert. Ein Partikel besitzt die Masse von ca. 2,5 * 109 Dalton und hat eine Dichte von etwa 1,148 g/cm³. Bei einem PBCA-Nanopartikel handelt es sich jedoch nicht um ein Riesenmolekül, vielmehr wird er durch Agglomeration von relativ kurzen Polymerketten gebildet. Ein Partikel besteht aus ca. einer Million Polymerketten, welche ein Molekulargewicht von ca. 2500 g/mol besitzen. Der Einfluss der Herstellungsparameter auf leere und arzneistoffbeladene Partikel wurde untersucht. Die Partikel wurden hierbei durch die Parameter Partikelgröße, Polydispersität, Partikelausbeute, Zetapotential und Molekulargewicht charakterisiert. Neben der Herstellung durch anionische Emulsionspolymerisation wurden NP durch radikalische Emulsionspolymerisation und Nanopräzipitation erhalten. Auch unter Verwendung dieser Verfahren wurden Trägersysteme im gewohnten Größenbereich um 200 nm gebildet. Zusätzlich zur Herstellung von NP hat sich diese Arbeit auch mit den Charakterisierungsmethoden für kleinpartikuläre Arzneiformen auseinandergesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die häufig angewendete dynamische Lichtstreuung ein geeignetes Verfahren zur Ermittlung des mittleren Partikeldurchmessers darstellt. Die Ergebnisse dieser Methode stimmen weitgehend mit den Resultaten der zusätzlich verwendeten mikroskopischen Verfahren und der analytischen Ultrazentrifugation überein. Der Einsatz der analytischen Ultrazentrifugation lieferte die best aufgelöste Partikelgrößenverteilung und ermöglichte darüber hinaus die Bestimmung der Dichte der Partikel. Neben der mittleren Größe der Trägersysteme wurde auch das mittlere Molekulargewicht der gebildeten Polymerketten bestimmt. Die hierfür als Standard eingesetzte Gel-Permeations-Chromatographie wurde mit einem relativ neuen Verfahren, der MALDI TOF Massenspektrometrie verglichen. Beide Verfahren lieferten ein zahlenmittleres Molekulargewicht der Polymerketten von 2500 – 3000 Da. Lediglich im Bezug auf das gewichtsmittlere Molekulargewicht zeigten sich größere Unterschiede zwischen beiden Messverfahren, welche jedoch auf das zugrunde liegende Messprinzip und nicht auf das untersuchte PBCA zurückzuführen sind. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnte die chemische Struktur der Polymerketten näher aufgeklärt werden. Neben den Produkten des seit langem postulierten Reaktionsmechanismus finden sich Derivate des Polymers, welche formal durch Abspaltung bzw. Anlagerung von Formaldehyd entstehen. Die Menge an frei vorliegendem Formaldehyd scheint jedoch so gering zu sein, dass sie kaum die Hauptursache für die relative Toxizität der PACA-NP darstellen kann. Darüber hinaus ist es möglich, durch Wahl der Reaktionsbedingungen die Bildung von Derivaten des Ursprungspolymers und von Formaldehyd zu minimieren. Die Ergebnisse in der Herstellung und Charakterisierung von leeren Pluronic® F68-stabilisierten PBCA-NP ließen die Verwendung von Doxorubicin-beladenen NP unter Verwendung dieses Stabilisators für die Gehirntumor-Therapie viel versprechend erscheinen. Die hergestellten Nanopartikel zeigten eine im Vergleich zu Dextran-stabilisierten Doxorubicin-NP signifikant niedrigere Arzneistoffbeladung. Die dessen ungeachtet durchgeführte experimentelle Chemotherapie an Glioblastom-tragenden Ratten lieferte jedoch ermutigende Ergebnisse. Die neu entwickelte Zubereitung führte zu einem vergleichbaren Prozentsatz an Remissionen wie die bisherige Standard-PBCA-Formulierung. Die F68-stabilisierte Formulierung und die bisherige Standard-Formulierung mit Polysorbat 80 zeigten nach Inkubation mit humanem Plasma ein vergleichbares Adsorptionsmuster an Plasmaproteinen. Auf Basis der vorangegangenen Studien und dieser Arbeit erscheint es möglich, eine potente nanopartikuläre Doxorubicin-Zubereitung zu entwickeln, welche ausreichend charakterisiert ist, um ihre Anwendung am Menschen zu vertreten.
Kollagen des marinen Schwammes Chondrosia reniformis Nardo: Optimierte großtechnische Herstellung, Analytik und neue pharmazeutisch-technologische Anwendungsmöglichkeiten Großtechnische Isolierung und Untersuchung von Chondrosia-Kollagen Schwämme spielen eine wichtige Rolle im Ökosystem des Meeres und ihr Vorkommen ist begrenzt. Zur schonenden und nachhaltigen Nutzung als Rohstoffquelle müssen im Hinblick auf eine industrielle Nutzung alternative Wege zur Gewinnung von marinem Schwammkollagen entwickelt werden. Ein Beispiel hierfür sind die sogenannten „Marikulturen“ direkt im Meer, aus denen die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Schwämme stammten. Im Gegensatz zu den früher eingesetzten Methoden zur Isolierung des Chondrosia-Kollagens, die Laborcharakter trugen, konnte in der vorliegenden Dissertationsarbeit ein stark vereinfachtes, für die großtechnische Produktion geeignetes Verfahren mit einer hohen Ausbeute (ca. 35%) beschrieben werden. Das Schwammausgangsmaterial wurde über ca. 4 Tage mit Hilfe von Natriumsulfit reduktiv behandelt und die Kollagenfasern (nach einem Filtrationsschritt) in saurem Medium gewonnen. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen des isolierten Materials zeigten die kollagentypische Fibrillenquerstreifung, die Unlöslichkeit der Faserbündel in saurem Milieu sowie deren Abbau in die einzelnen Fibrillen in neutraler Pufferlösung. Die von tierischen Kollagenen abgeleitete Bestimmung des Proteingehaltes ergab einen im Vergleich zum kalkulierten Kollagenanteil höheren Gesamtproteingehalt. Dies ist ein Hinweis auf mögliche nichtkollagene Proteinanteile, die an Kollagen assoziiert vorliegen können. Untersuchungen zur Aminosäurenzusammensetzung des isolierten Materials ergaben im Vergleich zu den von Swatschek et al. (2002a) publizierten Ergebnissen einen deutlich höheren Glycin- und einen mehr als doppelt so hohen Hydroxyprolingehalt. Dies kann dahingehend gedeutet werden, dass die neue Isolierungsmethode die bekannten Verunreinigungen des Kollagens mit Glykoproteinen reduziert und zu einem deutlich reineren Kollagenmaterial führt. Mit Hilfe einer neu entwickelten Methode konnten erstmalig Partikel aus Chondrosia-Kollagen hergestellt werden, deren Größe im Nanometerbereich lag. Hierbei handelte es sich um eine kontrollierte alkalische Hydrolyse des isolierten, gefriergetrockneten Kollagens in 1,5 M NaOH. Es konnte eine Partikelausbeute in Höhe von ca. 10% erzielt werden. