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Impact of tumour microenvironmental factors on dendritic cell differentiation and function
(2012)
- Um der Erkennung durch das körpereigene Immunsystem entkommen, weisen Tumore Modifikationen in ihrer Mikroumgebung auf. Zu diesen gehören u. a. veränderte Sauerstoffkonzentrationen im Tumorkern und die Freisetzung biochemischer Faktoren aus Tumorzellen, welche die Funktion von Tumor-assoziierten Phagozyten, wie z.B. Dendritischen Zellen (DC) beeinflussen. DC sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die eine Spezialisierung in verschiedene funktionale Subtypen aufweisen. Myeloische DC (mDC) sind besonders effizient in Hinsicht auf die Präsentation von Antigenen, wohingegen plasmazytoide DC (pDC) regulatorisch auf das Immunsystem einwirken. Beide Subtypen spielen eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese. Während humane mDC, zur therapeutischen Verwendung, ex vivo aus Monozyten hergestellt werden können, war dies für humane pDC bisher nicht möglich. Ein war deshalb ein erstes Ziel dieser Arbeit, ein Protokoll zur Generierung humaner pDC aus humanen Monozyten zu entwickeln. Diese wurden mittels des Wachstumsfaktors Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt3-L) zu pDC-Äquivalenten differenziert, welche als monocyte-derived pDC (mo-pDC) bezeichnet wurden. In der Tat zeigten mo-pDC ein für humane pDC charakteristisches Oberflächenmarkerprofil und wiesen, im Vergleich zu mDC, eine geringe Kapazität zur Induktion der Proliferation autologer T Zellen und zur Phagozytose apoptotischer Zellen auf. Mo-pDC erwarben im Verlauf ihrer Differenzierung aus Monozyten eine kontinuierlich erhöhte Expression des pDC-spezifischen Transkriptionfaktors E2-2 und seiner spezifischen Zielgene. Der wichtigste funktionale Parameter von pDC ist die Produktion großer Mengen von Interferon-α (IFN-α). Mo-pDC sezernierten, nach vorheriger Aktivierung mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) oder wenn zu ihrer Differenzierung neben Flt3-L auch Vitamin D3 oder all-trans-Retinolsäure verwendet wurde, ebenfalls große Mengen IFN-α. Wurden mo-pDC unter Hypoxie, einem prominenten Faktor der Tumormikroumgebung, generiert, so waren die Expression des spezifischen Transkriptionsfaktors E2-2 und die Freisetzung von IFN-α stark vermindert. Diese Daten zeigten zunächst, dass mo-pDC für das Studium von Differenzierung und Funktion humaner pDC eingesetzt werden können. Weiterhin lieferten sie Hinweise auf eine veränderte Differenzierung humaner pDC unter Hypoxie. In einem nächsten Schritt wurde folglich untersucht, ob Hypoxie auch die Differenzierung von pDC aus deren physiologischen Vorläufern beeinflusst. Wurden Knochenmarkszellen der Maus mit Flt3-L unter Normoxie oder Hypoxie kultiviert, so war die Differenzierung zu pDC unter Hypoxie in der Tat unterdrückt. Dies war abhängig von der Hypoxie-induzierten Aktivität des Hypoxie-induzierten Faktors 1 (HIF-1), da die Flt3-Linduzierte Differenzierung von murinen Knochenmarkszellen, in denen die Expression von HIF-1 in pDC-Vorläuferzellen ausgeschaltet war, unter Hypoxie normal verlief. Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass Hypoxie, durch Aktivierung von HIF-1, Differenzierung und Funktion von pDC unterdrückt. Dieser Mechanismus könnte zu ihrer beschriebenen Dysfunktion in humanen Tumoren beitragen. Neben Hypoxie sind viele andere Faktoren an der Immunsuppression in Tumoren beteiligt. Eine Komponente der Mikroumgebung in Tumoren ist das Vorhandensein apoptotischer Tumorzellen. Apoptose von Tumorzellen findet, im Kontrast zur generellen Sicht von Tumoren als Apoptose-resistente Entitäten, auch in unbehandelten Tumoren im Überfluss statt. Apoptotische körpereigene Zellen unterdrücken unter physiologischen Bedingungen das Immunsystem. Deshalb könnte das Freisetzen von apoptotischem Material oder die Sekretion von Faktoren aus sterbenden Tumorzellen einen starken Einfluss auf die Funktion von Tumor-assoziierten DC und die damit verbundene Aktivierung von tumoriziden Lymphozyten haben. Eine diesbezügliche Studie war das zweite Ziel der vorliegenden Arbeit. Humane mDC wurden zu diesem Zweck mit Überständen lebender, apoptotischer oder nekrotischer humaner Brustkrebszellen aktiviert und anschließend mit autologen T Zellen ko-kultiviert. Danach wurde das zytotoxische Potential der ko-kultivierten T Zellen analysiert. Interessanterweise unterdrückte die Aktivierung mit Überständen apoptotischer Tumorzellen die DC-vermittelte Generierung tumorizider T Zellen durch die Ausprägung einer Population von regulatorischen T Zellen (Treg), die durch die gleichzeitige Expression der Oberflächenmoleküle CD39 und CD69 charakterisiert war. Die Ausprägung der CD39- und CD69-exprimierenden Treg Zell-Population war abhängig von der Freisetzung des bioaktiven Lipids Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aus apoptotischen Zellen, welches durch den S1P-Rezeptor 4 zur Freisetzung des immunregulatorischen Zytokins IL-27 aus mDC führte. Neutralisierung von IL-27 in AC-aktivierten Ko-Kulturen von mDC und T Zellen blockierte die Generierung von CD39- und CD69-exprimierenden Treg Zellen und resultierte folglich in der Aktivierung zytotoxischer T Zellen. Weiterhin war die Bildung von Adenosin in den Ko- Kulturen für die Unterdrückung zytotoxischer T Zellen vonnöten. Erste Experimente lieferten Hinweise auf eine direkte Interaktion von CD69- und CD39-exprimierenden Treg Zellen mit CD73-exprimierenden zytotoxischen T Zellen. CD39 und CD73 werden für die Bildung von Adenosin aus ATP benötigt, weswegen die Interaktion von Treg Zellen und zytotoxischen T Zellen die Adenosin-Produktion fördern könnte. Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Befunde wie Faktoren der Tumormikroumgebung die Funktion von humanen DC Subtypen beeinflussen können. Ein Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen kann wertvolle Informationen für die Wahl effektiver Immuntherapien oder Chemotherapien liefern und so die Therapie humaner Tumore unterstützen.
