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Klonierung, Expression und Aufreinigung von Derivaten des α-Amylase-Inhibitors Parvulustat
(2011)
- Parvulustat ist ein kleines Protein (8,2 kDA), das aus dem Bodenbakterium Streptomyces parvulus sekretiert wird. Es ist ein saures Polypeptid mit einem isoelektrischen Punkt von 4,49 und inhibiert spezifisch α-Amylasen (Ki = 9 x 10-12). In der vorliegenden Arbeit sollen neben der Isotopenmarkierung des Parvulustats PL-Mutanten mittels PCR-Mutagenese und DNA Rekombinationstechnick hergestellt werden. Zur Charakterisierung und Strukturbestimmung der Mutanten werden größere Mengen des jeweiligen Proteins benötigt, wofür wiederum ein effektives Expressionssystem bereitstehen muß. Ein Expressionssystem besteht aus einem Wirtsorganismus der seinen Protein-Biosynthese- Apparat zur Verfügung stellt und einem Vektor (Plasmid) der das Zielgen trägt. Im Falle des Parvulustats und seiner Mutanten bietet sich der gut charakterisierte Stamm Streptomyces lividans TK 24 (Hopwood et al, 1985) als Wirtsorganismus an. Der Inhibitor wird in ihm als Vorläuferprotein mit Signalpeptid als Transportsignal (Leader) gebildet. Da dieses Bakterium keine äußere Membran besitzt, wird der Inhibitor direkt ins Kulturmedium ausgeschleust. Dabei wird das Signalpeptid durch die Signalpeptidase abgespalten. Das Strukturgen wird zuerst im Klonierungsplasmid pSH09 in E. coli vervielfältigt, bevor es mit den Enzymen EcoRI und SpeI geschnitten wird, um in den Expressionsvektor pSH017 integriert zu werden. Dieser Shuttlevektor trägt genauso die gewünschten Restriktionsschnittstellen, SpeI und EcoRI, die die paßgenaue Ligation des rekombinanten Strukturgens mit den funktionellen Elementen erlauben. Nach erfolgtem Einbau des Zielgens in das neue Vektorkonstrukt kann dieser Expressionsvektor leicht in den Wirtsorganismus eingebracht werden und sich dort vermehren. Nach Klonierung der mutierten Parvulustatsgene in den Expressionsvektor werden die damit transformierten Zellen auf R2YE-Platten aufgebracht und bei einer Temperatur zwischen 20 und 28°C je nach PL-Mutanten inkubiert. Zur Selektion wird Thiostrepton verwendet. Nach Transformation und Vermehrung geeigneter Wirtszellen wird das klonierte Gen transkribiert. Durch anschließende Translation der gebildeten mRNA in der Wirtszelle entsteht das gewünschte Protein in großen Mengen. Zur Überprüfung der Aktivität der einzelnen Mutanten steht der qualitative α-Amylase-Plattentest zur Verfügung, wobei die aktiven Mutanten einen blauen Hemmhof bilden (siehe Abbildung 24). Der blaue Jod-Stärke-Komplex weist, bei gleichzeitigem Vorhandensein von α-Amylase, auf nicht abgebaute Stärke und damit indirekt auf die Produktion des α-Amylase-Inhibitors hin. Da das Parvulustat von den Bakterien ins Medium abgegeben wird, besteht die Abtrennung der Zellen durch Zentrifugation des Kulturmediums. Es folgen Ammoniumsulfatfällung des Überstandes, Auftragung auf PAGE und präparative HPLC, nach der reines, einheitliches Protein isoliert werden konnte.
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Expression und Charakterisierung des Parvulustat Proteins und seinen Derivaten
(2010)
- Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus, das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert: · Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen, dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0 und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt. In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur, was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al., Theoretischer Teil -4- 2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur. · Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm: 79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA weist eine leicht verringerte Aktivität auf. Tabelle 2.1: ... Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung des Parvulustats Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b- Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen. Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen. · Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A, P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1). Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten. Theoretischer Teil -6- Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt. · Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden. Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes 70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle 70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt. Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die Proteinstabilität zu bekommen. Theoretischer Teil -7- Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus (Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions- Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.
