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In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle retinaler Perizyten nach einer Infektion mit dem Humanen Zytomegalievirus und deren mögliche Beteiligung an einer HCMV-Retinitis untersucht. Zunächst wurde die Isolation, Kultivierung und Vermehrung von humanen retinalen Perizyten (HRP) etabliert. Eine erfolgreiche Isolation der HRP ist abhängig vom Alter des Spenders, welches unter 50 Jahren liegen sollte, als auch vom Zeitpunkt der Entnahme des Auges. Dabei sollten die Retinae spätestens nach 48 h post mortem aus den Augen präpariert werden. Nach Aufschluss mit einem Dispase/Kollagenase-Gemisch und Separation über ein Zellnetz wurden die isolierten Perizyten auf mit Fibronektin oder ECM (extrazelluläre Matrix) beschichtete Kulturflaschen ausgebracht. Aufgrund der Optimierung des Mediums war es zum ersten Mal möglich, humane retinale Perizyten über 12-15 Passagen zu kultivieren. Somit standen genügend Zellen zur Analyse der Infizierbarkeit mit HCMV und für die Reportergenanalyse zu Verfügung.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Zellen mit HCMV infizierbar sind, jedoch keine lytische Infektion stattfindet und nur wenige Zellen einen zytopathischen Effekt zeigen. Mithilfe von Titerbestimmungen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen infizierter Perizyten konnte die Virusreplikation und die Bildung reifer bzw. funktioneller Viruspartikel nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die Expression der viralen IE- und late-Proteine in HCMV-infizierten Perizyten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und quantitativer RealTime-PCR nachgewiesen. Während einer HCMV-Infektion werden unterschiedliche inflammatorische Prozesse induziert. Dazu gehört z. B. die Aktivierung zellulärer Transkriptionsfaktoren, welche durch ihre Bindung an Promotorregionen die Transkription verschiedener Gene die für Zytokine und Adhäsionsmoleküle kodieren, und andere Transkriptionsfaktoren beeinflussen (Pahl, 1999). Der Transkriptionsfaktor NF-κB wird als Hauptregulator für die HCMV-Replikation beschrieben, in retinalen Perizyten wird NF-κB jedoch nicht aktiviert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung und Genexpressionsstudien konnte ein weiterer proinflammatorischer Prozess, die Überexpression von ICAM-1, in infizierten Perizyten nachgewiesen werden. ICAM-1 bewirkt die Infiltration und Anhaftung von Leukozyten an infizierten Zellen. Durch Adhäsionsstudien wurde eine 4,6-fach gesteigerte Anhaftung an HCMV-infizierten Perizyten nachgewiesen, welche durch blockierende Antikörper wieder aufgehoben werden konnte. Durch Expressionanalysen von Chemokin- und Interleukingenen mittels qRT-PCR und ELISA-Analysen konnten erhöhte Sekretionen von CCL2, CCL5, CXCL10 und IL-8 in HCMV-infizierten HRP nachgewiesen werden. Die Resultate einer Infektion mit Vollvirus wurden durch die Transfektion mit Expressionsplasmiden für die viralen Proteine IE1/2 bestätigt. Eine gesteigerte Expression der Zytokine wurde vor allem durch die Überexpression von IE2 und synergistisch durch IE1/2 nachgewiesen. Eine durch IE1 induzierte Expression wurde nur für CCL2 detektiert. Die viralen IE-Proteine sind potentielle Transaktivatoren viraler und zellulärer Promotoren. Ziel war es, den Einfluss auf die Promotoren der Zytokingene (von -3000bp bis 100 bp) durch Koexpression der viralen IE1/IE2-Proteine mittels Luciferase-Reportergenassays in HRP zu untersuchen. Nur der CCL2-Promotor (-1355/+55) zeigte eine erhöhte basale Promotor-aktivität. Um den Einfluss der IE-Proteine auf die Promotoren zu untersuchen, wurden Kotransfektionen mit den Expressionsplasmiden für IE1/2 und den Reportergen-konstrukten der Zytokingene durchgeführt. Dabei zeigten die Analysen mit den Minimalpromotoren (TATA-Box/NF-κB Bindungsstellen) keine erhöhten Luciferaseaktivitäten. NF-κB wurde durch eine HCMV-Infektion nicht aktiviert, somit ist die Transaktivierung der Promotoren von CCL2, CCL5, CXCL10, IL-8 und ICAM-1 in infizierten Perizyten vermutlich NF-κB unabhängig. Die Transaktivierung dieser Promotoren könnte durch AP-1 vermittelt sein, da die höchsten Luciferaseaktivitäten durch die Kotransfektion mit strangabwärts gelegenen Promotorbereichen erhalten wurden, in diesen Bereichen befinden sich potentielle Bindungsstellen für AP-1, SP-1 und anderer Transkriptionsfaktoren. Mittels Western Blot-Analyse wurde eine Induktion der Expression von AP-1 durch HCMV nachgewiesen, somit wird die HCMV-Replikation in HRP vermutlich über AP-1 vermittelt.