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Untersuchungen zur ZNS-Bioverfügbarkeit wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoffe von Johanniskraut
(2007)
- In der vorliegenden Arbeit wurde die ZNS-Bioverfügbarkeit der Quercetin-Flavone und der Naphthodianthrone aus Hypericum perforatum untersucht. Hierzu wurde jew. eine HPLC-gestütze Methode zur Quantifizierung der genannten Stoffe in ZNS und Plasma erstellt und in enger Anlehnung an internationale Richtlinien (ICH- u. FDAGuidelines) validiert. Mit Hilfe dieser Methoden wurden im Anschluss Rattenfütterungsstudien durchgeführt und ausgewertet. Im Falle der Quercetin-Flavone konnte eindeutig gezeigt werden, dass diese Stoffgruppe ZNS-bioverfügbar ist und bei wiederholter Gabe (1 x tgl.) über den beobachteten Zeitraum von 8 Tagen im ZNS kumuliert. Ferner ist es gelungen, erste ZNS-Spiegelkurven der Quercetin-Flavone nach Einmal- und Mehrfach-Gabe aufzuzeichnen. Im Gegensatz hierzu weisen die Naphthodianthrone, unter Berücksichtigung der analytischen Grenzen, keine ZNS-Bioverfügbarkeit auf. Betrachtet man diese Ergebnisse im Kontext der bisher erschienenen Publikationen zu Johanniskraut, lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit die Rolle der Flavonoide eindeutig an Bedeutung gewinnt und die der Naphthodianthrone eindeutig an Bedeutung verliert. Schaut man auf die bisher untersuchten Inhaltsstoffe von Johanniskraut, wird deutlich, dass den Phloroglucinolen die wohl herausragendste Bedeutung zukommt, was nicht zuletzt durch Keller et al.[137] und Müller et al. [27,59,67] gezeigt werden konnte. Für die klinische Wirksamkeit des Hypericum-Extraktes sind jedoch auch die Flavonoide essentiell, was durch Tierstudien gezeigt und durch diese Arbeit unterstüzt werden konnte[114]. Der Mechanismus, durch den die Flavonoide zur antidepressiven Wirksamkeit beitragen, liegt, im Gegensatz zu dem der Phloroglucinole, jedoch noch im Dunklen. Durch die Präsenz von Quercetin bzw. dessen Metaboliten im ZNS auf der einen und den Ergebnissen von Tierstudien zur antidepressiven Wirksamkeit isolierter Flavonoide mit Hilfe des Porsolt-Tests auf der anderen Seite[33] lässt sich jedoch spekulieren, dass die Flavonoide einen direkten antidepressiven Effekt ausüben und nicht nur indirekt durch Verbesserung, beispielsweise der ZNS-Bioverfügbarkeit der Phloroglucinole o. ä., zu den antidepressiven Eigenschaften des Extraktes beitragen. Durch ihr Unvermögen, die Blut-Hirn-Schranke in nennenswerten Konzentrationen zu überschreiten, treten die Naphthodianthrone, die in der Vergangenheit als für die Wirksamkeit wichtigsten Inhaltsstoffe angesehen wurden, eindeutig in den Hintergrund. Als Beitrag dieser Stoffgruppe zur antidepressiven Wirksamkeit ist demnach erstens ein wie auch immer gearteter indirekter Effekt durch Verbesserung der ZNS-Bioverfügbarkeit der ZNS-gängigen Substanzen, zweitens ein wegen der bestenfalls möglichen, niedrigen Konzentrationen schwacher antidepressiver Effekt im ZNS, drittens ein antidepressiver Effekt durch aktive Metaboliten oder viertens ein antidepressiver Effekt, der sich in der Peripherie beispielsweise durch Beeinflussung der HPA-Achse abspielt, denkbar. Für ersteres existieren bis dato keinerlei Anhaltspunkte, für den zweiten Punkt existieren weder Beweis noch Gegenbeweis noch Spekulationen in der Literatur, dasselbe gilt für den dritten Punkt, der vierte Punkt wird hingegen kontrovers diskutiert[44,97,143]. In Publikationen wurde hierzu festgestellt, dass unter dem Einfluss von Hypericin sich die Blutspiegel an Cortisol und ACTH, die bei Depressiven erhöht bzw. gestört sind, wieder normalisieren. Der Einwand der Kritiker dieses Wirkmodells scheint hierbei aber plausibel, da es sich bei dem mit Hilfe von Hypericin beeinflussbaren, beobachteten Phänomen der Erhöhten Cortisol- und ACTH-Plasmaspiegel auch nur um ein Symptom einer Depression und nicht um einen für die Depression ursächlichen Vorgang handeln kann. Nicht jeder, bei dem erhöhte Cortisol- und veränderte ACTH-Spiegel vorliegen ist zwangsläufig depressiv. Das exakte Zusammenspiel der einzelnen Extrakt-Komponenten, von denen die bisher in den Focus der Untersuchungen geratenen Stoffe nur etwa 10 bis 15% ausmachen, bleibt jedoch auch weiterhin zum größten Teil im Unklaren, wenngleich gerade dieses Zusammenspiel die besonderen Eigenschaften des Extraktes und dessen Wirkung ausmachen. Unverzichtbare Bestandteile sind hierbei Phloroglucinole und Flavonoide, die in angemessenen Konzentrationen im Extrakt repräsentiert sein müssen, um ein klinisch hochwertiges Produkt zu gewährleisten. Inwieweit ein repräsentativer Gehalt an Hypericinen im Extrakt vorhanden sein sollte, ist nicht zuletzt auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit mit einem Fragezeichen zu versehen, wenngleich die Datenlage zur Zeit keinesfalls ausreicht, die Hypericine gänzlich aus dem Extrakt zu verbannen. In wie weit die An- oder Abreicherung einzelner Komponenten zu einer Verbesserung der klinischen Wirksamkeit führt, muss jedoch stets in zusätzlichen Studien eruiert werden. Insgesamt steht aber mit dem Johanniskraut-Extrakt für die erfolgreiche Therapie von milden bis mittelschweren Depressionen ein wichtiges, fast unverzichtbares Werkzeug zur Verfügung, das sich insbesondere durch sein verglichen mit synthetischen Antidepressiva, überaus günstiges Profil an unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen auszeichnet. Trotz in jüngster Zeit propagierter Bedenken hinsichtlich der Unbedenklichkeit der Anwendung von Johanniskraut Extraktpräparaten besonders in Kombination mit anderen Arzneistoffen, was jedoch einer genaueren Betrachtung nur schwer standhält[144], stellt der Johanniskraut-Extrakt zur Behandlung milder bis mittelschwerer Depressionen ein unverzichtbares Werkzeug dar.
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Dosierungsgenauigkeit von Antibiotika-Trockensäften am Beispiel von Clarithromycin-, Erythromycin- und Amoxicillin- Mono- und Kombinationspräparaten
(2007)
- Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Dosierungsgenauigkeit aller jeweils zum Zeitpunkt der Studie am Markt befindlichen Amoxicillin-, Erythromycin und aller Clarithromycintrockensäfte mit der Dosierung 125 mg/ml untersucht. Die Studie zur Dosierungsgenauigkeit und sicheren Handhabung von Amoxicillintrockensäften umfasste weiterhin die Untersuchungen möglicher Herstellungsfehler, der Stabilität über die Laufzeit, die Untersuchung des Sedimentationsverhaltens von Saftpräparaten sowie eine Umfrage in der Patientengruppe. In den drei Studien zur Dosierungsgenauigkeit von Antibiotikatrockensäften lieferten die einzelnen Dosierhilfsmittel sehr unterschiedliche Ergebnisse. Die größten Dosierungsungenauigkeiten wurden mit Dosierlöffeln erzielt. Sowohl bei der Untersuchung von Amoxicillintrockensäften als auch bei Erythromycinpräparaten wichen Dosierungen mit der Viertel- und Halbmesslöffelmarkierung sehr stark vom definierten Wirkstoffgehalt ab. Übereinstimmend war in beiden Gruppen die Dosierungsabweichung nach Ganzlöffeldosierung am geringsten. Die in der Arbeit dargestellten Ergebnisse belegen, dass die Dosierungsgenauigkeit bei der Applikation von Suspensionen mit Dosierlöffeln im Wesentlichen von zwei Faktoren abhängt. Der erste Parameter ist die Grundfläche der Dosierhilfe. Bei breiten bzw. großen eher flachen Löffeln kommt es zu gravierenden Überdosierungen, vor allem bei den kleinen Einheiten ¼- bzw. ½ Löffel. Da die Amoxicillinpräparate mehrheitlich mit solchen breiten, flachen Löffeln, die Erythromycinpräparate hingegen überwiegend mit kleineren kompakteren Dosierlöffeln ausgestattet sind, waren die Ergebnisse der Untersuchung von Amoxicillintrockensäften im Durchschnitt deutlich schlechter. Der zweite wichtige Parameter für die Dosierungsgenauigkeit ist die Saftkonsistenz. Bei hochviskosen Zubereitungen bildet sich beim Dosieren durch die Kohäsionskraft ein deutlicher Überschuss auf dem Löffel. Bei feuchter Löffeloberfläche ist dieser Überschuss weniger stark ausgeprägt. Tatsächlich sind natürlich bei der alltäglichen Anwendung Dosen üblich, die ein Mehrfachbefüllen des Löffels nicht erforderlich machen, das heißt der Patient dosiert in der Regel auf einen trocken Löffel und damit klar über. Aufgrund dieser Oberflächenphänomene war auch bei kleineren, kompakteren Löffeln keine völlig genaue Dosierung möglich. In der Untersuchung an den Amoxicillinpräparaten erwies sich der Messbecher gegenüber den graduierten Löffeln von großem Vorteil. Zum einen ermöglichen Messbecher eine genauere Dosierung (geringere Schwankungen der Arzneimittelmenge um den Sollwert), weiterhin sind sie in der Praxis standfester; der abgebende Apotheker kann das verordnete Volumen überdies mit wasserfestem Stift oder Klebeband markieren. Dies kann vor allem für fremdsprachige oder sehbehinderte Patienten sehr hilfreich sein. Beim Dosieren mit Messbechern besteht allerdings vor allem bei höher viskosen Flüssigkeiten die Gefahr der Unterdosierung. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sich die Skalen auf die eingegossene und nicht auf die ausgegossene Flüssigkeitsmenge beziehen. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit waren die Dosierspritzen mit Abstand die genauesten Dosierhilfen. Die Wirkstoffwiederfindung bei der Untersuchung von Clarithromycintrockensäften schwankte auf sämtlichen Dosierniveaus nur um wenige Prozent. Das Applizieren mit Hilfe einer Dosierspritze ist nicht nur wegen der sehr genauen Dosierbarkeit besonders anwenderfreundlich, sondern die Suspension wird darüber hinaus durch das Kopfüberdosieren gleichzeitig redispergiert. Außerdem kann der Saft, wenn sich der Patient in aufrechter Körperhaltung befindet, aus der Spritze direkt an der Innenseite der Wange entleert werden. Damit kann ein Würge- oder Hustenreiz unterdrückt sowie das sofortige Wiederausspucken bei Kleinkindern unterbunden werden. Besonders erwähnenswert sind Dosierspritzen, die neben einer Volumenskalierung alternativ oder teilweise zusätzlich in kg Körpergewicht graduiert sind. Dies sorgt für zusätzliche Anwendungssicherheit. In letzter Zeit ist zu beobachten, dass die Empfehlung Dosierspritzen zu verwenden, die erstmals bereits in den 70 iger Jahren von der American Academy of Pediatrics ausgesprochen wurde,[2] auch in Deutschland umgesetzt wird. Vor allem Generika, die momentan am Markt platziert werden, verfügen über Dosierspritzen bzw. beides; Dosierspritze und –löffel. Die Studie zu Amoxicillinpräparaten beinhaltete weitere wichtige Parameter, die für die Anwenderfreundlichkeit und die sichere Handhabung dieser Arzneiform Relevanz besitzen. Wie die in den jeweiligen Kapiteln dokumentierten Ergebnisse belegen, sind Trockensäfte Präparate, die bei Abgabe in der Apotheke einer ausführlichen Beratung bedürfen. So zeigten die Versuche zur Bestimmung des korrekten Auffüllvolumens, dass die von Herstellern angegebenen zuzusetzenden Wassermengen nicht unkritisch übernommen werden dürfen. Der Anwender sollte auch bei vorgegebenem Volumen den Saft in zwei bis drei Schritten sukzessive auffüllen und den Stand des Flüssigkeitspegels nach Schaumabsetzen beachten. Ebenso wichtig wie dieser Hinweis ist der Rat, den Saft vor jeder Anwendung sorgfältig zu schütteln. Die Untersuchungen zum Sedimentationsverhalten zeigten auch bei scheinbar stabilen Zubereitungen nach spätestens 24 Stunden eine deutliche Wirkstoffsedimentation. In der Beratung nicht fehlen, darf weiterhin der Hinweis zur korrekten Aufbewahrung der Suspensionen. Clavulansäurehaltige Amoxicillinkombinationspräparate müssen wegen der Thermolabilität des β-Laktamaseinhibitors zwingend im Kühlschrank gelagert werden. Nach nur 7 -tägiger unsachgemäßer Aufbewahrung bei Raumtemperatur war bei der Untersuchung zur in-use Stabilität eine drastische Degradierung der Clavulansäure um ganze 66,3 % zu verzeichnen. Im Gegensatz zu den clavulansäurehaltigen Trockensäften dürfen Clarithromyinsäfte wiederum nicht im Kühlschrank aufbewahrt werden. Bei diesen Präparaten droht bei Temperaturen zwischen 5 – 8 °C die Auskristallisierung des Wirkstoffes und damit die Zerstörung der galenischen Formulierung. Der dadurch hervortretende stark bittere Geschmack ist für Säuglinge und Kleinkinder intolerabel. Neben der oben angesprochenen Umstellung von Dosierlöffeln auf Dosierspritzen gibt es weitere Entwicklungen, die einige der eben hier aufgezeigten Probleme lösen. ....