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Untersuchungen zur Regulation und Funktion durch HIV-1-Infektion differentiell exprimierter zellulärer Gene
(2007)
- Die Replikation und Pathogenese von HIV ist in hohem Maße von zellulären Faktoren abhängig. Das Virus muss einerseits die protektiven und antiviralen Abwehrmechanismen der Wirtszelle umgehen können und gleichzeitig ist seine Replikation an die Nutzung zellulärer Faktoren adaptiert. Neben der Interaktion mit konstitutionell exprimierten zellulären Proteinen bewirkt das HI-Virus auch eine transkriptionelle Regulation zellulärer Gene, um sich einen für seine Replikation vorteilhaften Funktionszustand der Wirtszelle zu schaffen. Durch eine HIV-Infektion differentiell exprimierte Gene stellen daher potentielle Kandidatengene zur Identifizierung essentieller Wirtsfaktoren oder zellulärer Restriktionsfaktoren der HIV-Replikation dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die durch HIV-Infektion differentiell regulierten Gene LEREPO4, GLiPR, SCC-112 und Moesin auf eine mögliche Funktion bei der HIV-Replikation analysiert. Dabei wurden diese durch RNA Interferenz (RNAi) im Kontext einer HIV-Infektion reprimiert. Als zelluläres Modellsystem wurden P4-CCR5-Zellen verwendet, bei denen eine Infektion mit dem Virusstamm HIV-1Bru eine Induktion der Gene LEREPO4, GLiPR und Moesin sowie eine Repression von SCC-112 bewirkte. Die RNA-Interferenz vermittelte Suppression dieser Gene erfolgte durch Applikation von synthetischen siRNA Oligonukleotiden oder durch intrazelluläre Expression von short hairpin RNAs (shRNA). Durch den Einsatz von shRNAs konnte jedoch unter den vorliegenden Versuchsbedingungen nur eine unzureichende Gensuppression erreicht werden. Aus diesem Grund wurden synthetische siRNA Oligonukleotide verwendet. Es konnte eine deutliche Reduktion der jeweiligen Zielgene bewirkt werden, ohne dass nennenswerte Effekte auf den Phänotyp und die Viabilität der Zellen beobachtet wurden. Der Einfluss der siRNA-vermittelten Gensuppression auf die HIV-Replikation wurde durch Infektion der Zellen ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass die Depletion von GLiPR und LEREPO4 eine deutliche Inhibition der HIV-Replikation bewirkte. Das Ausmaß der Inhibition war ähnlich ausgeprägt, wie durch Verwendung einer bereits publizierten, gegen das virale Gen p24 gerichteten siRNA. Die Depletion von SCC-112 hatte im Gegensatz hierzu keine eindeutige Wirkung auf die HIV-Replikation, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass seine Repression während einer HIV-Infektion ein unspezifischer bzw. sekundärer Effekt ist. Die siRNA-vermittelte Suppression von Moesin führte zu einem unerwarteten Ergebnis, da eine deutliche Steigerung der HIV-Replikation im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wurde. Damit konnte erstmals belegt werden, dass Moesin nicht für die HIV-Replikation benötigt wird, wie es durch andere Arbeiten postuliert wurde. Diese Annahme begründete sich auf der Beobachtung, dass Moesin in Viruspartikel inkorporiert wird. Daher wurde eine Beteiligung an der Zusammenlagerung oder Abschnürung viraler Partikel vermutet. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse lassen vermuten, dass LEREPO4 und GLiPR notwendige Faktoren der HIV-Replikation sind, wohingegen Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln scheint. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Wirkung auf die HIVReplikation sind jedoch weitgehend unklar. Da die Proteine LEREPO4, SCC-112 und GLiPR nicht oder nur unzureichend charakterisiert sind, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit zelluläre Funktionen dieser Proteine zu ermitteln, um Rückschlüsse auf ihre Funktion bei der HIV-Replikation zu gewinnen. Es konnten polyklonale Antikörper gegen LEREPO4 generiert werden, mit denen eine Bestimmung der zellulären Lokalisation möglich war. Mittels Co-Immunopräzipitation wurde die Interaktion von LEREPO4 und TRAF-2 nachgewiesen. Die Bestimmung des Einflusses von LEREPO4 auf die NF-κB-Aktivierung lässt vermuten, dass LEREPO4 an der TRAF-vermittelten Signaltransduktion beteiligt ist. Untersuchungen zur Funktion von GLiPR zeigten, dass es sich möglicherweise um ein sekretorisches Protein handeln könnte, wie durch den fluoreszenzmikroskopischen Nachweis eines GLiPR-EGFP-Fusionsproteins in HeLa-Zellen ermittelt wurde. Weiterhin konnte mittels Annexin-V-Färbung und TUNEL-Assay belegt werden, dass eine exogene Expression des GLiPRs in HeLa Zellen zu einem deutlichen Anstieg der Apoptoserate führte. Zusätzlich wurden für jedes Protein Genexpressionsprofile nach siRNA vermittelter Repression mittels Microarray-Analyse erstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LEREPO4 und GLiPR mögliche Kofaktoren der HIV-Replikation darstellen. Im Gegensatz hierzu scheint Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln. Auf Grundlage der in dieser Arbeit ermittelten Daten können weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden, um die genaue Funktion der oben genannten Proteine bei der HIV-Replikation zu klären.