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen zeigten gleichförmige, sphärische Partikel. Die Partikelgrößenuntersuchungen mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (nach Resuspension der gefriergetrockneten Schwammkollagennanopartikel (SKNP)) ergaben eine Größe von 168 ± 9,1 nm. Somit sind diese Partikel im Gegensatz zu den bisher aus Chondrosia-Kollagen gewonnenen Mikropartikeln auch für intravenöse Anwendungen geeignet und haben eine größere Trägerkapazität. Die hergestellten Nanopartikel wurden adsorptiv mit dem Wirkstoff 17?-Estradiol-Hemihydrat beladen. In Abhängigkeit von der eingesetzten Stoffkonzentration (1,25 bis 5,0 mg/ml) konnten Beladungsraten von bis zu 13,1% erzielt werden. Die Stabilitätsprüfung von wässrigen Partikelsuspensionen ergab nach 180 Tagen Einlagerung eine auf 7 bis 8% reduzierte Beladungsrate. Nach Inkorporation der beladenen Partikel in eine Hydrogelgrundlage wurde die transdermale Bioverfügbarkeit des Arzneistoffs im Rahmen der Hormonersatztherapie bei postmenopausalen Frauen untersucht. SKNP-Gele mit einer Estradiolkonzentration in Höhe von 0,06% wurden mit gleichkonzentrierten partikelfreien Gelen verglichen. In den Speichelproben der Patientinnen konnten nach täglicher einmaliger Applikation des Nanopartikelgels nach 28 Tagen signifikant höhere Estradiolkonzentrationen gemessen werden. Die ermittelten Flächen unter den Konzentrations-Zeit-Kurven (AUC) über 24 h nach der einmaligen topischen Applikation von 0,75 mg Estradiol waren um das 2,3 bis 3,4-fache höher als die entsprechenden AUC-Werte des Vergleichsgels. 24 h nach Auftragen des Gels lagen die Estradiolspiegel des Vergleichsgels in etwa wieder auf Höhe der Basalwerte, wohingegen die Estradiolwerte nach Applikation des SKNP-Gels zum gleichen Messzeitpunkt mindestens doppelt so hoch waren. Somit konnten bei Anwendung der SKNP-Zubereitung eine deutlich erhöhte transdermale Estradiolabsorption und eine verlängerte Arzneistoffwirkung beobachtet werden. Das nanopartikuläre Trägersystem aus Chondrosia-Kollagen stellt damit eine vielversprechende Möglichkeit zur Erhöhung der transdermalen Bioverfügbarkeit von lipophilen, schlecht resorbierbaren Wirkstoffen dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Formulierung für einen magensaftresistenten Überzug mit Chondrosia-Kollagen als Filmbildner entwickelt. Die Sprühsuspension bestand aus 15% gefriergetrocknetem Kollagen, dem Weichmacher Triethylcitrat (1,5%), dem Trennmittel Talkum (7,5%) und Wasser. Der Coating-Prozess wurde in einem Dragierkessel mit Placebotabletten durchgeführt. In regelmäßigen Abständen wurden Tabletten-Stichproben entnommen, um die erforderliche Kollagenschichtdicke für eine Magensaftresistenz zu bestimmen. Tabletten mit einer Kollagenauftragsmenge von 12,9 mg/cm2 entsprachen der Prüfung auf Magensaftresistenz gemäß Europäischem Arzneibuch. Die Widerstandsdauer in 0,1 M Salzsäure betrug mehr als 2 h und der Zerfall in Phosphatpufferlösung pH 6,8 höchstens 10 min. Rasterelektronenmikrosko-pische Aufnahmen bei unterschiedlichen Vergrößerungen zeigten eine gleichmäßige und glatte beschichtete Oberfläche. Das Auftragsverfahren im Dragierkessel erwies sich als reproduzierbar. Die mechanischen Eigenschaften der überzogenen Tabletten waren zufriedenstellend und die Magensaftresistenz wurde durch eine 6-monatige Lagerung nicht beeinträchtigt. Als Naturprodukt eignet sich Schwammkollagen als Überzugsmaterial für Nichtarzneimittel. Der schnelle Zerfall des Kollagenüberzugs in neutraler Pufferlösung stellt einen Vorteil gegenüber den häufig verwendeten Schellacküberzügen dar, die sich im Darmtrakt zu langsam auflösen und daher nicht selten mit synthetischen Polymeren kombiniert werden.
Die Entwicklung von Wirkstoffträgern für Antisense-Oligdesoxyonukleotide auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln stellt einen interessanten Ansatz für antivirale Strategien dar. So konnte gezeigt werden, dass bereits ab einem 1,5-fachen Massenüberschuss an Protamin eine spontane Komplexbildung mit Antisense-Wirkstoffen stattfindet, die einen Größenbereich von etwa 200 nm aufweisen und durch eine Oberflächenladung von ca. + 20 mV charakterisiert sind. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften besitzen diese Nanopartikel nahezu ideale Eigenschaften, die intrazelluläre Verfügbarkeit von Antisense-Wirkstoffen entscheidend zu verbessern. Eine sehr gute zelluläre Aufnahme von Protamin/Antisense-Nanopartikeln konnte entsprechend in primären humanen Makrophagen als auch in lymphozytären T-Zellen gezeigt werden. Die Anwendung dieser Wirkstoffträger in den beschriebenen Zellen erwies sich dabei als sehr gut verträglich und zeigte keine toxischen Wirkungen in insgesamt drei unterschiedlichen Testverfahren zur Bestimmung der Zelltoxizität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Protamin/Antisense-Nanopartikel mit unmodifizierten Antisense-Oligodesoxynukleotiden ein sehr günstiges intrazelluläres Auflösungsverhalten besitzen, was zu einer kontinuierlichen Freisetzung des inkorporierten Antisense- Wirkstoffs führte. Dabei wurde deutlich, dass nach spätestens 72 Stunden ein vollständiger Zerfall des Nanopartikels stattfand und der Wirkstoff sich gleichmäßig in intrazellulären Kompartimenten verteilte. Im Gegensatz dazu stellen Protamin/Antisense-Nanopartikel mit modifizierten Phosphorothioat-Wirkstoffen ein äußerst stabiles System dar, das zu keiner merklichen intrazellulären Wirkstofffreisetzung selbst nach 72 Stunden führte. Es konnte gezeigt werden, dass Protamin/AS-ODN-Nanopartikel die Expression eines von einem lentiviralen Vektor exprimierten Reportergens konzentrationsabhängig in primären humanen Makrophagen inhibieren konnte. Die antivirale Wirksamkeit dieser Wirkstoffträger konnte auch gegen das HIV-1-spezifische Transaktivatorprotein Tat in transient transfizierten Zielzellen der HIV-1-Infektion spezifisch demonstriert werden. Hier wurde eine selektive Inhibition der Tat-vermittelten Transaktivierung von 35 % bei einer Konzentration von 2 MikroM in Jurkat-Zellen nachgewiesen. Auch in primären Makrophagen, die mit einem HIV-1-Wildtypisolat infiziert wurden, führte die Anwendung von Protamin/AS-ODN-Nanopartikeln mit spezifischen