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Die N- und O-Glykosylierung von Proteinen ist gekennzeichnet durch eine hohe strukturelle und funktionelle Komplexität. Da verschiedene Glykanstrukturen und Glykosylierungsstellen selbst innerhalb eines Proteins unterschiedliche Aufgaben erfüllen können, ist sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Pharma-Industrie eine stellenspezifische Analytik zur Aufklärung der biologischen Bedeutung und bei therapeutischen Proteinen zur Gewährleistung von Sicherheit und gleichbleibenden pharmakologischen Eigenschaften essentiell. Die niedrige Abundanz sowie die hohe Komplexität durch die variablen Glykanzusammensetzungen und Verzweigungsmöglichkeiten sowie der daraus resultierende Mikroheterogenität an jeder einzelnen Stelle stellt jedoch eine besondere Herausforderung an die Analytik dar. In dieser Arbeit wurden deshalb auf verschiedenen Ebenen der Probenvorbereitung, der chromatographischen Separation sowie der MS-Analyse- Methoden und Techniken entwickelt und charakterisiert, um die stellenspezifische Analytik der Proteinglykosylierung zu vereinfachen.
In einem ersten Schritt wurde die hohe Komplexität eines Glykoproteinverdaus reduziert. Es wurden verschiedene Methoden zur Glykopeptidanreicherung miteinander verglichen, wobei sich die HILIC-Festphasenextraktion unter optimierten Bedingungen durch eine sehr hohe Selektivität und Effizienz auszeichnete. Zur Methodenoptimierung wurden verschiedene HILIC-Materialien (Silika, Amino, Mikrokristalline Cellulose, TSKgel Amide-80 und ZIC®-HILIC) eingesetzt und durch eine Variation der Anreicherungsbedingungen die Hauptretentionsmechanismen für jedes Material beschrieben. TSKgel Amide-80 sowie ZIC®-HILIC sind am besten geeignet, da unter optimierten Bedingungen sekundäre Retentionsmechanismen wie elektrostatische Wechselwirkungen deutlich reduziert werden und die hydrophile Verteilung den Hauptretentionsmechanismus darstellt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass Parameter wie die Pufferzusammensetzung, Inkubationszeiten und die Volumenverhältnisse zwischen HILIC-Suspension, Binde-, Wasch- und Elutionspuffer entscheidend die Reproduzierbarkeit, Ausbeute und Selektivität beeinflussen. Unter Berücksichtigung dieser Beobachtungen wurde ein Protokoll entwickelt, mit welchem Glykopeptide selektiv und quantitativ, d.h. ohne Präferenz für bestimmte Glykanstrukturen, aus komplexen Proben angereichert werden können. In Kombination mit Titandioxid zur selektiven Anreicherung sialylierter Glykopeptide bei bestimmten Fragestellungen ermöglichten in dieser Arbeit beide Methoden eine detaillierte Charakterisierung sowohl von N- als auch von O-Glykopeptiden. Die Hydrazinchemie erwies sich aufgrund eines zu komplexen Arbeitsschemas und einer unzureichenden Wiederfindung als nicht geeignet.
Da je nach Aminosäuresequenz oft mit einer einzigen Protease (z.B. Trypsin) nicht alle Glykosylierungsstellen aufgrund ihrer Eigenschaften (z.B. Größe, Hydrophobizität) für die Anreicherung und LC-MS-Analyse zugänglich sind, kamen in dieser Arbeit weitere Proteasen zum Einsatz. Durch eine sequentielle Kombination von Trypsin mit Endoproteinase Glu-C bzw. Trypsin mit Chymotrypsin konnten in allen Proteinen sämtliche N-Glykosylierungsstellen nach einer Anreicherung identifiziert werden. Bei der Analyse von O-Glykopeptiden verbesserte zusätzlich die N-Deglykosylierung des intakten Proteins und die Abtrennung der freien N-Glykane mittels Ultrafiltration vor der Anreicherung die Analytik. Neben den bereits für die N-Glykopeptide beschriebenen Enzymkombinationen wurde außerdem Proteinase K eingesetzt, um die O-Glykopeptide z.B. von Fetuin effizient anzureichern und mittels LC-ESI-MS2/MS3 zu charakterisieren. Dies war mit einem Trypsinverdau alleine nicht möglich.