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Isolation und Strukturaufklärung von marinen Naturstoffen aus Evertebraten der Nordsee, Arktis und Antarktis
(2004)
- In der vorliegenden Arbeit wurden Sekundärmetabolite aus marinen Wirbellosen der Nordsee, arktischen und antarktischen Gewässern untersucht. Ausgehend von Untersuchungen zur marinen chemischen Ökologie von Haliclona viscosa und physiologischen Effekten auf die Kieme der Krabbe Carcinus maenas wurden verschiedene Alkaloide und Cholesterole isoliert (siehe Abbildung 25). Vier unbekannte Alkaloide konnten erstmalig aus Haliclona viscosa isoliert werden. Sie leiten sich von 3-Alkylpyridin-Alkaloiden ab, die für Schwämme der Gattung Haliclona charakteristisch sind. Die Strukturaufklärung erfolgte durch den Einsatz von NMRSpektroskopie und Massenspektrometrie. Die symmetrischen bzw. pseudo-symmetrischen Eigenschaften erschwerten im besonderen Maße die Strukturaufklärung. Die Isolation von Haliclamin C und D sowie Viscosalin ermöglichte es, daß für sie ökologische Funktionen nachgewiesen werden konnten [33, 34], die dem Schwamm Haliclona viscosa in seinem Habitat Vorteile im Kampf um das Überleben bringen. Viscosamin ist das erste natürlich vorkommende zyklische Trimer eines 3-Alkylpyridin-Alkaloids, daß aus einer marinen Umgebung stammt. Es schließt eine Lücke zwischen monomeren, dimeren und polymeren 3-Alkylpyridin-Alkaloiden. Aus dem bisher noch nicht chemisch untersuchten Borstenwurm Laetmonice producta, konnte Homarin isoliert werden [81-84]. Homarin zeigte einen bisher unbekannten physiologischen Effekt auf die Kieme eines potentiellen Räubers [35]. Ob Homarin aufgrund seiner physiologischen Wirkung den Borstenwurm vor z.B. räuberischen Krebstieren schützen kann, muß noch mit weiteren Versuchen geklärt werden. Enthält 3 Art. aus versch. Zeitschr.: 1 Christian A. Volk and Matthias Köck: Viscosamine: The First Naturally Occuring Trimeric 3-Alkyl Pyridinium Alkaloid ; 2 Christian A. Volk, Heike Lippert, Ellen Lichte, and Matthias Köck: Two New Haliclamines from the Arctic Sponge Haliclona viscosa, European Journal of Organic Chemistry 2004, im Druck ; 3 Christian A. Volk and Matthias Köck: Viscosaline: New 3-Alkyl Pyridinium Alkaloid from the Artic Sponge Haliclona viscosa, Organic & Biomolecular Chemistry 2004, im Druck
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Ansätze zur Korrektur/Eliminierung von Punktmutationen in Nukleinsäuren
(2002)
- In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Ansätze zur Korrektur/Eliminierung von Punktmutationen in Nukleinsäuren untersucht. Im ersten Ansatz wurden chimäre RNA/DNA-Hybride zur Korrektur von einer Punktmutation im p22phox-Gen ausgetestet, während im zweiten Ansatz ein „Hammerhead“-Ribozym zur Eliminierung von mutierter N-ras-RNA untersucht wurde.