In der vorliegenden Arbeit wurden primäre humane Perizyten isoliert und erstmals mit HCMV infiziert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Zellen als Modellsystem zur Untersuchung einer HCMV-Retinitis von großer Bedeutung sind. Aufgrund ihres hohen Anteils in der Retina, ihrer schützenden Funktion für die Blut-Retina Schranke sowie ihrer Beteiligung an der HCMV-Retinitis spielen diese bisher nur wenig untersuchten Zellen, offensichtlich eine große Rolle im immunpriviligiertem Auge. Für die Etablierung neuer Therapieansätze für eine HCMV-Retinitis könnten detailliertere Untersuchungen retinaler Perizyten Aufschluss über den Replikationsmechanismus von HCMV und die damit verbundenen inflammatorischen Prozesse während einer HCMV-Retinits bieten.
Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Mit dem Ziel Kranheitsgene ihren Signalwegen zuzuordnen wurde in dieser Dissertation ein in situ Proteinmarkierungssystem entwickelt, das Hochdurchsatz-proteomik in mES Zellen ermöglicht. Das System beinhaltet die Einführung einerProteinmarkierungskassette in mES Zellen, die konditionale FlipROSAβgeo-Genfal-lenintegrationen in proteinkodierenden Genen enthalten. Weil die Konditionalität der FlipROSAβgeo-Genfallenkassette auf einem sequenzspezifischen Rekombinations-mechanismus beruht, kann diese postinsertionell über Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) durch eine Proteinmarkierungskassette ersetzt werden. Das hierfür entwickelte Konstrukt entspricht einem durch 5’ Spleißakzeptor- und 3’ Spleißdonorsequenzen definierten dizistronischen Exon, in dem ein Hygromyzin-Resistenzgen über eine P2A Polyproteinspaltungssequenz mit einem für das egfp (enhanced green fluorescent protein) kodierenden nLAP-Tag (N-terminal localization and affinity purification) verbunden ist. Eine erste Validierung dieses Exons in einem retroviralen Genfallenansatz ergab, dass sämtliche in Hygromyzin selektierte und auf DNA-Kassettenintegrationen untersuchte Klone nLAP-markierte Proteine exprimierten. Im Folgenden wurden in den GGTC (German Gene Trap Consortium) und EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Project) mES Zellressourcen Genfallenintergationen identifiziert, die sich für eine RMCE vermittelte, N-terminale in situ Proteinmarkierung eignen. Als kompatibel wurden Genfallenklone klassifiziert, die eine FlipROSAβgeo-Integration im ersten Intron eines proteinkodierenden Gens aufweisen, wobei diese Integration sowohl hinter einem ersten nichtkodierenden, als auch hinter einem ersten kodierenden Exon liegen kann. Allerdings darf im letzteren Fall die kodierende Sequenz keine funktionale Domäne enthalten und muss kurz genug sein, um bei Verlust nicht mit der endogenen Proteinfunktion zu interferieren. Auf diesen Kriterien basierend wurden in den GGTC und EUCOMM Ressourcen 25.130 Proteinmarkierungs-kompatible Genfallenklone identifiziert, die 3.695 mutierten Genen entsprechen. Hiervon wurden acht für die Validierung der RMCE-vermittelten Proteinmarkierungsstrategie ausgewählt. In jedem Fall gelang es die Genfallen-kassette mit dem Proteinmarkierungsexon zu ersetzten. Sowohl der Genfallen-, als auch der RMCE-Proteinmarkierungsansatz führte ohne Ausnahme zur Expression nLAP-Tag markierter Proteine, wobei in allen 13 untersuchten Klonen die Größe der markierten Proteine derjenigen der entsprechenden nativen Proteine mit zusätzlichem Marker entsprach. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die physiologische Expression der markierten Proteine sich von denen der Wildtypproteine in der Regel nicht unterscheidet und für Lokalisations- und massenspektrometrische Interaktionsstudien ausreicht. Darüber hinaus spiegelten 90% der hier untersuchten markierten Proteine das subzelluläre Lokalisationsmuster der entsprechenden nativen Proteine wider. Ähnlich verhielt es sich mit den Interaktionspartnern der jeweiligen Proteine, die sich aus bereits bekannten, aber auch noch bisher unbekannten Proteinen zusammensetzen. Insgesamt wurden in dieser Dissertation die Voraussetzungen zu einer Hochdurchsatzproteomanalyse in mES Zellen geschaffen. Während der RMCE-Ansatz die Markierung von über 3.600 Proteinen in mES Zellen ermöglicht, eignet sich der Genfallenansatz neben der Proteinmarkierung in murinen auch für die Markierung von Proteinen in humanen Zellen. In dieser Hinsicht ist die Markierung von Proteinen in humanen ES Zellen und in reprogrammierten Stammzellen (iPS) von Patienten mit unterschiedlichsten Erkrankungen besonders attraktiv, weil damit sowohl Spezies- als auch Krankheitsspezifische Unterschiede im Ablauf individueller Signaltransduktionskaskaden definiert werden können.