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Screening pflanzlicher Extrakte auf Aktivierung des humanen Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptors und seiner Subtypen
(2007)
- Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte mit der Aktivierung des Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptors eine Rationale und ein möglicher Wirkmechanismus für die traditionelle Anwendung von Gewürz- und Arzneipflanzen bei der Therapie des Typ 2 Diabetes aufgezeigt werden. Vor diesem Hintergrund wurden über fünfzig traditionell bei Diabetes angewandte Pflanzen ausgewählt und mit Ethanol extrahiert. Die erhaltenen Trockenextrakte wurden daraufhin in einem von mir etablierten Reporter-Gen Assay auf eine mögliche Aktivierung der drei Subtypen des PPAR hin untersucht. Von den getesteten Extrakten wurde für fünfundzwanzig, also annähernd die Hälfte, eine signifikante Aktivierung des PPARgamma nachgewiesen. Von diesen zeigten wiederum vierzehn außerdem eine signifikante Aktivierung des PPARalpha, lediglich drei dieser Extrakte zeigten auch eine signifikante Aktivierung des PPARdelta. Somit konnte ich eine mögliche Rationale und einen potentiellen Wirkmechanismus für die volksmedizinische Anwendung dieser Pflanzen bei Diabetes aufzeigen. Von den wirksamen Extrakten wiesen am PPARgamma sieben eine ausreichend hohe Aktivität auf, dass wir auch bei niedrigeren Testkonzentrationen noch einen signifikanten Effekt und somit eine Konzentrationsabhängigkeit des aufzeigen konnten. Für PPARa konnten wir lediglich für drei der Extrakte eine Konzentrationsabhängigkeit aufzeigen, bei PPARdelta für keinen der Extrakte. Die beiden am stärksten aktiven Extrakte aus Rosmarinus offic. und Salvia offic. zeigten bereits ab etwa 10 mg/L signifikante Aktivität am PPARgamma, so dass wir für diese beiden Extrakte mit 20 bzw. 40 mg/L EC50-Konstanten bestimmen konnten. Diese halbmaximale Aktivierungskonstante liegt damit für den potenteren Rosmarin-Extrakt lediglich um den Faktor 200 höher als die des bei Diabetes eingesetzten Arzneistoffs Pioglitazon (Actos®). Die weitere Untersuchung dieser beiden Extrakte ergab, dass in beiden Carnosolsäure bzw. Carnosol enthalten waren, welche bei der Untersuchung im Reporter-Gen Assay EC50-Konzentrationen von 20 bzw. 40 mikroM für die Aktivierung des PPARgamma aufwiesen. Damit sind diese Reinsubstanzen bereits nur noch um den Faktor siebzig schwächer wirksam als Pioglitazon. Vergleicht man hingegen mit Bezafibrat (Cedur®), einem als Lipidsenker eingesetzten Arzneistoff, welcher aufgrund seiner pan-PPAR-agonistischen Wirkung mit EC50-Konzentrationen von je etwa 50 mikroM von besonderem Interesse ist, so sind die beiden Diterpene Carnosolsäure und Carnosol im Hinblick auf PPARgamma äquipotent oder eher stärker aktiv. Der Gehalt an diesen beiden Diterpenen in den von mir hergestellten Extrakten war nun zwar mit in Summe drei bzw. neun Prozent um den Faktor zehn bzw. drei zu niedrig, als dass sich der PPARgamma Agonismus der beiden Extrakte hierdurch hinreichend erklären ließe. Allerdings konnten wir für einen kommerziell erhältlichen und auf 40% Carnosolsäure angereicherten Rosmarin-Extrakt einen EC50-Wert von 10 mg/L bestimmen für die Aktivierung von PPARgamma bestimmen. Eine Aktivität, welche sich zu 70% allein auf den Gehalt an Carnosolsäure zurückführen lässt. Neben dem Nachweis der PPARgamma Aktivität von Carnosolsäure und Carnosol einerseits und der von ethanolischen Rosmarin- und Salbei-Extrakten andererseits, konnte ich somit einen hinreichenden Beweis führen, dass Carnosolsäure zumindest für Rosmarin, vermutlich auch für Salbei, als eines der aktiven Prinzipien anzusehen ist. Meine Befunde liefern damit eine mögliche Erklärung und Wirkmechanismus für die in Tiermodellen gefundene hypoglykämische Wirksamkeit von Rosmarin, Salbei und Carnosolsäure. Darüber hinaus legen meine Untersuchungen nahe, dass in beiden Pflanzen weitere PPARgamma Aktivatoren enthalten sind. Da Carnosol selbst bereits ein Oxidationsprodukt der Carnosolsäure darstellt, kämen hier weitere auch bereits beschriebene Oxidationsprodukte sicherlich in Frage. Diese Oxidationsprodukte stellen allerdings zumeist nur labile Übergangsprodukte dar und sind aus diesem Grunde auch als nicht Reinstoffe erhältlich. Der Nachweis einer PPAR Aktivität könnte somit angesichts der benötigten Inkubationsdauer im Reporter-Gen Assay so nicht geführt werden. Neben den bereits angeführten Ergebnissen ist die hohe Rate von positiven Treffern in meinem Screening selbst einer der interessantesten Befunde. Die signifikante Aktivierung von PPARgamma durch nahezu die Hälfte der getesteten Extrakte lässt die Vermutung zu, dass PPAR agonistische Substanzen im Pflanzenreich sehr weit verbreitet sein könnten. Zwar bestehen zu Recht Vorbehalte gegenüber der Testung von Vielstoff-Gemischen bzw. den hierbei erhaltenen Ergebnissen. Viele pflanzliche Inhaltsstoffe z.B. Gerbstoffe können zu einer unspezifischen Hemmung der Aktivität von Enzyme führen. Das verwendete Testsystem setzt allerdings neben Membrangängigkeit der aktiven Prinzipien die spezifische Aktivierung der Expression eines Gens, dessen Aktivität anschließend bestimmt wird, voraus. Die Art des verwendeten Assay macht damit die Erfassung unspezifischer Effekte eher unwahrscheinlich. Darüberhinaus mag für die Güte der Ergebnisse meines Screenings sprechen, dass unabhängig von uns für einige der gescreenten Pflanzen z.B. Kurkuma und Chili mit den Kurkuminoiden und Capsaicin kürzlich PPAR aktive Prinzipien beschrieben wurden. Vielmehr lässt sich die Hypothese formulieren, dass eine ganze Reihe sekundärer pflanzlicher Inhaltsstoffe zumindest mäßig aktive PPAR Agonisten darstellen. An prominenter Stelle wäre hier die Substanzklasse der Terpene zu nennen, von denen eine ganze Reihe sowohl linearer etwa Farnesol und Phytansäure, als auch cyclischer z.B. Tumeron, Abietansäure, Oleanolsäure und Ursolsäure bereits als PPAR-Aktivatoren beschrieben wurden. Angesichts der hohen Lipophilie dieser Substanz-Klasse und einer relativ großen und wenig selektierenden Bindungstasche des PPAR lässt sich auch für andere Terpene ein PPAR Agonismus erwarten. Der positive Effekt, den eine überwiegend pflanzliche Ernährung nach epidemiologischen Erkenntnissen auf die Gesundheit bewirkt, mag deshalb in Teilen auf PPAR-agonistische Prinzipien zurückzuführen sein. Neben dem höheren Anteil an mehrfach ungesättigen Fettsäuren im Vergleich zu tierischer Nahrung könnten enthaltene Terpene hier durchaus einen relevanten Beitrag leisten. In einem weiteren in Kooperation durchgeführten Projekt konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass die schwache Aktivität des phenolischen Stilben-Derivats Resveratrol am PPARgamma einen Beitrag leistet zur Beeinflussung des Polyamin-Stoffwechsels und der hierdurch bedingten Regulation der Zell-Proliferation. Weiterhin konnte mit Hilfe der in unserem Reporter-Gen Assay erhaltenen Ergebnisse gezeigt werden, dass ein virtuelles Computer-basiertes Screening einer Substanzbibliothek effektiv ist, bei der Findung von PPAR Leitstrukturen.