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Selektion von RNA-Aptameren gegen HIV
(2006)
- An den Folgen von AIDS sind bisher fast 20 Millionen Menschen gestorben. Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte erstmals die Viruslast bei gleichzeitiger Erhöhung der CD4-Lymphozytenzahl effizient erniedrigt werden. Dadurch konnte zwar eine Kontrolle der Virusreplikation und damit verbunden eine längere Überlebenszeit erreicht werden, jedoch ist eine vollständige Eradikation des Virus bisher nicht möglich. Hohe Behandlungskosten, Nebenwirkungen der antiviralen Substanzen, ihre unzureichende Wirkung in manchen Körperkompartimenten und die rasche Verbreitung resistenter Viren schränken die Effektivität von HAART ein. Alternative Therapieformen zielen in den letzten Jahren verstärkt auf die HIV-Eintrittshemmung durch Inhibition der Membranfusion von Virus und Wirtszelle („Fusionsinhibitoren“). Peptide, die sich aus der „heptad repeat“ Region 2, HR2, des gp41 ableiten (C-Peptide), sind äußerst wirksame antivirale Substanzen. 2003 wurde T-20, ein 36 Aminosäure langes C-Peptid, als erster Fusionsinhibitor zugelassen. Sein breiter Einsatz ist jedoch aufgrund rascher Resistenzbildung, mangelnder oraler Verfügbarkeit, einer äußerst kurzen Serumhalbwertszeit sowie daraus resultierender hoher Therapiekosten limitiert. Aufgrund dessen sollte in der vorliegenden Arbeit mit der Entwicklung von RNA-Aptameren als HIV-Fusionsinhibitoren ein neuer therapeutischer Ansatz etabliert werden. Zur Isolierung dieser RNA-Aptamere wurden zwei hoch komplexe RNA-Bibliotheken in manuellen sowie automatisierten Selektionen gegen verschiedene Zielstrukturen auf dem HIV-1 gp41 mit Hilfe der SELEX-Technologie selektiert. Der Wirkmechanismus der isolierten RNA-Aptamere sollte analog zu den gp41 HR-abgeleiteten Peptiden auf der Hemmung der Ausbildung des Sechs-Helix-Bündels als fusionaktive Struktur beruhen. So sollten die RNA-Aptamere die Ausbildung der zentralen N coiled-coil Struktur verhindern (Selektion gegen HR1-Peptide) oder die Anlagerung der HR-2 Domänen an die konservierten hydrophoben Furchen des zentralen N coiled-coils inhibieren (Selektion gegen HR2-Peptide). Die gewählten Zielstrukturen wurden entweder als freie synthetische Peptide oder membrangebunden auf der Oberfläche von humanen T-Zellen präsentiert. Um die Selektion von serumstabilen Aptameren zu gewährleisten, wurden die RNA-Aptamere unter Einsatz von 2’-F- oder 2’-NH2-modifizierten Pyrimidinen transkribiert. Nach initialen Selektionsrunden wurden die isolierten Aptamerfraktionen in einer „single-round infection“ unter Einsatz von HIV-Pseudotypvektoren auf spezifische Inhibition des Eintritts von HIV in die Zielzellen analysiert. Die isolierten RNA-Aptamere waren in der Lage, den HIV-Eintritt zu inhibieren, ihre Wirksamkeit war allerdings im Vergelich zu der naiven Bibliothek gering. Nach Durchführung von verschiedenen Reifungsstrategien, um die Affinität der vorselektieren RNA-Fraktionen zum jeweiligen Zielepitop zu erhöhen, konnte die inhibitorische Wirkung der gereiften RNA-Fraktionen auf das 10Fache im Vergleich zu der Urspungsbibliothek verbessert werden. Die wirksamste RNA-Fraktion, 435UU, wurde aus einer Selektion einer aminomodifizierten N30 RNA-Bibliothek gegen das membranverankerte Fusionsprotein M435, bestehend aus gp41 C46 und dem membranproximalen HIV-Linker, und anschließender Kompetiton mit dem 2F5 Antikörper gewonnen. Die 435UU RNA-Fraktion konnte den Eintritt von HIV mit einer IC50 ≈ 200 nM spezifisch hemmen. Weiterhin konnte die spezifische Fusionsinhibition der 435UU Aptamerfraktion in einem Zell-Zellfusionsassay unter Einsatz von HIV env exprimierenden Zellen und einer humanen T-Zelllinie demonstriert werden. Die Affinität der 435UU-Fraktion wurde in einem Gelmobilitätsversuch bestimmt. Die moderate HIV-Eintrittshemmung beruhte auf