Type 1 diabetes (T1D) is a chronic T cell-mediated autoimmune disorder that results in the destruction of insulin-producing pancreatic ß cells leading to life-long dependence on exogenous insulin. Attraction, activation and transmigration of inflammatory cells to the site of ß-cell injury depend on two major molecular interactions. First, interactions between chemokines and their receptors expressed on leukocytes result in the recruitment of circulating inflammatory cells to the site of injury. In this context, it has been demonstrated in various studies that the interaction of the chemokine CXCL10 with its receptor CXCR3 expressed on circulating cells plays a key role in the development of T1D. Second, once arrived at the site of inflammation adhesion molecules promote the extravasation of arrested cells through the endothelial cell layer to penetrate the site of injury. Here, the junctional adhesion molecule (JAM) JAM-C expressed on endothelial cells is involved in the process of leukocyte diabedesis. It was recently demonstrated that blocking of JAM-C efficiently attenuated cerulein-induced pancreatitis in mice. In my thesis I studied the influence of the CXCL10/CXCR3 interaction on the one hand, and of the adhesion molecule JAM-C on the other hand, on trafficking and transmigration of antigen-specific, autoaggressive T cells in the RIP-LCMV mouse model. RIP-LCMV mice express the glycoprotein (GP) or the nucleoprotein (NP) of the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) as a target autoantigen specifically in the ß cells of the islets of Langerhans and turn diabetic after LCMV-infection. In my first project I found that pharmacologic blockade of CXCR3 during development of virus-induced T1D results in a significant delay but not in an abrogation of overt disease. However, neither the frequency nor the migratory properties of islet-specific T cells was significantly changed during CXCR3 blockade. In the second project I was able to demonstrate that JAM-C was upregulated around the islets in RIP-LCMV mice after LCMV infection and its expression correlated with islet infiltration and functional ß-cell impairment. Blockade with a neutralizing anti-JAM-C antibody slightly reduced T1D incidence, whereas overexpression of JAM-C on endothelial cells did not accelerate virus-induced diabetes. In summary, our data suggest that both CXCR3 as well as JAM-C are involved in trafficking and transmigration of antigen-specific autoaggressive T cells to the islets of Langerhans. However, the detection of only a moderate influence on the onset of clinical disease during CXCR3 or JAM-C blockade reflects the complex pathogenesis of T1D and indicates that several different inflammatory factors need to be neutralized in order to achieve a stable and persistent protection from disease.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei verschiedenen Hämostasedefekten eine unterschiedliche Aktivierung des Gerinnungssystems besteht. So wiesen Personen mit heterozygoter Prothrombin-Mutation (G20210A) eine massiv erhöhte Thrombinbildung auf, während sie in den üblichen Globaltests (Prothrombinzeit (PT) und aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)) und der Thrombinzeit (TZ) nicht pathologisch waren. Bei Personen mit reaktiv aktiviertem Gerinnungssystem war ebenfalls eine erhöhte Thrombinbildung nachweisbar, zudem war die aPTT verkürzt. Dagegen zeigten Personen mit Antiphospholipidsyndrom und Personen mit heterozygoter/homozygoter FV-Leiden-Mutation eine leicht gesteigerte Thrombinbildung, ferner waren die anderen plasmatischen Tests (PT, aPTT, TZ), außer der Lupus-Antikoagulans-sensitiven aPTT, unauffällig. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war.