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Rationale und traditionelle Johanniskrautextrakt-Präparate : pharmazeutische Qualität im Vergleich / Stefanie Schulte genannt Löbbert
(2003)
- Durch die zunehmende Bedeutung der Selbstmedikation wird die Beratungskompetenz der Apotheker immer wichtiger. Johanniskrautextrakt-Präparate sind in Deutschland nicht nur in der Apotheke, sondern auch in Drogerien und Supermärkten erhältlich. Sie besitzen einen unterschiedlichen Zulassungsstatus und damit verbunden Unterschiede in den qualitativen Anforderungen, die an sie gestellt werden. Nur durch eine kritische Bewertung von Erkenntnismaterial ist es möglich, aus einer sehr inhomogenen Gruppe qualitativ gute Johanniskrautextrakt-Präparate hervorzuheben. Bei den nach AMG zugelassenen und dem aktuellen Wissensstand entsprechenden Johanniskrautextrakt-Präparaten handelt es sich ausschließlich um Monopräparate, die als Wirkstoff Johanniskraut-Trockenextrakt enthalten. Für den Einsatz von gepulverter Droge fehlen bis heute klinische Belege. Auch für die Anwendung von fixen Kombinationen von mehreren pflanzlichen Extrakten steht eine rationelle Begründung bislang aus. Der Trockenextrakt muss durch ein Droge-Extrakt-Verhältnis und durch das verwendete Extraktionsmittel charakterisiert sein. Als Extraktionsmittel zur Herstellung der Extrakte sollte Methanol oder Ethanol verwendet werden. Als therapeutisch wirksame Tagesdosis gelten 2 – 4 g Drogenäquivalente. Die eingangs gestellte Frage, ob sich apothekenpflichtige Johanniskrautextrakt- Präparate von den Johanniskrautprodukten aus dem Drogerie-Segment abgrenzen, kann an Hand der vorliegenden Datenlage beantwortet werden. Untersuchungen hinsichtlich des Inhaltstoffspektrums zeigen, dass die Gehalte an wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffen, besonders die Hyperforin Werte, bei apothekenpflichtiger Ware deutlich höher sind, als dies bei nicht apothekenpflichtigen Präparaten der Fall ist. Die nicht apothekenpflichtigen Johanniskraut-Präparate sind dadurch charakterisiert, dass die mit der empfohlenen Tagesdosis zugeführte Wirkstoffmenge zum Teil erheblich unter jener liegt, die heute als erforderlich für eine Depressionsbehandlung angesehen wird. Bei den nicht apothekenpflichtigen Präparaten kam es zu erheblichen Schwankungen im Wirkstoffgehalt einzelner Chargen. Im pharmakologischen in vitro Assay schnitten die nicht apothekenpflichtigen Produkte bezüglich ihrer Wirkstärke, die Serotoninwiederaufnahme zu hemmen, deutlich schlechter ab als die apothekenpflichtigen Präparate. Es konnte eine sehr gute Korrelation der erotoninwiederaufnahmehemmung mit den jeweiligen Hyperforin-Gehalten der untersuchten Fertigarzneimittel aufgestellt werden. Die Wirksamkeit von Johanniskrautextrakt-Präparaten bei leichten bis mittelschweren Formen der Depression gilt heute als gesichert, sofern qualitativ hochwertige Extrakte in ausreichend hoher Dosierung eingesetzt werden. Die apothekenpflichtigen Präparate werden dem Anspruch, der an rationale Phytopharmaka gestellt wird, gerecht und sind daher als qualitativ besser einzustufen als nicht apothekenpflichtige Produkte. Die Untersuchung des Freisetzungsverhaltens von Hyperforin aus Jarsin® Präparaten macht deutlich, wie wichtig die Galenik von Johanniskrautextrakt-Präparaten im Hinblick auf die Bioverfügbarkeit der Inhaltstoffe ist. Jarsin®300 zeigt lediglich in 4 von 18 untersuchten Prüflingen eine 90-prozentige Freisetzung. Die Ursache hierfür liefert das Ergebnis der Untersuchungen der Dragee-Kerne. Zu hohe Presskräfte bei der Herstellung und ein Fehlen von Sprengmitteln in der Formulierung führen dazu, dass die Dragees in der vorgeschriebenen Versuchsdauer nicht zerfallen und Hyperforin nur unzureichend freigesetzt wird. Jarsin® 450 Tabletten entsprechen den Anforderungen, die an ein rationales Johanniskrautextrakt-Präparat gestellt werden. Bei dem Präparat Jarsin®750 müsste die Galenik dahingehend verbessert werden, dass die Freisetzung nicht vom Lösen des Überzugs und vom Zerfall der Tablettenkerne abhängig ist. Chargenkonformität ist bei allen untersuchten Jarsin® Präparaten gewährleistet. Untersuchungen zur Löslichkeit und zum Freisetzungsverhalten von Biapigenin aus Johanniskrautextrakt-Präparaten zeigen eine deutliche Abhängigkeit vom erwendeten Freisetzungsmedium. Wie schon für die Inhaltstoffe Hyperforin und Hypericin festgestellt werden konnte, besitzt nur das Medium FeSSIF diskriminierende und zugleich lösungsvermittelnde Eigenschaften. Um eine vollständige Freisetzung aller pharmazeutisch relevanten Inhaltstoffe zu gewährleisten, sollte die Einnahme von Johanniskrautextrakt-Präparaten nur mit einer Mahlzeit erfolgen. Durch den Vergleich der Freisetzungsprofile unterschiedlicher Johanniskrautextrakt-Präparate konnte deutlich gemacht werden, dass sie nicht vergleichbar und damit nicht ohne weiteres austauschbar sind. Für die Entscheidung, ob ein Johanniskrautextrakt-Präparat im Sinne der „aut idem Regelung“ durch ein anderes ausgetauscht werden kann, genügt es nicht, dass beide Produkte dieselbe Menge Extrakt derselben Ausgangsdroge aufweisen. Es muss zunächst sichergestellt werden, dass die beiden Präparate pharmazeutische Äquivalenz aufweisen. Die Untersuchungen von vermeintlich äquivalenten Johanniskrautextrakt-Präparaten zeigten deutlich, dass sie sich sowohl im Gehalt an pharmazeutisch relevanten Inhaltstoffen als auch im Freisetzungsverhalten erheblich unterscheiden. Die „autidem Regelung“ ist für Phytopharmaka somit nicht anwendbar. Die Möglichkeit, zwei Märkte zu beliefern, den apothekenpflichtigen und den nicht apothekenpflichtigen Arzneimittelmarkt, bietet der Industrie die Möglichkeit, sehr ähnliche Produkte mit allerdings erheblich unterschiedlichen Anforderungen anzubieten. Dies stellt für die rationalen Phytopharmaka in sofern eine Gefahr dar, als dass der Laie im Zweifelsfall eher zu den günstigen nicht apothekenpflichtigen Präparaten greift. Zusätzlich wird dem Patienten durch gezielte Werbekampagnen in Bezug auf die nicht apothekenpflichtige Ware gute Qualität durch traditionelle Anwendung suggerieren. Nicht apothekenpflichtige Präparate dürften nach heutigem Kenntnisstand jedoch gar nicht wirksam sein. Rechtlich gesehen erheben sie auch keinen Anspruch auf Wirksamkeit, da sie sich durch Hinweise in der Packungsbeilage von den apothekenpflichtigen Präparaten abgrenzen müssen. Das Problem liegt in der für den Laien fehlenden Transparenz. Nur Fachleuten sind die Unterschiede im Zulassungsstatus und den damit verbundenen Anforderungen an Qualität und Wirksamkeit der Johanniskrautextrakt-Präparate bekannt. Auf europäischer Ebene ist der Phytopharmakamarkt nicht einheitlich geregelt. Phytopharmaka zählen in vielen Ländern zu den Nahrungsergänzungsmitteln. Um zu verhindern, dass auch seriöse Phytopharmaka durch Harmonisierungsverfahren der EU aus dem Arzneimittelsegment herausgenommen werden, ist es notwendig, dass die rationalen Phytopharmaka den Anforderungen die an chemisch synthetische Arzneimittel gestellt werden, gewachsen sind. In diesem Zusammenhang ist die seit diesem Jahr gültige USP Monographie „Powdered St. Johns Wort Extract“ zu begrüßen, da sie hohe Anforderungen bezüglich des Gehaltes an Inhaltstoffen stellt. Nur wenn gesetzlich vorgeschrieben wird, welche Kriterien rationelle Phytopharmaka erfüllen müssen, wird einheitliche Qualität gewährleistet. Auf europäischer Ebene wäre die Einführung einer Johanniskrautextrakt-Monographie mit definierten Anforderungen nach dem Vorbild der USP wünschenswert. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Wirksamkeit von Johanniskrautextrakt-Präparaten bei leichten bis mittelschweren Formen der Depression heute als gesichert gilt. Vorraussetzung ist allerdings, dass qualitativ hochwertige Extrakte mit gleich bleibender Qualität in ausreichend hoher Dosierung eingesetzt werden. Da mit Veränderungen in der Zusammensetzung eines Fertigarzneimittels auch Veränderungen in der Wirksamkeit entstehen können, ist die reproduzierbare Qualität aus pharmazeutischer Sicht eine elementare Forderung. Apothekenpflichtige Arzneimittel sind auf Grund ihrer Überlegenheit bezüglich ihres Gehalts an pharmazeutisch relevanten Inhaltsstoffen, Chargenkonformität sowie ihrer Wirksamkeit im pharmakologischen Sinne, den nicht apothekenpflichtigen Arzneimitteln vorzuziehen. Vor dem Hintergrund, dass die Droge Johanniskraut auf der Indikationsliste nach § 109a Absatz 3 AMG des BfArM lediglich in Form von öligen Zubereitungen aus Johanniskrautflüssigextrakt, äußerlich angewandt, zur Unterstützung der Hautfunktion geführt wird, sollte die Freiverkäuflichkeit von nicht apothekenpflichtigen Johanniskrautextrakt-Präparaten bereits aufgehoben sein. In wirksamer Dosierung handelt es sich bei Johanniskrautextrakt-Präparaten um Arzneimittel, die nicht ohne die kompetente Beratung des Apothekers bzw. des pharmazeutischen Fachpersonals eingenommen werden sollten.