einer schwachen Bindung (Kd ≈ 750 nM) an das Zielepitop auf dem gp41. Die Analyse von Einzelaptameren aus der 435UU RNA-Population ergab keine signifikanten Unterschiede in ihrem HIV-Neutralisationspotential. Des Weiteren konnten nur wenig gemeinsame Primärstrukturmotive bestimmt werden. Der Gehalt an inkorporierten Pyrimidinen in den 435UU-Einzelaptameren war allerdings mit ca. 70% vergleichsweise hoch. Unter Einsatz von randomisierten RNA-Transkripte mit definiertem Pyrimidingehalt konnte festgestellt werden, dass tendenziell ein höherer Gehalt an NH2-Pyrimidinen die HIV-Neutralisation fördert. Allerdings konnte keine eindeutige Korrelation zwischen der Bindung an das C46-HIVLinker Fusionskonstrukt und dem Pyrimidingehalt der Transkripte ermittelt werden. Die Sekundärstukturvorhersage ergab keine strukturelle Verwandtschaft unter den 435UU-Einzelaptameren noch konnten klar definierte Sekundärstrukturmotive gefunden werden. Die Selektion der 435UU-Aptamerfraktion erfolgte deshalb nich allein aufgrund ihres hohen Pyrimidingehaltes. Ein direkter Vergleich der 435UU Aptamerfraktion mit dem bisher einzigen RNA-Eintrittsinhibitor, einem anti-gp120 RNA-Aptamer, ergab zwar eine geringfügig schwächere HIV-Inhibition, jedoch ein wesentlich breiteres Wirkspektrum der isolierten anti-gp41 RNA-Aptamere wahrscheinlich durch ihren hoch konservierten Wirkmechanismus. Schlussendlich könnte die Wahl der Präsentation der Zielstrukturen sowie der Selektionsdurchführung die Gewinnung von RNA-Aptameren mit moderater Affinität fördern und gleichzeitig zum Verlust von hoch affinen RNA-Strukturen führen. In nachfolgenden Selektionen sollte deshalb die Selektionsstringenz erhöht sowie gegen membrangebundene Zielstrukturen selektiert werden, die die tatsächliche native gp41 Konformation darstellen.
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Entwicklung und Charakterisierung von selbstdeletierenden retroviralen Cre/loxP-Vektoren zum Einsatz in der Gentherapie
(2002)
- Die somatische Gentherapie ist eine neuartige Therapieform, bei der Gensequenzen in Zielzellen eingebracht werden, um die verschiedensten Defekte auf molekularer Ebene zu beheben. Für die Entwicklung von Vehikeln, mit denen dieser Gentransfer effizient durchzuführen ist, werden in vielen Studien modifizierte Retroviren verwendet. Mit Hilfe des Transport- und Integrationsmechanismus der Retroviren ist es möglich das genetische Material stabil in das Genom der Zielzellen zu integrieren. Im Hinblick auf eine lebenslange Heilung bestimmter Erbkrankheiten können die retroviralen Vehikel auch zum Gentransfer in Stammzellen verwendet werden. Eine wichtige Rolle spielt die stabile Genexpression der eingeschleusten Sequenzen, um einen Therapieerfolg auf lange Sicht zu erreichen. In vielen Studien erfolgte jedoch eine Erniedrigung der Genexpression nach mehreren Wochen und auch das Ausbleiben der Transkription oder Translation des therapeutischen Gens konnte beobachtet werden. Das Abschalten therapeutischer Gene wird meist durch zelluläre Mechanismen hervorgerufen, hierzu gehören Methylierungen bestimmter Chromosomenabschnitte oder die Bindung von Repressormolekülen an Promotorregionen. Die Sequenzumgebung mit der das therapeutische Genmaterial in das Genom der Zielzellen integriert, ist somit besonders wichtig. Die viralen Sequenzen, die zum Einschleusen und für die Integration des therapeutischen Gens notwendig sind, tragen oft erheblich zur Expressionshemmung bei. Ein retroviraler Vektor, der nach Integration der proviralen DNA alle nicht benötigten viralen Sequenzen selbständig deletiert, würde störende Einflüsse durch umgebende Sequenzen vermindern. Das therapeutische Gen verbliebe mit wenigen viralen Sequenzen in der Zelle. Ein System, das nach Integration des therapeutischen Gens alle nicht erwünschten viralen Sequenzen selbständig und gezielt entfernt, stellt