Hintergrund: In den letzten Jahren ist der Diabetes mellitus zunehmend in den Fokus des weltweiten Interesses gerückt. Zahlreiche Arbeiten konnten eindrucksvoll aufzeigen, dass der Diabetes mellitus mit einer erhöhten Morbidität, einer verringerten Lebensqualität und Lebenserwartung sowie mit enormen Kosten für den einzelnen sowie die Gesellschaft verbunden ist. Um dieser „Lawine“ entgegenzutreten, sind in den letzten Jahren zahlreiche Anstrengungen unternommen worden. Eine war die Einführung zahlreicher neuer Wirkstoffe und Wirkstoffklassen, wie beispielsweise der kurzwirksamen Insulinanaloga. Aus pathophysiologischer Sicht bieten die Insulinanaloga gegenüber dem entsprechenden kurzwirksamen Humaninsulin zahlreiche Vorteile. Seit Einführung des ersten kurzwirksamen Insulinanalogas steht aber auch die Frage im Raum, ob und in wie weit die erheblichen Mehrkosten, die eine Therapie mit Insulinanaloga im Vergleich zu kurz wirksamem Humaninsulin verursachen, durch einen Zusatznutzen gerechtfertigt sind. Ein Cochrane-Review aus dem Jahr 2006 sowie eine Bewertung des Instituts für Qualität und Wirtschaftlichkeit im Gesundheitswesen aus dem Jahr 2005 bescheinigten den kurzwirksamen Insulinanaloga nur einen geringen bzw. keinen Zusatznutzen im Vergleich zu Humaninsulin. Werden neben dem IQWiG-Bericht weitere Quellen herangezogen, die Aussagen zum Nutzen von Medikamenten machen, wie beispielsweise Leitlinien, finden sich zum Teil widersprüchliche Aussagen, obwohl alle zuvor genannten Publikationen für sich in Anspruch nehmen, die Grundlagen der Evidence based Medicine zu berücksichtigen. Sowohl innerhalb der primären (Klinische Studien) und sekundären (Metaanalysen, HTAs, Leitlinien) klinischen Evidenz, als auch im Vergleich zu Studien zur Pharmakokinetik und –dynamik herrscht eine Diskrepanz, die weiterer Analysen im deutschen Versorgungskontext bedarf. Methodik und Daten: Es wurde ein systematischer Review zu Metaanalysen über den Vergleich von kurzwirksamen Insulinanaloga vs. kurzwirksamem Humaninsulin wie auch zu Leitlinien hinsichtlich Empfehlungen zur Anwendung von kurzwirksamen Humaninsulin bzw. Insulinanaloga in der Evidenz und Versorgungsrealität von kurzwirksamen Insulinanaloga in der Behandlung des T2DM 3 Behandlung von Typ-2-Diabetikern durchgeführt. Die identifizierten Publikationen wurden nach internationalen Kriterien und mit Methoden der EbM bewertet. In einem zweiten Schritt, wurde die Versorgungsrealität, abgebildet über Routinedaten der Gesetzlichen Krankenversicherung Gmünder ErsatzKassse, untersucht. Hierfür wurden sowohl die Stammdaten, Arzneimitteldaten, Stationäre- und ambulante Daten sowie Daten aus den Disease Management Programmen verwendet. Die Identifikation von Typ-2-Diabetikern die erstmals ein kurzwirkendes Insulin nutzten, erfolgte über ein mehrstufiges Prinzip, welches eine Erweiterung der „internen Diagnosevalidierung“ nach Ferber und Kollegen darstellt. In einem abschließenden dritten Schritt werden die Ergebnisse aus dem deutschen Versorgungskontext mit den Angabenaus der publizierten klinischen Evidenz abgeglichen. Ergebnisse: Neben dem Abschlussbericht des IQWiG konnten über die systematische Evidenzrecherche zwei weitere systematische Reviews inklusiver Metaanalyse sowie 16 Leitlinien identifiziert und in die Untersuchungen eingeschlossen werden. Im Vergleich der verschiedenen Datensätze zeigt sich eine große Diskrepanz zwischen Studienpatienten auf der einen und Patienten im deutschen Versorgungskontext auf der anderen Seite. Insgesamt konnte die vorliegende Arbeit die nicht ausreichende Evidenzbasis für einen Zusatznutzen der Analoga erneut bestätigen und weiteren Forschungsbedarf aufzeigen. Fazit: Die kurzwirksamen Insulinanaloga sind nur ein Beispiel für Arzneistoffe (-klassen), bei denen Fragen zur Kosten-Nutzen-Relation aufgrund hoher Tagestherapiekosten und eines geleichzeitig beschränkten Budgets der GKV relevant sind. Die Zukunft unseres Gesundheitssystems wird mit davon abhängen, wie das Verfahren der Kosten-Nutzen-Bewertung konkret in Deutschland umgesetzt wird bzw. wie der Marktzugang geregelt werden soll. Eine Grundbedingung ist hierbei, dass die Versorgungs- wie auch die Outcomeforschung in Deutschland ausgebaut, der Umgangmit fehlenden Daten umfassend diskutiert wird und die verfügbaren Daten stärker miteinander verknüpft werden.