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Bioanalytik von Ginsenosiden und Boswelliasäuren
(2003)
- Heute gewinnen pflanzliche Arzneimittel im Zeichen einer verstärkten Hinwendung zu natürlichen, relativ nebenwirkungsarmen Medikamenten zunehmend an Bedeutung, so auch die über Jahrtausende hinweg traditionell angewandte Ginsengwurzel (Panax ginseng) und der Indische Weihrauch (Boswellia serrata). Neben der Struktur- und Extraktanalytik konzentriert sich die Forschung in zunehmenden Maße darauf, die zahlreichen pharmakologisch untersuchten und klinisch beobachteten Wirkungen dieser beiden Arzneipflanzen einzelnen Inhaltsstoffen zuzuordnen. Bei der Ginsengwurzel gestaltet sich dies jedoch besonders schwierig. Dies ist begründet durch die große Anzahl strukturell ähnlicher Ginsenoside sowie durch deren unterschiedlicher Metabolismus. Zwar ist aus In-vitro-Experimenten bekannt, daß die Degradation über die stufenweise Deglukosylierung stattfindet, allerdings ist bislang nicht geklärt, ob intakte Ginsenoside überhaupt resorbiert werden und welche der vielen in vitro ermittelten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Anders als bei Ginseng, kann die therapeutische Wirkung des Indischen Weihrauches wohl definierten Inhaltsstoffen, AKBA und KBA, zugeschrieben werden. Dennoch mangelt es hier an verlässlichen pharmakokinetischen Daten, da bislang keine validierte bioanalytische Methode zur Verfügung stand. Im Rahmen der Bioanalytik von Ginsenosiden und Boswellliasäuren kamen in der vorliegenden Arbeit die Nano-ESI-MS(n)-Technik sowie die HPLC-Analytik zur Anwendung. Bereits bei der Strukturanalyse von Ginsenosiden erwies sich die Kombination der Nano-ESI-Technik mit MS(n)-Experimenten in einer Quadrupol-Ionenfalle als besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu konventionellem ESI bietet Nano-ESI nicht nur den Vorzug, mit kleinsten Substanzmengen lange Messungen durchführen zu können, sondern auch den Vorteil einer effektiveren, weniger diskreminierenden Ionisation. Sowohl die hohe Sensitivität der Nano-Elektrosprayionisierung bei der Analyse von glykosidischen Verbindungen als auch die umfangreichen Strukturinformationen infolge mehrerer aufeinanderfolgender stoßinduzierter Fragmentierungen machen diese Technik zu einer attraktiven und effizienten Methode zur Analyse von Ginsenosiden. In MS(n)-Experimenten äußert sich das charakteristische Fragmentierungsverhalten der Ginsenoside in der sequentiellen Abspaltung der Zuckereinheiten in sukkzessiven Fragmentierungsschritten. Mit dieser Methode konnten die Zuckerketten an verschiedenen Positionen des Protopanaxadiol- bzw. Protopanaxatriolaglykons der Ginsenoside identifiziert, die glykosidischen Verknüpfungen innerhalb der einzelnen Zuckereinheiten durch spezifische Ringfragmente bestimmt und die genaue(n) Verknüpfungsposition(en) enzymatisch eingeführter Galaktose(n) lokalisiert werden. Bisher wurden allerdings Nano-ESI-MS/MS bzw. MS(n)-Untersuchungen primär an wässrigen oder organischen Lösungen von isolierten / aufgereinigten Stoffen oder Stoffgemischen durchgeführt. In dieser Arbeit wurde erstmals diese Technik in der Bioanalytik zur Identifizierung von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und -urin angewandt. Obwohl die optimale Analytkonzentration für die Nano-Elektrosprayionisierung im allgemeinen bei 10-5M liegt, ist es gelungen, die Ginsenoside anhand ihrer spezifischen Fragmentionen im MS/MS Modus bis zu einer Konzentration von 2 ng/mL (10-8M) in biologischen Matrices nachzuweisen. Auch wenn die Molekülionenpeaks bei diesen geringen Konzentrationen im Rauschen untergehen, können die Ginsenoside durch selektive Isolierung der gewünschten Vorläuferionen und deren anschließende Fragmentierung in der Quadrupol-Ionenfalle auf der Basis der Detektion spezifischer Fragmente identifiziert werden. Da bei der Fragmentierung der gleichen Vorläuferionenmasse in Leerplasma bzw. Urin keine charakteristischen Fragmentionen gebildet werden, handelt es sich somit um einen spezifischen Nachweis der Ginsenoside in biologischen Matrices. Vor dem Hintergrund dieser vielversprechenden Vorversuche wurde eine Pilotstudie zum qualitativen Screening von Ginsenosiden und deren Metaboliten in Humanplasma und –urin durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß Protopanaxatriol-Ginsenoside sowohl im Magen hydrolysiert als auch intestinal degradiert werden. Schon in den ersten Stunden nach der einmaligen oralen Einnahme von Ginsana G115 Kapseln wurden die Hydrolyseprodukte G-Rh1 und hydratisiertes G-Rh1 in Humanplasma detektiert. Die schnelle Resorption dieser beiden Verbindungen aus dem oberen Gastrointestinaltrakt deutet auf die Hydrolyse des Ginsenosides Rg1 im Magen hin. Das spätere Auftreten eines weiteren monoglukosylierten Protopanaxatriols, des Degradationsproduktes G-F1, liefert den ersten In-Vivo-Hinweis auf einen intestinalen Metabolismus von Protopanaxatriol-Ginsenoside. Im Gegensatz zu den Protopanaxatriolginsenosiden passieren die Protopanaxadiol-Ginsenoside den Magen unverändert, wie aus der Abwesenheit jeglicher Protopanaxadiol-Degradationsprodukte im Plasma und Urin in den ersten Stunden nach der Applikation geschlossen werden kann. Erst im unteren Gastrointestinaltrakt werden Protopanaxadiol-Ginsenoside durch intestinale Bakterien zu „Compound-K“ abgebaut und anschließend resorbiert. Der Nachweis von Ginsenosid Rb1 im Plasma, sowie weiterer Ginsenoside im Urin eines Probanden zeigt, daß auch Ginsenoside in ihrer intakten Form resorbiert werden können. Dennoch sind weitere Studien hierzu notwendig, um zu klären, ob die Resorption intakter Ginsenoside die Regel oder eher eine Ausnahme darstellt. Mit der Identifizierung des Hydrolyseproduktes G-Rh1, der Degradationsprodukte G-F1 sowie „Compound-K“ in Humanplasma und -urin konnte schließlich die Frage geklärt werden, welche der zahlreichen in vitro bestimmten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Damit ist die Basis für eine spätere Quantifizierung dieser Verbindungen nach ihrer Isolierung bzw. Herstellung und Charakterisierung als Referenzsubstanzen geschaffen. Außerdem können diese neuen Erkenntnisse helfen, pharmakologische Ergebnisse aus In-vitro-Versuchen mit In-vivo-Daten besser zu korrelieren, da sie erste Hinweise geben, welche der in vitro getesteten Substanzen für die in vivo beobachteten Effekte verantwortlich sein könnten. Bisher wurde Nano-ESI-MS(n) in der Bioanalytik pflanzlicher Arzneistoffe nicht eingesetzt. In dieser Arbeit wurde diese Technik erstmals zum Screening von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und –urin benutzt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Nano-ESI-MS(n) auch eine empfindliche und sensitive Methode zur Identifizierung und zum Nachweis anderer medizinisch relevanter glykosidischer Verbindungen in biologischen Matrices darstellt, woraus sich neue Perspektiven für den Einsatz dieser Technik in der Metabolitenforschung sowie in der Bioanalytik pflanzlicher Xenobiotika ergeben. In den letzten Jahren rückte auch der Indische Weihrauch immer mehr in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen sowie therapeutischen Interesses. Aufgrund der selektiven Hemmung der 5-Lipoxygenase gewinnen AKBA und KBA, als neue entzündungshemmende Verbindungen, zunehmend an Bedeutung. Während die quantitative Analytik der Boswelliasäuren in Extrakten und in verschiedenen Fertigarzneimitteln erhebliche Fortschritte erzielen konnte, fehlten auf dem Gebiet der Bioanalytik bislang validierte analytische Methoden zur Durchführung pharmakokinetischer Studien. Vor diesem Hintergrund wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung von KBA in Humanplasma entwickelt und validiert. Die Methode ist durch eine einfache Probenvorbereitung gekennzeichnet, die sich auf eine Festphasenextraktion der KBA aus der komplex zusammengesetzten biologischen Matrix beschränkt. Im Anschluß an die chromatographische Trennung auf einer RP-C18 Säule erfolgt die Quantifizierung