Sequenzen gegen ein HIV-1-Gen zu einer deutliche Reduktion der Virusausbreitung in der Kultur. Bei einer wiederholten Behandlung von HIV-1-infizierten Makrophagen mit Protamin/AS-ODN-Nanopartikel in einer Konzentration von 2 MikroM zeigten nur einige wenige Zellen eine Infektion mit dem Virus, während sich in unbehandelten Zellen eine komplett durchinfizierte Kultur manifestiert hatte. Entsprechend der ungünstigen Bioverfügbarkeit von AS-PTO-Wirkstoffen nach intrazellulärem Transport in Form von Protamin-Nanopartikeln konnte für diese Formulierungen keine biologische Wirkung in Zellkultursystemen nachgewiesen werden. Die Inkorporation von destabilisierenden Zusätzen in die Nanopartikelmatrix bietet hier Möglichkeiten, die intrazelluläre Dekomplexierung dieser Wirkstoffträger günstig zu beeinflussen. Als Neuentwicklung konnte ein kolloidales Trägersystem für siRNA-Wirkstoffe auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln entwickelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Protaminbase als auch Protaminsulfat siRNA-Wirkstoffe ab einem 2,5-fachen Massenüberschuss komplexieren. Protamin basierte Nanopartikel für siRNA-Wirkstoffe waren durch ein sehr günstiges Zellaufnahmeverhalten und fehlende zytotoxische Wirkung in primären humanen Makrophagen gekennzeichnet. Trotz dieser idealen Ausgangsbedingungen zeigten biologische Wirksamkeitstestungen sowohl gegen das endogene Protein Lamin A/C als auch virale Hemmversuche in HIV-1- infizierten primären Makrophagen nur marginale Effekte. Eine weitere Optimierung der Nanopartikelzusammensetzung und Untersuchungen zur intrazellulären Stabilität sind nötig, um die biologische Aktivität dieser Formulierungen entscheidend zu verbessern. Oberflächenmodifizierte Nanopartikel auf der Basis von Gelatine erwiesen sich in den durchgeführten Experimente als besonders vielversprechend. Hier konnte gezeigt werden, dass ein spezifisches Targeting von T-Zellen mit CD3-Gelatine-Nanopartikel realisiert werden kann, die auf ihrer Oberfläche kovalent einen anti-CD3-Antikörper tragen, der gegen die T-Zell spezifische Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes gerichtet ist. Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie zeigten, dass dabei die Zellaufnahme dieser Wirkstoffträger von der Expression des durch den Antikörper erkannten Zielantigens auf der Oberfläche der Zielzellen ist. In Zellen mit besonders starker Expression des CD3-Epitops wurden Gelatine-Nanopartikel mit oberflächengebundenem anti-CD3-Antikörper zu einem sehr bedeutendem Ausmaß selektiv aufgenommen. In Kompetitionsexperimenten mit freiem anti-CD3-Antikörper konnte diese Aufnahme deutlich reduziert werden, was für die selektive Bindung und Internalisierung der CD3-Gelatine- Nanopartikel über den oberflächengebundenen Antikörper schließen läßt. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD3-Gelatine-Nanopartikel das Potential besitzen, als selektives Wirkstoffträgersystem für T-Zellen eingesetzt zu werden.
Transdermale Therapeutische Systeme (TTS) sind Arzneiformen, die über einen längeren Zeitraum eine kontrollierte Arzneistoffabgabe durch die Haut ermöglichen. Um ausreichende Permeationsraten zu erreichen, sind häufig hohe Arzneistoffkonzentrationen im Reservoir notwendig. In TTS, deren Arzneistoffkonzentration über der Sättigungskonzentration der Matrix liegt, neigen die Wirkstoffe dazu auszukristallisieren. Die Kristallisation stellt ein wichtiges Stabilitätsproblem bei der Entwicklung solcher Systeme dar, da die Bioverfügbarkeit negativ beeinflusst werden kann. Diese Studie zeigt, dass Kristallisationsprozesse in TTS mithilfe der isothermen Wärmeleitungsmikrokalorimetrie über eine Messzeit von 7 Tagen mit hoher Empfindlichkeit erfasst werden können, denn die Kristallisation stellt einen exothermen Prozess dar. Die mikrokalorimetrische Messkurve zeigte sowohl bei Placebo- als auch bei wirkstoffhaltigen Zubereitungen einen starken initialen, exothermen Wärmefluss, der über einige Tage langsam abfiel bis ein konstantes Wärmeflussplateau erreicht wurde. Der hohe initiale Wärmefluss entstand durch das Ausstanzen der Laminate und die damit verbundene mechanische Beanspruchung. Die Kristallisation wurde von den Stanzrändern ausgehend initiiert und war damit an den Schnittkanten auch stärker ausgeprägt als im Inneren der Laminate. An den Schnittstellen des TTS waren mikroskopisch wesentlich mehr Kristalle nachweisbar als in den nicht mechanisch beanspruchten Bereichen. Die messbare Arzneistoff-immanente Wärmemenge stieg mit erhöhtem Arzneistoffgehalt an, war aber über 7 Tage bei den E2-haltigen und NEA-haltigen TTS-Laminaten nicht proportional zum Arzneistoffgehalt, da die Kristallisation nach dieser Messzeit nicht beendet war. Dieses Ergebnis konnte durch die mit steigender Übersättigung beschleunigte Kristallisation erklärt werden, die für alle untersuchten Messreihen beobachtet wurde. Je höher die Arzneistoffkonzentration in den Laminaten war, desto stärker war auch die Triebkraft für Kristallisationsvorgänge. Das Kristallisationsende war rascher erreicht. War die Kristallisationsgeschwindigkeit dagegen über einen gewissen Konzentrationsbereich konstant oder war der Kristallisationsprozess während der Messzeit bereits beendet, so stieg die Arzneistoff-immanente Wärmemenge proportional zur erhöhten Arzneistoffkonzentration. Eine konstante Kristallisationsgeschwindigkeit wurde für NEA im Bereich von 4 bis 10 % beobachtet. Bei höherer Übersättigung verlief der Kristallisationsprozess allerdings ebenfalls beschleunigt. Die Kristallisationsgeschwindigkeitskonstante sowie der Avrami-Exponent als Parameter für den Kristallisationsmechanismus konnten anhand der mikrokalorimetrischen Daten berechnet werden, ebenso wie die Kristallisationsenthalpien in Höhe von -23,3 ± 1,2 kJ/mol für E2-hemihydrat, -22,8 ± 2,6 kJ/mol für NEA sowie -7,9 ± 0,95 kJ/mol für die 1:3- Mischung. Alle Kristallisationsvorgänge waren durch die hohe Viskosität der Matrix diffusionskontrolliert und zeigten ein eindimensionales Kristallwachstum. Bei der Mikrokalorimetrie handelt sich um eine unspezifische Methode, bei der der Ursprung der Wärmeeffekte durch zusätzliche Methoden aufgeklärt werden muss. Als weitere Untersuchungsmethoden bei der Kristallisation in transdermalen