das entwickelte Cre/loxPVektorsystem dar. Dieser retrovirale Vektor enthält ein spezifisches Rekombinationssystem, das nach Integration der proviralen DNA in das Genom einer Zelle alle nicht benötigten viralen Sequenzen selbständig deletiert. Das therapeutische Gen verbleibt mit wenigen Sequenzen im Zielzellgenom. Störende Einflüsse durch transkriptionelles Silencing oder Translationshemmung durch umgebende Sequenzen werden damit vermindert. Die Anordnung der Gene und Sequenzen zur Entwicklung eines selbstdeletierenden Cre/loxP-Vektors wurde für die stabile Expression eines Markergenproduktes untersucht. Das modifizierte Gen des Nervenwachstumsfaktors LNGFR (LNGFR, engl. – Low Affinity Nerve Growth Factor Receptor) diente anstelle eines therapeutischen Gens als Modell für eine Proteinexpression in verschiedenen Zielzellen. In dieser Studie wurde ein konventionelles retrovirales Vektorsystem mit den entwickelten Cre/loxP-Vektoren verglichen. Beide Vektorsysteme integrierten das LNGFRD-Gen zusammen mit den nötigen viralen Sequenzen in das Genom der Zielzellen. Nach Integration des konventionellen Vektors blieb die Sequenzumgebung des LNGFRD-Gens erhalten. Durch das Cre/loxPVektorsystem konnten die störenden viralen Sequenzen durch den spezifischen Rekombinationsmechanismus entfernt werden und nur die LNGFRD-Expressionskassette verblieb mit wenigen Elementen im Genom der Zielzellen. Mit beiden Vektorsystemen konnte eine Expression des LNGFD-Rezeptors erreicht werden, wobei die zu erreichende Expressionshöhe des Rezeptor mit dem Cre/loxP-Vektorsystem zum Teil erhöht war, im Vergleich zum Kontrollsystem. Der Anteil an Zellen, die nach Gentransfer den LNGF-Rezeptor exprimierten, war nach einigen Modifikationen ebenfalls vergleichbar mit dem System des konventionellen Gentransfervektors. Die Verwendungsmöglichkeiten des entwickelten Cre/loxPVektorsystems sind auf vielen Gebieten denkbar. Retrovirale Vektoren werden zum einem zur Behandlung von monogenen Erbkrankheiten verwendet, bei denen das therapeutische Gen den Defekt des fehlerhaften Gens ausgleicht. Ein retroviraler Cre/loxP-Vektor könnte hierbei zu einer lebenslangen Expression des Genprodukts genutzt werden. Außerdem könnten Gene transferiert werden, die nur temporär exprimiert werden sollen. Hierzu könnte ein induzierbarer Cre/loxP-Vektor verwendet werden. Zur Bekämpfung von Krebs oder HIV werden Untersuchungen mit Apoptose-Genen und Suizid-Genen durchgeführt, die bei einer unerwünschten Immunreaktion mit Hilfe des Cre/loxPSystems eliminiert werden könnten. Für die Zell- und Gentherapie werden zur Zeit Studien zur kontrollierten Expansion von Stammzellen und Endothelzellen durchgeführt, wobei Genen verwendet werden, die diesen Zellen einen Proliferationsvorteil verschaffen. Die vollständige Abschaltung dieser Gene nach der Zellexpansion ist wünschenswert. Mit dem Cre/loxP-Vektorsystem könnte eine reversible Immortalisierung erzielt werden, was die Sicherheit einer späteren Transplantation erhöhen würde. Die Deletion weiterer viraler Sequenzen erhöht außerdem die Sicherheit des Gentransfers für eine erstrebenswerte lebenslange Integration von Gensequenzen. Die Möglichkeiten zur Mobilisierung eingeführter retroviraler Sequenzen durch Mutationen oder Rekombinationen mit endogenen Viren wird stark vermindert, da Elemente, wie das virale Verpackungssignal oder virale Genkassetten entfernt werden können. Der entwickelte Cre/loxP-Vektor ist außerdem ein selbstdeletierender Vektor, der nicht nur die spezifischen Bindestellen der loxP-Elemente enthält, sondern auch das CreGen zur Rekombination. Die spezielle Anordnung der Elemente zur Rekombination erlaubt nicht nur eine spezifische Rekombination, sondern auch die Deletion des Gens der CreRekombinase. Das Cre/loxPSystem deletiert sich somit selbständig, was einen weiteren Sicherheitsaspekt darstellt.