Die trimeren P2X–Rezeptoren sind nicht–selektive Kationenkanäle, die durch Adenosintriphosphat (ATP) aktiviert werden. Es gibt sieben Untereinheiten (P2X1–7). P2X–Rezeptoren sind in nahezu jedem Gewebe exprimiert und dort an den verschiedensten physiologischen Vorgängen beteiligt. Neben den „Cys–Loop“–Rezeptoren und den ionotropen Glutamat–Rezeptoren stellen die P2X–Rezeptoren eine eigenständige Familie von Neurotransmitter–gesteuerten Rezeptoren dar. Eine Untereinheit der trimeren P2X–Rezeptoren besteht aus den intrazellulären N– und C–Termini und zwei Transmembrandomänen, die über eine große extrazelluläre Domäne verbunden sind. Da weder ein P2X–homologes lösliches Protein für Kristallisationsstudien noch ein Gewebe zur Aufreinigung großer Mengen von P2X–Rezeptorprotein zur Verfügung steht, stützen sich Struktur–Funktions–Studien auf einzelpunktmutierte Rezeptoren in heterologen Expressionsystemen. Einige Aminosäuren, die bei Austausch gegen Alanin eine deutliche Verschiebung der Dosis–Wirkungs–Kurve von ATP bewirken und von denen daher vermutet wird, dass sie an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Ob sich die Agonisten–Bindungstasche der P2X–Rezeptoren zwischen zwei Untereinheiten, wie bei den nikotinischen Acetylcholin–Rezeptoren, oder innerhalb einer Untereinheit, vergleichbar mit den ionotropen Glutamat–Rezeptoren, befindet, ist weitgehend ungeklärt. Um die Lokalisation der ATP–Bindungstasche zu bestimmen, wurden, basierend auf vorhandener Literatur, potenziell an der ATP–Bindung beteiligte Aminosäuren des P2X1–Rezeptors durch zielgerichtete Mutagenese gegen Cysteine ausgetauscht und die P2X–Rezeptormutanen in Xenopus laevis–Oozyten exprimiert. Das Ziel dabei war, quervernetzte Cystein–Mutanten durch Disulfidbrückenbildung zwischen den substituierten Cysteinen zu identifizieren und so die Distanz von Aminosäure–Seitenketten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, zu bestimmen. Für die biochemischen Untersuchungen wurden entweder alle neu gebildeten Proteine der Oozyten metabolisch durch Inkubation mit radioaktivem [35S]–Methionin oder selektiv die Plasmamembran– ständigen Proteine mit Sulfo–NHS–Fluoreszenz–Farbstoffen markiert. Die Rezeptormutanten wurden affinitätschromatographisch über ein N–terminales Hexahystidyl–Motiv unter nicht–denaturierenden Bedingungen aufgereinigt und mit nicht–reduzierender SDS–Polyacrylamid–Gelelektrophorese (PAGE) auf Expression sowie mit Blauer–Nativer–PAGE auf korrekte Trimerisierung überprüft. Darüber hinaus wurden homologe Cystein–Substitutionen einer P2X2–1–Chimäre, welche dieselben Bindungseigenschaften des P2X1–Rezeptors besitzt, mittels der Zwei–Elektroden–Spannungsklemme charakterisiert (TEVC). Die Koexpression der verschiedenen P2X–Mutanten ergab eine spontane Quervernetzung über Disulfidbrücken zwischen den P2X1 K68C– und F291C–Mutanten, die in nicht–reduzierenden SDS–PAGE–Gelen über eine Dimerbildung nachgewiesen werden konnte. Dies deutet auf eine geringe Distanz zwischen diesen Cystein–substituierten Aminosäuren hin. Die Ausbildung der Disulfidbrücke konnte nach Reduktion der Quervernetzung während der Aufreinigung und durch Zugabe von ATP verhindert werden. In funktionellen Studien der P2X2–1 K68C/F291C–Doppelmutante war es entsprechend möglich die Disulfidbrücke reversibel zu reduzierenden. In den Mutantenkanäle exprimierenden Xenopus–Oozyten wurde der geringe Rezeptorstrom durch Reduktion mit DTT ca. 60fach potenziert und dadurch überhaupt messbar gemacht. Die Reoxidation durch H2O2 wurde wie in den biochemischen Experimenten in Anwesenheit von ATP ebenfalls verhindert. Da die Aminosäuren K68 und F291 des P2X1–Rezeptors möglicherweise an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, sind diese Ergebnisse die ersten direkten experimentellen Hinweise auf die Aposition von Domänen benachbarter