der KBA mittels UV-Detektion bei 250 nm. Um eine adäquate Bestimmung der KBA in Humanplasma zu gewährleisten, wurde eine umfassende Validierung durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter, wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte HPLC-Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Mit der Erstellung einer Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve im Rahmen einer ersten Pilotstudie konnte diese Methode zudem ihre praktische Anwendbarkeit unter Beweis stellen. Somit steht für zukünftige pharmakokinetische Studien eine validierte HPLC-Analytik zur Bestimmung von KBA, einer der Hauptwirkstoffe des Indischen Weihrauches, zur Verfügung, die sich durch hohe Spezifität, Reproduzierbarkeit und Präzision auszeichnet. Verlässliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen sind heute von besonderer Bedeutung, da sie helfen, die Dosierung zu optimieren, die biopharmazeutischen Eigenschaften von Präparaten zu verbessern und die Sicherheit bei der Anwendung zu erhöhen. Insbesondere im Hinblick auf bereits festgestellte Interaktionen von pflanzlichen Arzneimitteln mit Medikamenten reicht es nicht mehr aus, wenn sich pflanzliche Arzneimittel, wie beispielsweise Ginseng und Indischer Weihrauch, nur auf ihre langjährigen tradierten Anwendungserfahrungen berufen. So wird auch bei Phytopharmaka in verstärktem Maße eine wissenschaftliche Absicherung durch bioanalytische Forschung erwartet. Mit der Identifizierung der Ginsenoside und deren Degradationsprodukte im Menschen, der erstmaligen Anwendung von Nano-ESI-MS(n) in der Metabolitenforschung und der Entwicklung einer validierten bioanalytischen Methode zur Bestimmung der 11-Keto-β-Boswelliasäure in Humanplasma wurde diesen Erfordernissen Rechnung getragen.
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Bioanalytik von Keto-Boswelliasäuren und Untersuchung der Modulation des P-Glykoproteins durch Weihrauch und seine Inhaltsstoffe
(2006)
- Pflanzliche Arzneimittel erfreuen sich nach wie vor einer großen Beliebtheit. Da sie sich in enger Konkurrenz zu den auf Wirksamkeit und Unbedenklichkeit untersuchten chemisch definierten Arzneistoffen befinden, reicht es heute häufig nicht mehr aus, wenn Phytopharmaka sich nur auf ihre tradierte und dokumentierte Verwendung berufen. „Rationale“ Phytopharmaka müssen dieselben Anforderungen erfüllen, wie synthetische Arzneimittel. Das führt dazu, dass sich die Forschung neben der Aufklärung der chemischen Strukturen und Zusammensetzung der Pflanzenzubereitung, darüber hinaus auch der in-vitro und in-vivo Wirkung von Phytopharmaka widmet. Bei einigen dieser Untersuchungen konnte nicht nur die Wirkung des untersuchten Phytopharmakons aufgeklärt, sondern ebenso neue Indikationsgebiete eröffnet werden. So führte die Aufklärung des Wirkmechanismus des traditionell in der indischen Volksmedizin als Antirheumamittel angewandten Boswellia serrata-Extraktes dazu, dass Weihrauchzubereitungen heute in klinischen Studien auf Ihre Wirksamkeit bei der Behandlung des peritumoralen Hirnödems geprüft werden. In vorausgegangenen Tierstudien und klinischen Pilotstudien mit Glioblastom-Patienten konnte nämlich eine Reduktion des Hirnödems unter Weihrauchtherapie beobachtet werden. Die antiinflammatorischen, zytostatischen wie auch antiödematösen Effekte werden den im Weihrauch enthalten Boswelliasäuren zugeschrieben. Vor allem die ketylierten Boswelliasäuren KBA und AKBA zeigen in in-vitro Untersuchungen eine sehr hohe Wirksamkeit und gelten deshalb auch als Leitsubstanzen in der Monographie Boswellia serrata des DAC. Während einige Daten zur Bioverfügbarkeit von KBA bereits vorliegen, reichen die bisher zur Verfügung stehenden analytischen Methoden nicht aus, um die wesentlich geringere AKBA-Konzentration im Plasma zu bestimmen. Des Weiteren fehlte bisher der Nachweis, ob die Keto-Boswelliasäuren die Blut-Hirnschranke in der Tat überwinden können, um im ZNS zu wirken. Für die parallele Bestimmung von KBA und AKBA aus Plasma und Hirnmatrix wurde deshalb in dieser Arbeit eine sensitive analytische Methode entwickelt und gemäß internationalen Richtlinien validiert. Diese Methode ist charakterisiert durch eine sehr einfache Probenaufarbeitung mittels sorbensgestützter Flüssig-Flüssig-Extraktion auf Kieselgurbasis, gefolgt von einer chromatographischen Trennung auf einer RP-18-Säule und einer massenspektrometrischen Detektion anhand der Übergänge m/z 471,2 --> 95,1 für KBA und m/z 513,4 --> 91,1 für AKBA im positiven MRM-Modus. Die Quantifizierung erfolgte über die pentazyklische Triterpensäure „Asiatische Säure“, die als interner Standard eingesetzt wurde. Bei der anschließenden Validierung konnte die Spezifität der Methode nachgewiesen, sowie die international anerkannten Grenzen für die Linearität, die Nachweisgrenze sowie die inter- und intraday Präzision und Richtigkeit eingehalten werden. Die Stabilität der Plasma- und Hirnproben konnte bei T=-20°C für fünf Monate, bei Raumtemperatur für 24 Stunden und nach mehreren Einfrier-Auftauzyklen belegt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelte analytische Methode zur Aufnahme von Plasma-Spiegel-Kurven von KBA und AKBA nach oraler Administration von Weihrauchzubereitungen eingesetzt werden kann. Gegenüber den bereits beschriebenen HPLC-UV- und GC-MS-Methoden besitzt die neu entwickelte Methode den Vorteil, dass mit der Nachweisgrenze von 5 ng/ml für KBA und AKBA, auch die Plasmakonzentrationen von AKBA erstmals valide erfasst werden konnten. Da sie darüber hinaus eine einfache Probenaufarbeitung mit einer kurzen Analysenzeit von 6 Minuten verbindet, ist sie für die Durchführung von Pharmakokinetikstudien gut geeignet. Wie wichtig derartige pharmakokinetische Studien für die Etablierung von Weihrauch als rationales Phytopharmakon sind, erbrachte der Vergleich der Bioverfügbarkeit von H15™-Ayurmedica mit einem Referenzpräparat. Hierbei wurde deutlich, dass für die Resorption von KBA und AKBA neben der Extraktzusammensetzung auch die Arzneiform eine entscheidende Rolle spielt. Für die Zukunft stellt daher die Erhöhung der Bioverfügbarkeit von KBA und AKBA z.B. durch eine verbesserte technologische Formulierung einer der wichtigsten Meilensteine im Sinne einer verbesserten Therapie mit Weihrauchextrakt dar. Im Hinblick auf die potentielle Indikation von Boswellia serrata Extrakt für die Therapie des tumor-assoziierten Hirnödems wurde darüber hinaus untersucht, ob die beiden Keto-Boswelliasäuren die Blut-Hirn-Schranke überwinden und in das Hirn gelangen können. Dazu wurden die Konzentrationen von KBA und AKBA im Hirn nach einem Fütterungsversuch an neun gesunden Ratten bestimmt. Es konnten Spiegel von 99 ng/g für KBA und 95 ng/g für AKBA drei Stunden nach Gabe von 240 mg/kg Körpergewicht H15™-Ayurmedica detektiert werden. Bei gliominplantierten Ratten konnte mit der 3-mal täglichen Gabe dieses Präparates in dieser Dosierung eine Reduktion des Ödemvolumens, eine Zunahme von apoptotischen Zellen und eine Verlängerung der Überlebenszeit beobachtet werden. Interessant ist deshalb auch die Frage, wie es sich mit den Konzentrationen der Keto-Boswelliasäuren in Tumorgeweben verhält. Zur Klärung dieses Aspektes könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte LC-MS/MS-Methode beitragen. Häufig können die Chemotherapeutika in den Tumorzellen nicht die Spiegel des gesunden Gewebes erreichen. Dies kann in vielen Fällen in Verbindung mit der Effluxpumpe P-Glycoprotein (Pgp) gebracht werden. Dieses membranständige Transportprotein hindert Arzneistoffe daran in das Cytoplasma zu gelangen. Inwieweit eine Pgp vermittelte Resistenz bei den Glioblastomen eine Rolle spielt, ist derzeit noch nicht vollständig geklärt. Pgp ist darüber hinaus in seiner physiologischen Funktion an der schnellen Ausscheidung von Fremdstoffen und am Schutz spezieller Kompartimente, wie dem Gehirn, beteiligt. Eine Interaktion von Arzneistoffen mit Pgp kann deshalb auch die Pharmakokinetik dieser Substanzen empfindlich