Die Komplexität nach einer Glykopeptidanreicherung ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Glykanstrukturen und Glykosylierungsstellen immer noch so hoch, dass bei 1-dimensionalen HPLC-Läufen Koelution von Glykopeptiden zu einer unzureichenden Detektion niedrig-abundanter Formen führen kann. Aus diesem Grund wurden die komplementäre HPLC-Phasen RP18 und ZIC®-HILIC eingesetzt, um sich chromatographisch die differenzierenden Eigenschaften von Peptidgerüst und Glykanrest zunutze zu machen. ZIC®-HILIC ermöglicht die Auftrennung überwiegend nach der Glykanstruktur und RP18e nach Peptidsequenz und Anzahl an Sialinsäuren. Durch die Kombination beider Phasen in 1- und 2-dimensionalen HPLC-Konfigurationen konnten deutlich mehr unterschiedliche Glykoformen nachgewiesen und die Detektion niedrig-abundanter Glykopeptide ermöglicht werden, die bei der Verwendung von nur einer stationären Phase nicht identifiziert werden konnten.
Zusammen mit einer komplementären MS-Analytik, die sowohl ESI als auch MALDI sowie unterschiedliche Fragmentierungstechniken wie CID, ETD, PSD oder CID-MS2/MS3 umfasste, konnten N- und O-Glykopeptide stellenspezifisch und vollständig sowohl mit ihrem Peptid- als auch mit ihrem Glykananteil charakterisiert werden.
Für bestimmte quantitative Fragestellungen wurden außerdem die beschriebenen Anreicherungsmethoden mit dem zur Quantifizierung eingesetzten N-Glycan Mapping kombiniert und ein Arbeitschema entwickelt, mit welchem bei einem mehrfach glykosylierten Protein die Verhältnisse der unterschiedlichen Glykanstrukturen an den einzelnen Glykosylierungsstellen getrennt voneinander quantifiziert werden können.
Mit jeder einzelnen, in dieser Arbeit beschriebenen Methode wird ein beträchtlicher Informationsgewinn erzielt, doch erst durch die Kombination einer effizienten Probenvorbereitung, einer komplementären HPLC-Separation, verschiedener MS/MS-Techniken und Methoden zur Quantifizierung kann die Glykosylierung eines komplexen Proteins stellenspezifisch und detailliert beschrieben werden.
Biopharmazeutika sind heutzutage ein wichtiger Bestandteil des Arzneimittelmarktes. Ihr komplexer Aufbau und ihre Mikroheterogenität erfordern eine genaue strukturelle Charakterisierung auf verschiedenen Ebenen der Moleküle, wobei die Anwendung neuer Methoden von den entsprechenden Richtlinien durchaus erwünscht ist. Die Massenspektrometrie als Analysemethode hat sich in diesem Gebiet bereits fest etabliert. Verschiedenste massenspektrometrische Untersuchungen können an den intakten Biopharmazeutika sowie an größeren und kleineren Bruchstücken derselben durchgeführt werden. Trotzdem wird meist auf wenige, lange etablierte Protokolle zurückgegriffen, die häufig mit langwieriger Probenvorbereitung verbunden sind. Bei der Analyse der Glykosylierung wird immer noch die chromatographische Trennung mit anschließender Detektion durch UV- oder Fluoreszenzmessung bevorzugt.
In dieser Arbeit sollten die Möglichkeiten der Massenspektrometrie bei der Analyse von Biopharmazeutika genauer untersucht werden. Dazu gehört auch, den hohen Informationsgehalt der üblichen chromatographischen Auftrennung von Peptiden aus einem proteolytischen Verdau vollständig zu nutzen. Es wurde gezeigt, dass die manuelle Auswertung der Analyse zusätzliche Ergebnisse bringt, und dass gleichzeitig eine Analyse von posttranslationalen und prozessbedingten Modifikationen möglich ist. Zudem wurde der Verdau mit der Protease Trypsin auf das jeweilige Biopharmazeutikum und auf das Ziel der Analyse optimiert. Da mit Trypsin eine vollständige Sequenzabdeckung nicht erreichbar war, wurden zusätzlich verschiedene weniger spezifische Proteasen angewendet. Alle untersuchten weniger spezifischen Proteasen (Elastase, Chymotrypsin und Thermolysin) waren für eine solche Analyse gut geeignet. Die Komplementarität von MALDI- und ESI-MS-Analysen konnte durch ihre Kombination optimal ausgeschöpft werden. Zudem wurden weitere Methoden zur Erhöhung der Sequenzabdeckung wie die Derivatisierung der Peptide mit TMTzero vorgestellt.