Untereinheiten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind. Demnach befindet sich die ATP–Bindungstasche an der Grenzfläche zwischen zwei Untereinheiten der P2X–Rezeptoren. Die Koexpression homologer Cystein–substituierter P2X2–, P2X3– und P2X4–Rezeptoren zeigte analog zu den P2X1–Experimenten eine spontane Dimerisierung der P2X2 K69C– und F289C–Mutanten. Eine mäßige Quervernetzung von zwei Untereinheiten der P2X3 K63C– und F280C– sowie der P2X4 K67C– und F294C–Mutanten konnte nach Anwendung einer ca. 0,5 nm langen Cystein–spezifischen quervernetzenden Substanz erreicht werden. Die paarweise Kombination der P2X1–, P2X2–, P2X3–und P2X4–Cystein–Mutanten zeigte selbst nach Anwendung quervernetzender Substanzen nur in der Kombination von P2X1–K68C und P2X2–F289C eine Quervernetzung von zwei unterschiedlichen Untereinheiten eines heteromeren P2X1/2–Rezeptors. Diese Kombination konnte in elektrophysiologischen Messungen durch Reduktion der Disulfidbrücke spezifisch messbar gemacht und somit die Heteromerisierung dieser Untereinheiten eindeutig aufgezeigt werden. Zusammenfassend deutet die geringe Distanz der an der Quervernetzung beteiligten Cystein–Mutationen der P2X1–, P2X2– und homomeren P2X1/2–Rezeptoren auf ein konserviertes strukturelles Motiv dieser P2X–Subtypen hin, welches in P2X3– und P2X4–Rezeptoren nicht konserviert zu sein scheint. Diese Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf die generelle Struktur der P2X–Rezeptoren und werden maßgeblich zur Interpretation einer zukünftigen Kristallstruktur beitragen.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Fusionstranskripte, welche normalerweise bei Leukämie-assoziierten chromosomalen Translokationen auftreten, in hämatopoetischen Zellen gesunder Personen gefunden. Da diese Personen keine entsprechenden chromosomalen Abberationen aufwiesen, ist es sehr wahrscheinlich, dass diese Fusionstranskripte durch trans-Spleißen entstehen. Während dieser Arbeit konnten durch inverse PCR, welche an unbehandelter cDNA gesunder Probanden durchgeführt wurde, intragenische trans-Spleiß-Produkte nachgewiesen werden. Interessanterweise weisen das MLL-Gen und seine fünf häufigsten Translokationspartner AF4, AF9, AF10, ELL und ENL ein großes Spektrum an trans-gespleißten RNAs auf. Nur in einem weiteren Mitglied der MLL-Familie (MLL3) konnte intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Für verschiedene als Kontrolle verwendete Haushaltsgene konnte kein intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Intergenische trans-Spleiß-Ereignisse konnten durch direkte PCR und RACEExperimente für die Gene MLL, ELL und ENL nachgewiesen werden. Bemerkenswerterweise entsprechen ein intragenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL-PTD und ein intergenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL•AF4. In Hefe konnte gezeigt werden, dass RNA als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann. Somit lag der Schluß nahe, dass die oben genannten trans-gespleißten RNAs möglicherweise einen Einfluss auf die DNA-Reparatur haben. Dass RNA nicht nur in Hefen sondern auch in Menschen als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann, konnte im Zuge dieser Arbeit durch mehrere in vitro Experimente mit Kernextrakten aus humanen Zelllinien bestätigt werden. Allerdings konnte keinerlei Einfluss von (trans-)gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur in zahlreichen in vitro Experimenten nachgewiesen werden. Mit einem daraufhin etablierten in vivo System konnte ebenfalls ein Einfluss von (trans-) gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten mit Hilfe der durchgeführten RACE-Experimente vorzeitige Polyadenylierungen von Transkripten in den Bruchpunktsregionen von MLL, AF4, AF9 und ENL identifiziert werden. Durch diese ungewöhnliche Termination der Transkription werden stark