beeinflussen. Unter diesen Gesichtspunkten wurden in dieser Arbeit auch die pharmakologisch wichtigen Inhaltsstoffe des Weihrauchextraktes auf eine mögliche Modulation der Pgp-Funktion untersucht. Dieser Test erfolgte mittels zellbasierten Calcein-AM-Assays in Schweinehirnendothel-Zellen (PBCEC-Zellen) und in einer Pgp-expremierenden humanen Leukämiezelllinie (VLB-Zellen). In beiden Zellsystemen erwies sich Weihrauchextrakt (84μg/ml H15™-Ayurmedica) als ein Modulator der Transportfunktion von Pgp. Bei der Untersuchung der einzelnen Boswelliasäuren, stellte sich heraus, dass die im Extrakt am häufigsten vorkommenden β-Boswelliasäuren und Acetyl-β-Boswelliasäuren für diesen Effekt nicht verantwortlich sind. Auch die α-Boswelliasäure und Acetyl-α-Boswelliasäure beeinflussen ebenfalls die Transportaktivität nicht. Eine Interaktion mit dem Transportprotein konnte dagegen bei den Keto-Boswelliasäuren KBA (10 μM) und AKBA (3 μM) in den Schweinehirnendothelzellen beobachtet werden. In der Leukämiezelllinie konnte bei beiden Keto-Boswelliasäuren ebenfalls einen Einfluss auf die Transportaktivität des Pgp festgestellt werden, der allerdings nur bei AKBA (3 μM) signifikant war. Um zu verifizieren, ob die 11-Ketogruppe für die modulierende Wirkung der Boswelliasäuren verantwortlich ist, wurde Glycyrrhetinsäure, eine pentazyklische Triterpensäure, die wie KBA und AKBA eine Ketofunktion an Position 11 besitzt, getestet. Da im Calcein-AMAssay bei dieser Substanz ein mit AKBA vergleichbarer Effekt auftrat, scheint für eine Wechselwirkung des P-Glycoproteins mit Boswelliasäuren die 11-Ketogruppe essentiell zu sein. In dieser Arbeit wurde ein erster Hinweis auf eine Wechselwirkung zwischen Keto-Boswelliasäuren und Pgp erbracht. Inwiefern diese in-vitro-Daten auch auf in-vivo klinische Relevanz besitzen, muss noch in weiteren Studien mit Weihrauch geklärt werden. Gerade für die Behandlung des peritumoralen Hirnödems von Glioblastom-Patienten wäre es wichtig, den Mechanismus der Wechselwirkung von KBA und AKBA mit P-Glycoprotein näher zu untersuchen. Da Weihrauchextrakt häufig in der Co-Medikation verwendet wird, sollte auch im Hinblick auf die Arzneimittelsicherheit geprüft werden, ob es zu Arzneimittelinteraktionen auf Pgp-Ebene mit Weihrauchextrakt kommen kann.
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Vergleichende Untersuchungen zur pharmazeutischen Qualität von Phytopharmaka am Beispiel von Johanniskrautextrakt-Präparaten
(2002)
- Die vorliegende Arbeit beschreibt Untersuchungen zur Beurteilung der pharmazeutischen Qualität von Phytopharmaka am Beispiel der häufig eingesetzten Johanniskrautextrakt-Präparate. Elf Johanniskrautextrakt-Präparate des deutschen Arzneimittelmarktes wurden hinsichtlich Chargenhomogenität, Chargenkonformität und Gehalt der wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffe Gesamthypericin und Hyperforin untersucht. Außerdem wurde die Freisetzung von Hyperforin, Hypericinen und Flavonoiden aus verschiedenen Präparaten in kompendialen und biorelevanten Medien geprüft. Zur Analytik des Hyperforins und der Flavonoide wurden zwei HPLC-Verfahren etabliert und nach ICH-Guidelines validiert. Die Analysenzeit der isokratischen Methode zur Bestimmung von Hyperforin war mit 10 Minuten sehr kurz. Somit war die Methode sowohl für die Gehaltsbestimmungen als auch für die Freisetzungsuntersuchungen sehr gut geeignet. Zur Bestimmung der Flavonoide Rutin, Hyperosid/ Isoquercitrin und Quercitrin wurde eine Gradientenelution verwendet, wodurch eine Analysenzeit von 18 Minuten resultierte. Gesamthypericin wurde mittels Differentieller Puls-Polarographie nach Belichtung der Proben bestimmt. Die Ergebnisse der Untersuchung zur Chargenhomogenität von Gesamthypericin und Hyperforin belegten für nahezu alle Präparate eine gute Gleichförmigkeit des Gehaltes der analysierten wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffe. Im Bezug auf die Chargenkonformität hinsichtlich Gesamthypericin wiesen die Präparate unterschiedliche Resultate auf. Zwar ist es seit Erscheinen des „Bühler-Papiers“ nicht mehr zulässig auf einen definierten Gehalt an Gesamthypericin, zu normieren, einige Extrakthersteller ziehen diese Substanzgruppe jedoch als analytischen Qualitätsparameter bei der Herstellung standardisierter Extrakte heran. So zeigten vier Präparate bei der Untersuchung von je fünf Chargen mit relativen Standardabweichungen von unter 10% eine gute Reproduzierbarkeit des Gesamthypericingehaltes. Die übrigen Präparate wiesen mehr oder weniger starke Schwankungen im Gesamthypericingehalt auf. Die Untersuchung der Chargenkonformität bezüglich Hyperforin führte zu dem Ergebnis, daß lediglich für zwei Präparate (eines Herstellers) eine sehr gute Reproduzierbarkeit des Hyperforingehaltes erreicht wurde. Hier betrugen die relativen Standardabweichungen weniger als 4%. Die übrigen Präparate zeigten mehr oder weniger starke Schwankungen, wobei für ein Präparat der Variationskoeffizient 70% betrug. Auffällig ist, daß die Präparate mit einheitlichen Hyperforingehalten höhere relative Standardabweichungen von ca. 20% bzgl. des Gesamthypericingehaltes zeigten. Umgekehrt zeigten Präparate mit einheitlichem Gesamthypericingehalt oftmals höhere Variationskoeffizienten bei den Hyperforingehalten. Eine gute Chargenkonformität für beide Analyten wiesen lediglich drei Präparate auf. Der relative Gesamthypericingehalt im Extrakt betrug zwischen 0,11 und 0,43%, während der Absolutgehalt an Gesamthypericin Werte zwischen 0,33 und 1,92 mg je Darreichungsform aufwies. Orientiert an den Einnahmeanweisungen der Hersteller lagen die maximalen Tagesdosen Gesamthypericin zwischen 1,00 und 3,69 mg Gesamthypericin. Die gefundenen relativen Hyperforinmengen lagen in der Regel zwischen 1,09 und 4,48% im Extrakt, wobei ein einzelnes Präparat weniger als 0,2% Hyperforin im Extrakt aufwies. Für den Absolutgehalt an Hyperforin wiesen die Präparate Werte zwischen weniger als 0,5 und 28,88 mg auf. Unter Berücksichtigung der Einnahmeempfehlungen des Herstellers ergaben sich daraus Tagesmaximaldosen zwischen < 1 und 53,76 mg Hyperforin. Die Ergebnisse der Freisetzungsuntersuchungen in kompendialen und biorelevanten Medien zeigten, daß Hyperforin im sauren Milieu des Magensaftes nicht freigesetzt wird und es auch unter Bedingungen, die den nüchternen Zustand im proximalen Dünndarm simulieren lediglich zu einer geringfügigen Freisetzung aus der Arzneiform kam. Eine gute Freisetzung konnte hingegen im Medium FeSSIF erreicht werden, daß die Bedingungen des proximalen Dünndarms im gesättigten Zustand simuliert. Gesamthypericin ging zwar im sauren pH-Milieu des Magensaftes ebenfalls nicht in Lösung, unter simulierten Nüchternbedingungen im Dünndarm konnte im Gegensatz zu Hyperforin aber bereits eine gute Freisetzung verzeichnet werden. Die untersuchten Flavonoide zeigten in allen verwendeten Medien eine gute Freisetzung. Der Vergleich verschiedener Präparate ergab starke Unterschiede hinsichtlich ihrer Freisetzungscharakteristik. Dabei ergaben sich Abweichungen sowohl hinsichtlich Geschwindigkeit als auch bezüglich Vollständigkeit der Freisetzung der untersuchten Inhaltsstoffe. Eine Tatsache ist, daß Präparate, die laut Deklaration als pharmazeutisch äquivalent einzustufen wären, sich einerseits im Bezug auf den Gehalt an pharmazeutisch-relevanten Inhaltsstoffen und andererseits auch in ihrem in-vitro-Freisetzungverhalten unterschiedlich verhalten und somit nicht als biopharmazeutisch äquivalent gelten können. Dies läßt den Schluß zu, daß Johnniskrautextrakt-Präparate zur Therapie leichter bis mittelschwerer Depressionen nicht ohne weiteres untereinander ausgetauscht werden sollten. Es ist unumstritten, daß Bedarf an neuen aussagekräftigen Beurteilungsansätzen zur Qualität von Phytopharmaka vorhanden ist. In dieser Arbeit wurde eine neue und verfolgenswerte Idee zur vergleichenden Bewertung der pharmazeutischgalenischen Qualität von Phytopharmaka am Beispiel von Johanniskrautextrakt-Präparaten aufgezeigt.