Systemen boten sich die Polarisationsmikroskopie und die Pulverröntgenbeugung an. Die DSC war ungeeignet. Im Vergleich zur Mikrokalorimetrie war die polarisationsmikroskopische Untersuchung von Kristallisationsprozessen jedoch wesentlich zeitaufwendiger, wobei sich die Empfindlichkeit als höher erwiesen hat. Die Mikrokalorimetrie detektierte im Vergleich zur Mikroskopie erst eine Kristallmenge von ungefähr 0,5 % zuverlässig. Die Pulverröntgenbeugung stellte im Vergleich zu Mikroskopie und Mikrokalorimetrie eine weniger empfindliche analytische Methode für die Erkennung von kristallinem organischen Material in einer polymeren amorphen Matrix dar. Während kleine Kristalle in den Polymerfilmen bereits mit bloßem Auge zu sehen waren, traten zum Teil keine Reflexe im Pulverdiagramm auf. Die Detektionsgrenze lag im Vergleich zur Mikroskopie bei ungefähr 1 bis 1,5 % Kristallen in der polymeren Umgebung. Dagegen ist die Pulverröntgenbeugung für verschiedene Kristalltypen sehr spezifisch. Sie erlaubt die Aufklärung von Strukturen sowie eine quantitative Auswertung der Kristallmengen in Mischungen, sofern die Kristalltypen bekannt sind. Mithilfe der Polarisationsmikroskopie und Pulverröntgenbeugung wurden die Kristallstrukturen der Arzneistoffe in der polymeren Matrix der TTS untersucht. Für Systeme, die nur einen der Arzneistoffe enthielten, wurde eine unveränderte Kristallisation in der Matrix in Form von E2-hemihydrat bzw. NEA beobachtet. Die Kombination von E2-hemihydrat und NEA veränderte die Kristallstruktur der gebildeten Kristalle im Vergleich zu den reinen Arzneistoffen und führte zur Ausbildung einer neuen Kristallstruktur in der Matrix, die sich in den Reflexlagen auch von der aus Ethylacetat kristallisierten unterschied. Sogar geringe E2-Konzentrationen führten zu einer deutlichen Veränderung der Kristallform und des Röntgenbeugungsmusters der NEA-Kristalle. Außerdem wurde der Kristallisationsprozess durch die Kombination der Hormone stark beschleunigt. Bei der neuen Kristallform handelte es sich um eine thermodynamisch weniger stabile Struktur, da die Kristallisationsenthalpie geringer war, allerdings war die Kristallisation kinetisch bevorzugt. Trotz der Unterschiede in der Empfindlichkeit der Methoden, die zur Bestimmung der Sättigungslöslichkeit angewendet wurden, stehen die erhaltenen Ergebnisse entsprechend den Detektionsgrenzen in guter Übereinstimmung, wobei es sich bei den ermittelten Werten von 1,5 % für E2-hemihydrat und 4 % für NEA unter Umgebungsbedingungen um die Sättigungslöslichkeit unter Kristallisationsbedingungen und nicht um die wahre Sättigungslöslichkeit handelt. Hohe Feuchtigkeit in der polymeren Matrix fördert die E2-hemihydrat- sowie NEA-Kristallisation durch die geringe Wasserlöslichkeit der Steroidhormone. Die Trocknungsbedingungen konnten die physikalische Stabilität der Pflaster stark beeinflussen, was eventuell auch durch die Ausbildung einer besser löslichen, wasserfreien Kristallform des Estradiols begründet sein könnte. Die Vorbehandlung der Laminate bei 80°C scheint eine gute Möglichkeit zu sein, die TTS vor Kristallisationsprozessen zu schützen, wobei bei der Lagerdauer ein Kompromiss zwischen der physikalischen Stabilisierung und der chemischen Zersetzung gefunden werden muss. Zusammenfassend wurde festgestellt, dass es sich bei der Mikrokalorimetrie um eine zeitsparende und effektive Methode für die Beurteilung einer Vorbehandlung bei 80°C sowie des Einflusses von verschiedenen Hilfsstoffen auf den Kristallisationsprozess der Arzneistoffe im TTS handelt. Die Mikrokalorimetrie ermöglichte dabei innerhalb von 7 Tagen die Klassifikation verschiedener Zusatzstoffe nach deren Effizienz, die Kristallisation in den Pflastern zu initiieren. Dagegen sind häufig viele Monate nötig, um ähnlich zuverlässige Ergebnisse mit der Polarisationsmikroskopie bzw. der Pulverröntgenbeugung zu erhalten. Die Mikrokalorimetrie stellt demnach eine interessante Methode für ein Hilfsstoffscreening und die Optimierung von Rezepturen dar.
Ziel dieser Arbeit war es, die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf Leukämiezellen von pädiatrischen Patienten mit Akuten Leukämien zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in vitro und erste in vivo Untersuchungen durchgeführt: 1. In vitro Untersuchungen Zuerst wurde eine durchflusszytometrische Methode optimiert zum Nachweis der Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf maligne Zellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien. Mit diesem durchflusszytometrischen Assay war es möglich, die Zytotoxizität auf maligne von der auf nicht maligne Zellen zu unterscheiden. Dies war unerlässlich, da in den frisch isolierten Leukämiezellen der Patienten bis zu 55% normale Lymphozyten enthalten waren. Darüber hinaus erlaubte diese Methode die simultane Bestimmung der Zell-Apoptose in jeder Probe. An Leukämie-Zelllinien wurde dieser multiparametrische Assay anschließend mit dem MTT-Assay verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Bestimmung von Zytotoxizitäten mit beiden Methoden an den Zelllinien Molt 4/8 und H9 gut korrelierte (r≥0,95). Für das Arbeiten mit Patientenmaterial wurde ausschließlich die durchflusszytometrische Methode angewendet, da in den Proben der Patienten die Differenzierung zwischen leukemischen Zellen und normalen Lymphozyten essentiell war. In den Leukämie-Zelllinien Molt4/8, H9 und K562 zeigte sich, dass Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität zeigte als Busulfan. In die Untersuchungen frischer Leukämiezellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien konnten 24 Proben unterschiedlicher Leukämien (cALL, reife B-ALL, reife TALL, AML) und unterschiedlicher Erkrankungszeitpunkte (bei Diagnose oder bei Rezidiv) eingeschlossen werden. In diesen Proben zeigte Treosulfan eine deutlich bessere Wirkung als Busulfan. Es wurde trotz des kleinen Patientenkollektivs deutlich, dass die T-ALL gegenüber der cALL sensitiver auf Treosulfan reagiert. Außerdem war die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan gegenüber der T-ALL signifikant höher als gegenüber c-ALL (Treosulfan: p=0,02, Busulfan: p=0,03). Die IC50-Werte stiegen vom Zeitpunkt der Diagnose (Median: Treosulfan: 11,45 μM, Busulfan: 96,45 μM) über die Progression (Median: Treosulfan: 45,95 μM, Busulfan: 253,75 μM) bis zum Rezidiv (Median: Treosulfan: 153,15 μM, Busulfan: 223,3 μM) hin an, und zwar um das 8-fache bei Treosulfan und das 2,5-fache bei Busulfan. Der Unterschied der Zytotoxizität von Treosulfan auf Leukämieproben zum Zeitpunkt der Diagnose gegenüber dem Rezidiv war statistisch signifikant (p=0,02). Für Busulfan ergab sich für diese Untersuchungszeitpunkte keinen signifikanten Unterschied (p=0,13). Vergleichend zu den Ergebnissen an frisch isolierten Leukämiezellen wurde die Wirkung von Treosulfan und Busulfan auf normale Lymphozytensubpopulationen und Stammzellen untersucht. Auch hier zeigte Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität im Vergleich zu Busulfan. Insgesamt reagierten normale Lymphozyten sensitiver auf die Alkylanzien im Vergleich zu den Leukämiezellen (Mediane IC50-Werte für Treosulfan und Busulfan auf Lymphozyten: 12,3 μM und 89,9 μM, auf Leukämieproben: 30,6 μM und 133 μM mit p=0,03 und p=0,02). In einem weiteren Experiment sollte die Interaktion von Treosulfan und Busulfan mit Fludarabin untersucht werden. Fludarabin ist ein Purin-Analogon, das in der Pädiatrie in Kombination mit Alkylanzien zur Chemo-Konditionierung eingesetzt wird. Bei der Inkubation von Fludarabin mit Treosulfan-Konzentration größer 1 μM war ein deutlicher Synergismus zu verzeichnen. Die Kombination von Fludarabin mit Busulfan ergab Antagonismus. 2. In vivo Untersuchungen Es wurde die zelluläre Immunrekonstitution bei pädiatrischen Patienten mit AML (n=9) nach allogener Knochenmarktransplantation überwacht. Ein Patient wurde mit Treosulfan konditioniert (n=1), die anderen Patienten (n=8) erhielten Busulfan zur Konditionierung. Die Rekonstitution der Leukozyten, B-Zellen, NK-Zellen und T-Helferzellen verlief in beiden Gruppen ähnlich. Ein signifikanter Unnterschied konnte für die Rekonstitution der CD3+CD8+ zytotoxischen T-Zellen gezeigt werden, die bei dem Patienten, der mit Treosulfan konditioniert wurde, signifikant niedriger war im Vergleich zur Busulfangruppe. Da bei dem Patienten, der Treosulfan erhielt, die CRP-Werte über einen längeren Zeitraum erhöht waren und Infektionen die Rekonstitution von zytotoxischen T-Zellen maßgeblich beeinflussen, bietet dies eine mögliche Erklärung für diesen Unterschied. Aussagen können jedoch nur mit einem größeren Patientenkollektiv getroffen werden.
Einen vielversprechenden Ansatz auf dem Gebiet der Entwicklung kolloidaler Arzneiträgersysteme stellen die proteinbasierten Nanopartikel dar, da sie biodegradierbar und nicht toxisch sind und eine Reihe möglicher Angriffspunkte zur kovalenten Bindung von Arzneistoffen und zur Oberflächenmodifikation aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Herstellungsprozeß von HSANanopartikeln und sein Einfluß auf die physikochemischen Eigenschaften des resultierenden Partikelsystems evaluiert. Durch Oberflächenmodifikation wurde eine Kopplung von Proteinen mittels bifunktionaler Crosslinker ermöglicht und die zelladhäsiven Eigenschaften des Trägersystems vermindert. Durch Kopplung funktioneller Proteine wurden die ersten Schritte in Richtung eines ligandenvermittelten DrugTargetings unternommen. Evaluierung des Herstellungsprozesses und Charakterisierung des resultierenden partikulären Systems Die Evaluierung des Desolvatationsprozesses von HSANanopartikeln ergab eine Abhängigkeit der Partikelgröße und der Partikelanzahl vom zugesetzten Desolvatationsmittel Ethanol. Die Quervernetzung des resultierenden Systems beeinflußte die Anzahl der freien Aminogruppen an der Partikeloberfläche: Je mehr Glutaraldehyd zugesetzt wurde, desto weniger Aminogruppen waren nachweisbar. Die Härtung der Partikel durch Einwirkung hoher Temperaturen führte ebenfalls zu stabilen Partikeln. Die Anzahl der verfügbaren Aminogruppen lag im Vergleich zu den Glutaraldeydquervernetzten höher. Die Art und das Ausmaß der Quervernetzung hatten keinerlei Einfluß auf die mittlere Partikelgröße. Das Zetapotential dagegen zeigte eine Tendenz, mit steigender Quervernetzung negativer zu werden. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit den Aminogruppen an der Oberfläche von GelatineA und BNanopartikeln verdeutlichte, daß HSANanopartikel signifikant mehr freie Aminogruppen an der Partikeloberfläche, und damit mehr Angriffspunkte zur kovalenten Kopplung und Oberflächenmodifikation aufweisen, als GelatineNanopartikel, wobei Gelatine ANanopartikel mehr als doppelt so viele Aminogruppen an der Oberfläche besitzen als Gelatine BPartikel. Die höchsten Aminogruppenzahlen zeigten die hitzedenaturierten HSANanopartikel. Einführung von Sulfhydrylgruppen an die Partikeloberfläche Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs Methoden zur Einführung von Thiolgruppen auf die Oberfläche von HSANanopartikeln evaluiert. Die effektivste Methode ergab sich aus der Kopplung von Cystamin mit dem Kopplungsreagenz EDC, gefolgt von einer reduktiven Spaltung der Cystamindisulfidbindungen und der Disulfidbrücken der HSAPartikelmatrix mit DTT. Bedauerlicherweise zeigte diese Partikelpräparation die höchste Toxizität der untersuchten Zubereitungen in der Zellkultur. Die Kopplung von LCystein mit EDC war aufgrund unerwünschter Nebenreaktionen wesentlich weniger effektiv. Die einfachste Art, Thiolgruppen einzuführen, war die reduktive Spaltung der Disulfidbrücken der HSAPartikelmatrix mit DTT. Doch Bindungsexperimente zeigten, daß diese Thiolgruppen zwar mit Ellmans Reagenz nachweisbar waren, aber zu Bindungszwecken wahrscheinlich aus sterischen Gründen nur in untergeordnetem Maße zur Verfügung standen. Die Verwendung von 2Iminothiolan (Trauts Reagenz) war eine im Vergleich zur Cystamin/EDCMethode einfache und leicht zu handhabende Methode zur Einführung von SHGruppen, allerdings mit relativ geringer Effizienz. Das Quenchen freier Glutaraldehydreste an der Partikeloberfläche mit Cystamin führte zu einem sehr niedrigen SHGruppengehalt, mit LCystein waren so gut wie keine Thiolgruppen nach der Umsetzung nachweisbar. Die SHGruppen wurden bei einer Lagerung bei 4°C mit einer Halbwertszeit von 28,2 Tagen abgebaut, unabhängig von der Art der SHGruppeneinführung. Die Reaktivität der SHGruppen dagegen nahm wesentlich schneller ab als ihre Nachweisbarkeit: Bereits am dritten Tag nach der