verkürzte Transkripte erzeugt, welche in kurze Proteinisoformen translatiert werden können. Ein Vergleich von 274 unterschiedlichen Bruchpunktsequenzen mit größeren direkten und indirekten Sequenzwiederholungen zwischen der Bruchpunktsregion von MLL und den Bruchpunktsregionen seiner häufigsten Translokationspartner wurde ebenfalls durchgeführt. Eine signifikante Korrelation zwischen den Sequenzwiederholungen und der Lokalisation der Bruchpunkte war jedoch nicht erkennbar. Bei diesem Vergleich fielen allerdings Häufungen von Bruchpunkten im MLL-Gen mit AF4, AF9 und ENL als Translokationspartner auf, wobei sich die Ursache für diese Häufungen auf Topoisomerase II Spaltstellen zurückführen ließ.
Untersuchungen zum Target und Wirkmechanismus der eNOS-Transkriptionsverstärker AVE9488 und AVE3085
(2008)
Die Substanzen AVE9488 und AVE3085 der neuen chemischen Klasse der eNOS-Transkriptionsverstärker führen zu einer signifikanten Aktivierung des eNOSPromotors, die in vitro und in vivo in einer Erhöhung der eNOS-Expression auf mRNAund Proteinebene resultiert. Als Folge davon kommt es zu einer signifikant gesteigerten Synthese von bioverfügbarem Stickstoffmonoxid (NO). Dieser Effekt führt in Kombination mit einer ebenfalls beobachteten Normalisierung der eNOS-Entkopplung zu einer deutlichen antiatherosklerotischen Wirkung in ApoE-Knockout-Mäusen. AVE9488 und AVE3085 wurden initial durch eine phänotypische Reihentestung chemischer Bibliotheken in einer stabilen eNOS-Promotor-Reporter-Endothelzelllinie identifiziert. Daher waren bis zum heutigen Zeitpunkt molekulare Targets und ihre Wirkweise unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, Targetproteine der eNOS-Transkriptionsverstärker zu identifizieren, zu validieren und Hinweise auf den zugehörigen Wirkmechanismus zu sammeln. Zur Identifizierung potenzieller Zielproteine wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. In einem genomischen Ansatz sollten einzelne, für die Aktivierung des eNOSPromotors durch AVE9488 und AVE3085 essentielle Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Eine in silico-Analyse des für die Substanzwirkung notwendigen 300bp-Promotorbereichs vor Transkriptionsstart auf konservierte Transkriptionsfaktor-Bindemotive ergab potenzielle Bindungsstellen für insgesamt 105 Transkriptionsfaktoren. In Gel-Retardierungsexperimenten mit Oligonukleotiden, die aufbauend auf der bioinformatischen Analyse die konservierten cis-Elemente in diesem Sequenzbereich abdeckten, und Kernextrakten aus Endothelzellen, die mit AVE9488 behandelt worden waren, konnte eine Abschwächung der DNA-Protein-Komplexbildung beobachtet werden. Diese Effekte konnten jedoch mit dieser Technologie aufgrund der hohen Anzahl möglicher bindender Transkriptionsfaktoren nicht auf einzelne eingeengt werden. Im Folgenden wurden daher einzelne Transkriptionsfaktoren ausgewählt, die eine nachgewiesene Rolle bei der Regulation der eNOS-Transkription besitzen, und auf ihre Bedeutung bei der Substanz- ermittelten eNOS-Promotoraktivierung untersucht. Nach Ausschaltung durch siRNA von Sp1, GATA-2, Ets-1, MAZ und PATZ1 im eNOS-Transkriptionstest konnten bei Sp1, GATA-2 und MAZ lediglich eine Erniedrigung der basalen eNOS-Promotoraktivitätfestgestellt werden. Da die Substanz-induzierte eNOS-Transkriptionserhöhung bei keinem der untersuchten Transkriptionsfaktoren beeinflusst wurde, scheinen diese Proteine bei diesem Prozess keine Rolle zu spielen. Als zweite Strategie kamen Proteomik-Techniken zur Identifizierung möglicher Targetprot eine durch ihre direkte biochemische Affinität zum Pharmakophor der eNOS-Transkriptionsverstärker zum Einsatz. Durch die chromatographische Anreicherung bindender Proteine aus Endothelzelllysaten an spezifischen Affinitätsmaterialien und der Markierung rekombinanter, humaner Proteine auf Protein-Mikroarrays mit Biotinmarkierten