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Entwicklung, Validierung und Anwendung einer LC-MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Niacin und zweier Metaboliten in Humanplasma
(2005)
- Niacin ist neben seiner Bedeutung als Vitamin im menschlichen Organismus ein seit langem bekannter Wirkstoff bei der Therapie von Fettstoffwechselstörungen. Sein großer Vorteil gegenüber anderen Lipidsenkern liegt in der positiven Beeinflussung aller bedeutenden Lipid – Bestandteile im Blut. Es wird im menschlichen Organismus sehr rasch metabolisiert. Die beiden Hauptmetaboliten sind das Nikotinamid und die Nikotinursäure. Angesichts der pharmakologischen und therapeutischen Bedeutung von Niacin, spielt die Analytik dieser Verbindung sowie seiner Metaboliten eine wichtige Rolle, zumal Niacin aktuell in immer weiteren Präparaten (unter anderem in Form von Kombipräparaten) weiterentwickelt und eingesetzt wird. Es überraschte daher, dass bislang in der Literatur keine LC-MS Methode zur Bestimmung von Niacin beschrieben war, wo sich doch die LC-MS in den letzten Jahren zur vorherrschenden Analysentechnik für die Analyse von Biomolekülen und Wirkstoffen in biologischen Matrices entwickelt hat, da sie in der Regel geringe Anforderungen an die Probenaufarbeitung stellt und einen hohen Probendurchsatz erlaubt. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch erstmals gezeigt werden, dass LC-MS eine leistungsfähige Methode zur simultanen, quantitativen Bestimmung von Nikotinsäure, Nikotinamid und Nikotinursäure in Humanplasma darstellt. Die vorgestellte Methode beweist hohe Selektivität, Empfindlichkeit, Genauigkeit, Richtigkeit und Reproduzierbarkeit im Konzentrationsbereich von 50.0 – 750 ng/mL Plasma für alle drei Analyten bei relativ kurzer Analysenzeit. Verglichen mit früher entwickelten Methoden ist keine zeitaufwendige Probenaufarbeitung notwendig. Alle drei Analyten konnten in einem Schritt mit einer einzigen Festphasenextraktion ohne zeitaufwendige Derivatisierungschritte aus Plasma extrahiert werden. Die Validierung dieser Methode wurde gemäß aktuell geltender Standards durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte LC-MS Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Innerhalb einer klinischen Bioäquivalenz-Studie zu 1000 mg Niacin Tabletten, die erfolgreich bei AAI Development Services durchgeführt wurde, konnten gute und plausible Ergebnisse erzielt werden. Der validierte Konzentrationsbereich war ausreichend um alle drei Analyten zufriedenstellend zu detektieren. Damit zeigt sich, dass diese entwickelte LC-MS Methode eine leistungstarke Alternative zur simultanen Bestimmung von Niacin und seinen Hauptmetaboliten darstellt, welche erfolgreich in pharmakokinetischen oder toxikokinetischen Studien eingesetzt werden kann. Die in dieser Dissertation vorgestellte Analysenmethode wurde inzwischen in der Fachliteratur publiziert [83]. Eine Kopie dieser Publikation ist dieser Arbeit beigefügt.
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Synthese und in vitro-pharmakologische Charakterisierung von dualen PPARalpha/gamma-Agonisten
(2005)
- Die Behandlung von Hypertriglyceridämien und Insulinresistenz erfolgt heute vor allem durch den Einsatz der Fibrate und Thiazolidindione (TZDs). Eine neue Wirkstoffklasse stellen die vor der Zulassung stehenden Glitazare dar, die als duale PPARalpha/gamma-Agonisten die lipidsenkenden Eigenschaften der Fibrate und die insulinsensitivierenden Eigenschaften der TZDs in einer Molekülklasse vereinen. Peroxisomen Proliferator-aktivierte Rezeptoren (PPARs) gehören zur Klasse der nukleären Rezeptoren, von denen drei Subtypen (PPARalpha, beta und gamma) bekannt sind. PPARalpha fungiert als molekulares Target für die Klasse der Fibrate, welche als Lipidsenker eingesetzt werden, wohingegen die Thiazolidindione (TZDs) bei Typ 2 Diabetes indiziert sind und ihre Wirkung als selektive PPARgamma-Aktivatoren (Insulinsensitizer) entfalten. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten wie Muraglitazar und Tesaglitazar stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, deren Zulassung beantragt ist und die zukünftig zur Behandlung von Typ 2 Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung am selektiven PPARalpha-Agonist Pirinixinsäure (WY 14643) mit Hilfe subtypspezifischer Reportergenassays durchgeführt. Dabei wurde wurde zunächst eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha-Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand im Allgemeinen in einer vierstufigen Reaktionsfolge. Die PPAR-Modulatoren 18-25, 30, 53-59, 62, 65, 69, 71, 73 und 74-77 wurden in vitro-pharmakologisch unter Anwendung Subtyp-selektiver Reportergen-Assays (mPPARalpha, hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich (Substanzen 18-25) der Leitstruktur WY 14643 (EC50 (hPPARalpha) = 39.8 mikroM, EC50 (hPPARgamma) = 53.7 mikroM) konnte im Falle der 4-Halogenaryl-substituierten Liganden 18 (Br) und 20 (Cl) eine signifikante Steigerung der hPPARalpha-Aktivität um den Faktor 4 (18) bzw. den Faktor 3 (20) erzielt werden. Die Inaktivität der Precursorverbindungen 74-77 demonstriert den für PPAR-Aktivität essentiellen terminalen hydrophoben Molekülrest, welcher dem 2,3-Dimethylphenyl-Rest von WY 14643 entspricht. Die alpha-alkylsubstituierten Derivate 53-57 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Die EC50-Werte (hPPARalpha) der Carbonsäuren 53-57 und 62 liegen zwischen 1.2 und 8.8 mikroM, wobei sich das alpha-Hexyl-Derivat 57 und das alpha-Butyl-Derivat 56 mit EC50-Werten von 1.2 mikroM (57) bzw. 1.3 mikroM (56) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um Faktor 33 (57) bzw. Faktor 30 (56) als besonders potent erwies. Am hPPARgamma präsentieren ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 56 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 57 mit EC50-Werten von 3 mikroM (56) bzw. 3.6 mikroM (57) und einer Steigerung der Bindungsaktivität gegenüber WY 14643 von ~Faktor 18 (56) bzw. ~Faktor 15 (57) die Verbindungen mit der höchsten PPARgamma-Aktivität. Im Rahmen dieser Dissertation gelang somit die Auffindung neuartiger Leitstrukturen 56 und 57. Die alpha-butyl- und alpha-hexylsubstituierten Liganden 56 und 57 besitzen dualen hPPARalpha/gamma-Charakter. Die PPARalpha/gamma-agonistischen Eigenschaften der neuentwickelten alpha-alkylsubstituierten Pirinixinsäurederivate werden durch ein von Pirard et al etabliertes Pharmakophor- und Selektivitätsmodell, welches die Ligandenbindungsdomäne (LBD) der PPARs durch fünf Bindungstaschen beschreibt, unterstützt. Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt offensichtlich zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY 14643 stärkeren Bindung an die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors.