SHGruppeneinführung lag die Bindungsrate von mit SHreaktiven Crosslinkern aktivierten Proteinen um 2030 % niedriger, verglichen mit dem ersten Tag. Durch Veränderung der Reaktionsparameter konnte bei allen Methoden die Anzahl der eingeführten Thiolgruppen kontrolliert werden. Durch die Einführung der SHGruppen zeigten die Nanopartikel eine deutlich höhere Mukoadhäsion. Oberflächenmodifikationen Das Ziel der Oberflächenmodifikation der HSANanopartikel war zum einen eine Positivierung des Zetapotentials, um die Bindung negativ geladener Arzneistoffe wie DNA über elektrostatische Wechselwirkungen zu ermöglichen. Die Umsetzung der Partikel mit EDC allein oder mit EDC und Cystamin bzw. Cholamin führte zu einer deutlichen Verschiebung des Zetapotentials in den positiven Bereich. Durch Veränderung der Cholamin bzw. Cystaminkonzentration war die Verschiebung des Zetapotentials steuerbar. Gleiches galt für die Umsetzung der Gelatine APartikel, allerdings waren hier deutlich geringere Konzentrationen zur Erlangung der gleichen positiven Zetapotentiale notwendig. Zum anderen sollte durch die Modifikation der Partikeloberfläche ein verändertes Verhalten hinsichtlich der Zelladhäsion der Partikel erzielt werden. Es zeigte sich eine verstärkte Zelladhäsion nach der Einführung weiterer Aminogruppen und nach der Einführung lipophiler Gruppen. Eine verminderte Zelladhäsion wurde durch eine Maskierung der Aminogruppen erreicht. Die besten Ergebnisse erbrachte hierbei die Umsetzung der HSANanopartikel mit Jodessigsäure. Bindung funktioneller Proteine Um zu überprüfen, ob funktionelle Proteine an das evaluierte Trägersystem unter Erhalt der Funktionalität gebunden werden können, wurden zunächst Enzyme über den bifunktionalen Crosslinker SulfoMBS kovalent gekoppelt. Analysen der Bindungsrate und der tatsächlichen enzymatischen Aktivität differierten zwar, doch ist dies wohl auf eine noch nicht hinreichend optimierte Analytik zurückzuführen. Eine enzymatische Aktivität der alkalischen Phosphatase und der bGalaktosidase war nach der Bindung an das Trägersystem eindeutig nachweisbar. Als weiteres funktionelles Protein wurde das Avidinderivat NeutrAvidin(TM) gewählt und mit SulfoMBS an Gelatine ANanopartikel gekoppelt. Durch die Bindung biotinylierter Antikörper konnte der Erhalt der Funktionalität des gebunden NeutrAvidins(TM) gezeigt werden. Die Konjugation eines biotinylierten, humanen CD3 Antikörpers an das NeutrAvidin(TM)konjugierte Partikelsystem führte zu einer selektiven Bindung des Trägersystems an primäre humane Lymphozyten. Auch eine Aufnahme des Trägersystems in die Zellen konnte gezeigt werden. Die Experimente zum Antikörpervermittelten Targeting konnten mit HSANanopartikeln nicht reproduziert werden, da HSAPartikel eine so starke Zelladhäsion zeigten, daß ein Targeting aufgrund des Antikörpers nicht mehr ersichtlich war. Erste Versuche mit oberflächenmodifizierten HSAPräparationen, wie beispielsweise einer Jodessigsäure Umsetzung, führten zu einer deutlich verminderten Zelladhäsion. Weitergehende Experimente zur Evaluierung dieses Effektes sind für die Weiterentwicklung dieses Trägersystems entscheidend.
Um das Potential von modernen Arzneistoffe wie Nukleinsäuren und ihren Analoga ausnutzen zu können und sie an ihren Wirkort ins Zellinnere bringen können, benötigt man Transportvehikel, da sie selbst nur über eine schlechte Zellmembrangängigkeit verfügen. Bei der Entwicklung zukunftsträchtiger Arzneiformen spielen biokompatible, kolloidale Trägersysteme, die zielgerichtet bestimmte Gewebe / Zellen ansteuern, eine große Rolle. Ihre Aufgabe ist es dem Wirkstoff zur Überwindung von Zellmembranen zu verhelfen, wobei gleichzeitig ein Schutz vor enzymatischem Abbau gewährleistet wird. Zur Erhöhung der Zell- und Gewebeselektivität können die Träger dann mit diversen Targeting-Liganden bestückt werden. Als Trägerstoff können verschiedenste synthetische und natürliche Polymere eingesetzt werden. Zum Einsatz kamen hier die beiden natürlichen Proteine Gelatine und Albumin, die untoxisch, biokompatibel und bioabbaubar sind. Die partikulären Strukturen wurden durch Lösungsmittelzusatz zu einer wässrigen Proteinlösung in einem Desolvatationsprozess gewonnen. Der Nukleinsäureeinschluss erfolgte adsorptiv und kovalent in die Polymermatrix oder kovalent an die Oberfläche. Als Drug-Targeting-Ligand wurden aufgrund ihrer großen Spezifität, Selektivität und Variabilität Antikörper eingesetzt. Durch chemische Oberflächenmodifikationen wurde die Voraussetzung geschaffen, biotinylierte Strukturen kovalent an die Nanopartikeloberfläche zu binden, so dass ein spezifisches Drug-Targeting-System entstand. Die kolloidalen, proteinbasierten Nanopartikel wurden hinsichtlich ihrer verschiedenen physikalischen Parameter analysiert. Neben den Parametern wie Größe, Zetapotential, Morphologie und Stabilität wurde auch die Zelltoxizität untersucht. Das Antikörper-beladene Trägersystem wurde auf seine Funktionalität und Effizienz in Zellkultur getestet. Albumin Nanopartikel: Zur Schaffung eines universell einsetzbaren Trägersystems wurden auf der Nanopartikeloberfläche reaktive SH-Gruppen eingeführt. Der Einsatz eines bifunktionalen Crosslinkers schuf die Möglichkeit mit Avidin ein zweites Protein, welches einen stabilen Komplex mit Biotin bildet an die Oberfläche zu binden. Man verfügt jetzt über ein 200 – 350 nm große, negativ geladene und untoxische Trägerpartikel, die mit vielen unterschiedlichen biotinylierten Liganden verbunden werden können. Sie verfügen weiterhin über eine ausreichende Stabilität im Zellkulturmedium. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Oligonukleotid-Beladung der Nanopartikel wurde auf drei verschiedenen Bindungswegen vollzogen. Die Wirkstoffeinbindung erfolgte zum Ersten adsorptiv über elektrostatische Wechselwirkungen in die Trägermatrix beim partikelformenden Prozess selbst. Die folgende Einführung von Thiolgruppen und die Kopplung mit Avidin über einen bifunktionalen Crosslinker wurde erfolgreich umgesetzt. Zweitens wurde eine kovalente Wirkstoffverknüpfung wieder über einen bifunktionalen Crosslinker entwickelt. Dafür wurden durch die Umsetzung mit einem Spacer die freien Aminogruppen des Trägermaterials aktiviert. Das verwendete Oligonukleotid wurde mit einer Thiolgruppe versehen und so an das aktivierte HSA gebunden. Das gebildete lösliche Konjugat wurde wieder durch Desolvatation zu Nanopartikeln umgesetzt. Als dritte Möglichkeit erfolgte eine oberflächliche Komplexbildung über das Avidin-System mit biotinylierten Phosphorothioaten. Gelatine-Nanopartikel: Für die Herstellung der Nanopartikel wurde ein doppeltes Desolvatationsverfahren eingesetzt. Die Oberflächenmodifikationen wurden analog zu den Umsetzungsbedingungen von HSA-NP durchgeführt. Die Bindungsfähigkeit des NeutrAvidins kann auch hier wieder durch die Kopplung an die Partikeloberfläche und den Aufreinigungsprozess beeinträchtigt sein. Daher wurde eine Nachweisreaktion mit einem fluoreszenzmarkierten Biotinderivat etabliert und die Funktionsfähigkeit des Avidins nachgewiesen. Um ein spezifisches Drug-Targeting-System zu etablieren, wurde der Träger zur Überwindung der Zellmembranen mit zwei verschiedenen biotinylierten Antikörpern ausgestattet. Eingesetzt wurde ein biotinylierter anti-CD3-AK, der von T-Lymphozyten internalisiert wird und ein biotinylierter anti-Her2neu-AK (Trastuzumab). Für die Bestimmung der gebundenen Antikörpermenge wurden zwei Methoden etabliert und lieferten für beide Antikörper eine Bindungseffizienz von nahezu 100%. In den anschließenden Zellkulturversuchen konnte eindrucksvoll eine rezeptorvermittelte Zellaufnahme in Lymphozyten und Brustkrebszellen über die an Gelatine-Nanopartikel gekoppelten, spezifischen Drug-Targeting-Liganden anti-CD3 und Trastuzumab gezeigt werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Nanopartikeln als Trägersysteme für nukleosidische Arzneistoffe. Ihr Einsatz verhindert z.B. die Degradierung der Nukleoside und verbessert ihre Aufnahme in Zellen. Die Partikel wurden aus humanem Serumalbumin (HSA) durch Desolvatation hergestellt und mittels Glutaraldehyd stabilisiert. Durch die Kopplung von Trastuzumab an die Partikeloberfläche können HER2-überexprimierende Brustkrebszellen spezifisch erreicht werden. Bindet der Antikörper an den HER2-Rezeptor, kommt es zu einer Internalisierung des Ligand-ezeptorkomplexes und an den Liganden gebundene Partikel werden zusammen mit dem Komplex in die Zellen aufgenommen. Die Kopplung von Trastuzumab an die Oberfläche der HSA-Nanopartikel über eine Thioetherbindung war sehr effizient und stabil.Die Stabilität von Partikelsystemen über lange Lagerzeiten kann durch Gefriertrocknung erhöht werden. Zur Gefriertrocknung trastuzumabmodifizierter Partikel wurden Trehalose, Sucrose und Mannitol in Konzentrationen bis 5% als Hilfsstoffe eingesetzt. Trehalose und Sucrose waren bereits in einer Konzentration von 3% in der Lage, die physikochemischen Eigenschaften der Partikel direkt nach der Gefriertrocknung zu erhalten, die Partikel waren aber nicht lagerfähig. Mit Mannitol war dies direkt nach der Gefriertrocknung auch bei einer Konzentration von 5% nicht in gleichem Umfang möglich, die Partikel konnten aber am besten gelagert werden. Als nukleosidische Wirkstoffe wurden In die Matrix von HSA-Nanopartikeln unter anderem Antisenseoligonukleotide (ASOs) eingebettet. Das inkorporierte ASO P12 gehört zur Gruppe der Phosphorothioate (PTOs) und bewirkt eine Reduktion der Polo-like Kinase 1 (Plk1) auf mRNA- und Proteinebene. Plk1 ist wesentlich an der Zellteilung beteiligt und wird in vielen Tumoren überexprimiert, eine Hemmung von Plk1 führt zur Apoptose der Zellen. Damit das PTO eine Wirkung zeigen kann, muss es intrazellulär aus den Partikeln freigesetzt werden. Deshalb wurden die Partikel enzymatisch abgebaut. Die Wiederfindung der PTOs aus der abgebauten Partikelmatrix betrug maximal 30% und war von der Menge des zur Partikelstabilisierung verwendeten Glutaraldehyds abhängig. Je mehr Glutaraldehyd verwendet worden war, desto schlechter war die Wiederfindung. Eventuell werden die PTOs durch Glutaraldehyd inaktiviert, indem es zu einer Quervernetzung untereinander oder mit Albuminmolekülen kommt. Dennoch konnte in Brustkrebszelllinien eine biologische Wirkung der PTO-beladenen Partikelsysteme gezeigt werden. P12-beladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt HER2-überexprimierende Zellen aufgenommen. Die Partikel reduzierten die Menge der Plk1-mRNA signifikant. Dies ging mit einer ebenfalls signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge einher. Die Folge der Plk1-Reduktion war eine Aktivierung der Caspasen 3 und 7, die die Induktion der Apopotose zeigte. Plk1 kann nicht nur durch PTOs, sondern auch durch Plasmid-DNA, die small hairpin RNA (shRNA) gegen Plk1 exprimiert, gehemmt werden. Die Plasmide blieben bei der Einbettung in die Partikelmatrix intakt, allerdings trat eine Umformung von der supercoiled in die lineare und zirkuläre Form auf. Auch plasmidbeladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt in HER2-überexprimierende Zelllinien aufgenommen und führten dort zu einer signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge. Als weiterer nukleosidischer Wirkstoff wurde noch eine siRNA gegen Plk1 in die HSA-Partikel inkorporiert. Mit siRNA-beladenen Nanopartikeln konnte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge beobachtet werden. Partikel aus HSA können nicht nur durch den Einsatz von Glutaraldehyd stabilisiert werden, eine thermische Quervernetzung der Partikelmatrix ist ebenfalls möglich. Die besten physikochemischen Eigenschaften PTO-beladener Partikel wurden bei einer Quervernetzungstemperatur von 105°C über 10 min erzielt. Wurden diese Partikel enzymatisch abgebaut und das PTO aus der Partikelmatrix bestimmt, so konnten bis zu 80% des eingebetteten PTOs intakt detektiert werden. Allerdings waren die Partikel weniger stabil als chemisch quervernetzte Partikel. Bei einer Einlagerung über 6 Wochen stieg der Partikeldurchmesser an, 25% des eingebetteten P12s wurden aus der Matrix freigesetzt und bis zu 20% des Trastuzumabs wurden von der Oberfläche abgelöst. Dennoch war die Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge in der Zellkultur signifikant und mit der von chemisch stabilisierten Partikeln vergleichbar. Trastuzumabmodifizierte HSA-Nanopartikel stellen somit ein geeignetes Trägersystem für nukleosidische Arzneistoffe dar und führen zu einer spezifischen Wirkung in HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen.