eNOS-Transkriptionsverstärkern konnte eine Gesamtliste mit insgesamt 18 potenziellen Targetkandidaten ermittelt werden. Die weitere zelluläre Validierung dieser Kandidaten erfolgte durch ihre siRNA-vermittelte Ausschaltung im eNOS-Transkriptionstest. Innerhalb aller potenziellen Targets konnte nur nach Ausschalten von Häm-bindenden Protein 1 (HEBP1) der eNOS-Promotor durch AVE3085 nur noch signifikant abgeschwächt gegenüber der Kontrolle aktiviert werden. Dieses Protein stellte somit den einzigen Targetkandidaten dar, der bei der Aktivierung des eNOS-Promotors eine Rolle zu spielen scheint. Nach rekombinanter Expression des humanen HEBP1 konnte die Bindung der eNOS-Transkriptionsverstärker an dieses Protein durch zwei unabhängige biochemische Methoden konfirmiert werden. Bei Messungen der Tryptophanfluoreszenz des HEBP1 konnte der eNOS-Transkriptionsverstärker 9257 den Liganden Hämin, der eine Quenchung der Fluoreszenz bewirkt, aus der Bindung verdrängen. Weiterhin konnte mit Hilfe einer Fluoreszenz-markierten eNOS-Substanz ihre direkte Bindung an das HEBP1 durch Messung der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen und ein KD-Wert von 11,7μM ermittelt werden. Abschließend konnte in ersten Untersuchungen der Hebp1-Expression in einem Herz-Kreislauf-relevanten Tiermodell für chronische Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt die differentielle Hochregulation des Hebp1-Gens um den Faktor 2,5 unter pathologischen Bedingungen nachgewiesen werden, die jedoch nicht durch die Behandlung mit AVE3085 beeinflusst wurde.
Colorectal cancer is one of the most cause of cancer and death in Western societies. Recently, histone deacetylase inhibitors (HDIs), which regulate transcription through modification of chromatin structure, received considerable interest on the ground of they ability to stop the growth and induce cell death in colon cancer tumours, representing a promising transcriptional cancer therapy. This kind of cancer initiates with an activating mutation in the Wnt cascade, allowing the nuclear import of ß-catenin binding to LEF/TCF. This induces the overexpression of growthpromoting oncogenes affecting the cell cycle arrest, lineage-specific cell differentiation and apoptosis processes. In addition, ß-catenin also participates in cell-cell adhesion via interactions with E-cadherin, which can be repressed by families of transcription factors Snail and ZEB. This, and gain of vimentin has been closely correlated with local invasion and metastasis since they avoid the induction of apoptosis through the loss of cell anchorage, a phenomenon called anoikis. In this process the inactivation of the kinases Src an FAK provoking disruption of focal adhesion complexes through is involved. LAQ824 is a HDAC inhibitor derivative of hydroxamic acid, which present antitumor effect in colon and other cancer cells. The aim of this study is to analyse the effect of LAQ824 in cell proliferation, apoptosis, motility and tumour invasion in a colon carcinoma model based on the adenoma-carcinoma sequence descrying trough which pathways LAQ824 is able to cause these effects. Here I demonstrate for the first time that a HDAC inhibitor, LAQ824, induces detachmentinduced cell death of colon cancer cell lines HCT116 and HT-29, a phenomenon called anoikis, in a caspase-dependent and p53-independent manner. In this process the component of the Wnt signalling pathway ß-catenin is involved. Furthermore LAQ824 upregulates the adhesion molecule E-cadherin expression in these cell lines independently of its repressor Snail, but probably mediated by the repressor ZEB. In addition LAQ824-induced anoikis is caused by disruption of focal adhesion complexes through inhibition of the activity of the kinases FAK and Src inhibiting cell motility indicating a strong antimetastatic potential for LAQ824.