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Screening und Charakterisierung von Peptidliganden für den BCR-ABL mRNA Translokationsbereich
(2005)
- Die reziproke Translokation t(9;22) ist in 95% der chronischen myeloischen Leukämie vorhanden. Bei der Translokation entsteht ein Fusionsprotein BCR-ABL, welches ausreichend für die Entstehung von Leukämien ist. 30% aller akuten lymphatischen Leukämien sind ebenfalls positiv für diese Translokation. Durch die Translokation entsteht am Translokationsbruchpunkt eine einzigartige RNA-Sequenz, welche als Ziel für eine RNA-Liganden Suche dienen kann. Ziel dieser Arbeit war es, Peptidliganden zu finden, welche die BCR-ABL mRNA binden können. Zunächst wurde die bcr-abl mRNA nach Sekundärstruktur-Elementen durchsucht, welche als Interaktionspartner mit Peptiden in Fragen kommen. Hierzu wurde die BCR-ABL mRNA durch das MFold-Programm von Zuker analysiert. Durch die Auswertung der errechneten Diagramme für die thermodynamische Stabilität und die kinetische Prävelanz der Basenpaarinteraktion, wurden zehn verschiedene BCR-ABL mRNA-Bereiche ausgewählt, welche die Möglichkeit besitzen, sich in stabile Sekundärstruktur-Elemente zu falten. Um diese strukturellen Gegebenheiten am BCR-ABL Translokationsbruchpunkt b2a2 im Experiment zu überprüfen, wurden in Kooperation mit Prof. Göbel und Dr. Scheffer RNase-Mapping und Mapping mit einer künstlichen Nuklease durchgeführt. Es konnte im Experiment das Vorhandensein einer Sekundärstruktur nachgewiesen werden. Diese Struktur wird aus einem Stamm mit einer Fehlpaarung, einem asymmetrischen internen Loop, einem weiteren Stamm und durch einen Loop definiert. Gegen diese b2a2-Struktur und gegen neun weitere mRNA-Bereiche wurde eine Phage-Display-Selektion durchgeführt, welche zum Ziel hat, Peptide zu gewinnen, welche die entsprechende RNA-Struktur spezifisch binden können. Nach der Sequenzierung der Phagen, konnten insgesamt 14 verschiedene Peptid-Sequenzen für die zehn unterschiedlichen RNA-Bereiche gefunden werden, welche die Möglichkeit besitzen, mit der jeweiligen Ziel-RNA zu interagieren. Die Phagen-RNA Interaktion wurde durch Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie ermittelt. Bei dieser Meßmethode werden Diffusionszeiten von markierten Molekülen in Lösung bestimmt. Zwei von den 14 Phagen-Präsentierten-Peptiden zeigen eine Interaktion mit der Ziel RNA. Die gefundenen Peptide besitzen die folgenden AS-Sequenz: das Peptid 12, KHLHLHK und das Peptid 14, NPEKVKMLYVEF. Die Interaktion mit der RNA wurde in nicht kompetitiven und in kompetitiven FCS Experimenten gezeigt. Kompetiert wurde die Phagen-RNA Interaktion mit kompetitor RNA und in einem weiteren Experiment mit den synthetisierten Peptiden. Beide Peptide zeigten im FCS eine Interaktion mit dem b2a2 BCR-ABL Translokationsbruchpunkt. Die kD-Werte der Peptid-RNA Interaktion wurde durch CDTitration ermittelt. Peptid 12 bindet die b2a2-RNA mit einem kD-Wert von 42 μM und Peptid 14 bindet diese RNA mit einem kD-Wert von 52 μM. Durch die CD-Titration wurde auch der Interaktionsort der beiden Peptide mit der b2a2-RNA ermittelt. Ausgehend von unserem b2a2-Strukturmodell, wurden RNA-Mutanten generiert und in Gegenwart von den Peptiden CD-Spektrometrisch untersucht. Die Interaktion von Peptid 12 mit der RNA findet am Loop und am oberen Stamm statt. Das längere Peptid 14 benötigt alle b2a2-RNA Strukturmerkmale, außer dem unteren Stamm, zur Interaktion. Der Einfluß der Peptide auf die Translation wurde durch ein In-vitro-Translationssystem ermittelt. Demnach bindet Peptid 14 an die b2a2-RNA-Struktur und verringert auf diese Weise die Translation. Peptid 12 bindet zwar ebenfalls an die b2a2-RNA, jedoch konnte eine Verringerung der Translation bei diesem Peptid nicht beobachtet werden.