Nanopartikuläre Arzneistoffsysteme sind ein viel versprechender Ansatz die speziellen Anforderungen, die an eine Arzneiform gestellt werden, zu erfüllen. Mit ihnen scheint das lang verfolgte Ziel der Pharmaforschung, das gezielte Transportieren ("Drug-Targeting") und das kontrollierte Freisetzen des Arzneistoffs am Wirkort ("Controlled Release") und damit das Minimieren unerwünschter Nebenwirkungen, in greifbare Nähe zu rücken. In der vorliegenden Arbeit konnte durch verschiedene Versuchsansätze in der präklinischen Testung der gezielte Wirkstofftransport zielgerichtet-modifizierter Nanopartikel (NP) auf humanem Serumalbumin (HSA)-Basis sowohl für das spezifische Tumor-Targeting als auch für die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) gezeigt werden. Die NP für das spezifische Tumor-Targeting waren mit dem Zytostatikum Doxorubicin beladen und mit dem tumorspezifischen Liganden Trastuzumab für ein Mammakarzinom-Zellen-Targeting oder DI17E6 für ein Melanom-Zellen-Targeting modifiziert. Ihre zielgerichtete Funktionalität konnte an verschiedenen Target-exprimierenden-Zelllinien gezeigt werden. Dabei konnte ihre spezifische zelluläre Bindung, Aufnahme und subzellulären Verteilung verifiziert werden. Die Ligand-modifizierten NP wurden bei diesen Untersuchungen spezifisch in die Zielzellen aufgenommen, während die unmodifizierten Kontroll-Partikel unspezifisch an der Zellmembran klebten. Die Freisetzung des Doxorubicins in einer biologisch aktiven Form konnte anhand entsprechender Zellviabilitäts-Assays gezeigt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der nanopartikulär transportierte Wirkstoff über den Rezeptor-internalisierenden Aufnahmeweg nicht in den Endosomen oder Lysosomen akkumulierte und damit inaktiv war, sondern dass er in wirksamer Form freigesetzt wurde. Als Besonderheit wurde mit DI17E6 für das spezifische Melanom-Zellen-Targeting ein Antikörper als ziel-orientierter Ligand eingesetzt, der zusätzliche anti-tumorale Eigenschaften hat, die bei der Ankopplung an die NP-Oberfläche erhalten werden sollten. Durch speziell entwickelte in vitro Assays, die auf diese Eigenschaften abzielten, konnte der Erhalt der biologischen Wirksamkeit des Antikörpers bestätigt werden. Mit derartigen nanopartikulären Formulierungen, basierend auf biologisch abbau¬barem HSA, modifiziert mit entsprechenden zielgerichteten Liganden und anti-tumoralen Wirkstoffen, sollte aufgrund der hier gezeigten präklinischen Daten eine spezifische Tumortherapie möglich sein. Zum Überwinden der BHS wurden NP getestet, die mit Apolipoprotein E (ApoE) modifiziert waren. Dabei handelte es sich zum einen um leere NP für Aufnahmemechanismus-Studien und zum anderen um Obidoxim-beladene NP für Transportstudien. Bei Obidoxim handelt es sich um einen Vertreter der Stoffklasse der Oxime. Diese werden als Antidote bei Organophosphat (OP)-Vergiftungen eingesetzt. Oxime können die nach einer OP-Vergiftung inhibierte lebensnotwendige Acetylcholinesterase (AChE) reaktivieren. Da Oxime die BHS aber kaum überwinden können, wird die in den zentralnervösen Kompartimenten inhibierte AChE nicht in therapeutisch ausreichendem Maß erreicht. Daher sollte beispielhaft Obidoxim nanopartikulär-vermittelt über die BHS transportiert werden. Für beide Formulierungen konnte die spezifische zelluläre Bindung, Aufnahme und die subzelluläre Verteilung sowie ihre für ein BHS-Targeting kompatiblen, untoxischen Eigenschaften gezeigt werden. Mit den ApoE-modifizierten unbeladenen NP konnte durch verschiedene Koinkubations- und Hemmexperimente eindeutig die Beteiligung der "Low Density Lipoprotein" (LDL)-Rezeptor-Familie, und besonders des "Low Density Lipoprotein Receptor Related Protein" (LRP), bei der spezifischen ApoE-vermittelten NP-Aufnahme gezeigt werden. Dabei ließ sich die NP-Aufnahme auf zwei Wegen hemmen. Zum einen konnte von der zellulären Seite aus der beteiligte Aufnahme-Rezeptors mit dem "Receptor Associated Protein" gehemmt werden, wodurch eine spezifische ApoE-vermittelte NP-Aufnahme über eine Rezeptor-Bindung verhindert wurde. Zum anderen konnte aber auch, durch Blockade des ApoE auf der Partikeloberfläche mittels löslicher Fragmente des LRP, die ApoE-vermittelte NP-Aufnahme von nanopartikulärer Seite gehemmt werden. Durch die Kenntnis des Aufnahmemechanismus der nanopartikulären Formulierungen sollte es für zukünftige Entwicklungen im breiten Feld der BHS-Forschung möglich sein, sehr spezifische und effektivere Carrier maßzuschneidern. Zu Untersuchungen des Wirkstofftransports wurden frisch isolierte porcine Gehirnkapillarendothel-Zellen im Transwell-System als adäquates in vitro BHS-Modell etabliert und eingesetzt. Für den Nachweis des tatsächlichen Obidoxim-Transports wurde ein biologischer Assay entwickelt, der gemäß der therapeutischen Funktion von Oximen nach OP-Vergiftungen auf die Reaktivierung OP-vergifteter AChE abzielte. Es konnte gezeigt werden, dass nanopartikuläre Formulierungen tatsächlich einen verbesserten Transport von Obidoximen gegenüber freiem Obidoxim in einem in vitro BHS-Modell vermitteln. Diese nanopartikulären Transportsysteme stellen daher ein bisher einzigartiges, viel versprechendes Hilfsmittel zum Transport von Oximen über die BHS dar. Durch die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen konnte insgesamt gezeigt werden, dass NP auf HSA-Basis für einen zielgerichteten Wirkstofftransport geeignet sind und aufgrund ihrer biokompatiblen, bioabbaubaren Eigenschaften einen viel versprechenden Ansatz für die zukünftige Pharmaforschung darstellen.
Optimierung Apolipoprotein-modifizierter Albumin-Nanopartikel zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke
(2007)
Das Gehirn höherer Säugetiere ist durch die Blut-Hirn-Schranke vor dem Eindringen toxischer und schädlicher Substanzen geschützt. Allerdings bildet diese Barriere auch ein Hindernis für die gezielte medikamentöse Therapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel Alzheimer, Gehirntumore oder Parkinson. Leider sind nur wenige potentielle Arzneistoffe für die Therapie dieser Krankheiten in der Lage die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Somit stellt die Blut-Hirn-Schranke einen limitierenden Faktor für die Arzneimitteltherapie dar. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Herstellung, Charakterisierung, in vitro und in vivo Testung Liganden-modifizierter Nanopartikel auf Proteinbasis zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke. Als Ligand wurde das Apolipoprotein E, ein Bestandteil von physiologisch vorkommenden HDL, VLDL und LDL-Partikel, verwendet, welches sich in vorangegangenen Untersuchungen als potentieller Ligand zum Transport von Nanopartikeln ins Gehirn erwiesen hat. Diese so mit Apolipoprotein modifizierten Nanopartikel wurden mit dem Modellarzneistoff Loperamid, einem nicht gehirngängigen Opioid, beladen. Diese Zubereitung wurde Mäusen injiziert und der analgetische Effekt mittels des Tail-Flick-Tests bestimmt. Um auch eine therapeutische Anwendung zu erzielen, wurden Apolipoprotein modifizierte Partikel beladen mit dem Zytostatikum Doxorubicin entwickelt und die chemotherapeutische Effizienz an Gehirntumor tragenden Ratten getestet.