Für die Analyse intakter Biopharmazeutika wurden neben der Größenausschlusschromatograph und gelelektrophoretischen Trennungen sowohl MALDI- als auch ESI-MS-Analysen verwendet. Die Trennung großer Proteinmoleküle in kleinere Untereinheiten erleichterte dabei die massenspektrometrische Analyse maßgeblich. Die Fragmentierung der Biopharmazeutika mittels MALDI-ISD war für die Bestimmung der Protein-N- und C-Termini sehr gut geeignet.
Die Analyse der Glykosylierung wurde an den freien N-Glykanen aus einem PNGaseF-Verdau sowie an Glykopeptiden aus einem Verdau mit Pronase durchgeführt. Die freien N-Glykane konnten zudem für die MALDI-MS-Analyse mit der MALDI-Matrix 3-Aminochinolin direkt auf dem Probenteller derivatisiert werden. Die Derivatisierung und Vermessung der N-Glykane wurde zunächst an verschiedenen Standardoligosacchariden, Humanmilcholigosacchariden und N-Glykanen aus Standardglykoproteinen optimiert. Durch die Fragmentierung der N-Glykane konnten diese sequenziert und isomere Strukturen unterschieden werden.
Bei einem Pronaseverdau wurden Proteine so weit verdaut, dass nur noch einzelne Aminosäuren bzw. Di- oder Tripeptide übrig blieben. Lediglich die Glykosylierungsstellen waren durch die voluminösen Glykanstrukturen vor dem Verdau geschützt und behielten eine kurze Peptidsequenz, die für eine Identifizierung der Glykosylierungsstelle ausreichend war. So konnten die N- und O-Glykopeptide direkt ohne Aufreinigung mittels MALDI-MS aus den Verdauansätzen analysiert werden, ohne dass nicht glykosylierte Peptide störten. Das Verdauprotokoll wurde zunächst an mehreren Standard-N- und -O-Glykoproteinen optimiert und anschließend auf die untersuchten Biopharmazeutika angewendet. N- und O-Glykopeptide konnten sogar nebeneinander analysiert werden. Die hohe Massengenauigkeit des verwendeten MALDI LTQ-Orbitrap Massenspektrometers ließ eine eindeutige Identifizierung der Glykopeptide mit Hilfe eines dafür entwickelten Programms zu. Weiterhin konnte die Identifizierung durch die Fragmentierung der Glykopeptide unterstützt werden.
Somit konnten in dieser Arbeit verschiedene massenspektrometrische Analysen von Biopharmazeutika neu entwickelt, optimiert oder vereinfacht werden. Dabei wurden für jede Strukturebene (intaktes Molekül, größere und kleinere Fragmente) sowohl Ansätze mit MALDI-MS als auch mit ESI-MS verfolgt. Einige Methoden, die in der Proteomforschung bereits Anwendung fanden, konnten erfolgreich auf Biopharmazeutika übertragen werden. Die Arbeit zeigt, dass die Massenspektrometrie ein großes Potential in der Analyse der Biopharmazeutika besitzt, das aber bisher noch nicht vollständig ausgeschöpft wird. Durch die Wahl der richtigen Methoden und der geeigneten Instrumentierung wird eine vollständige strukturelle Charakterisierung ermöglicht.
Der Prävention und Therapie von diabetischer Nephropathie kommt immer mehr Bedeutung zu, da sie der Hauptgrund für terminale Niereninsuffizienz ist. Ein möglicher Therapieansatz ist die Hemmung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems mit Angiotensin Converting Enzyme Inhibitoren oder kombinierten ACE und neutrale Endopaptidase (Vasopeptidase) Inhibitoren. Trotz der therapeutischen Effektivität einer pharmakologischen Hemmung des RAAS ist die Bedeutung von ACE und NEP in der Pathogenese der diabetischen Nephropathie noch nicht vollständig geklärt. Auf Gewebsebene kann die erhöhte Bildung und Akkumulation von AGEs zur Entwicklung von diabetischer Nephropathie beitragen (73) und der ACE-Inhibitor Ramipril kann die Anreicherung von fluoreszierenden AGEs in der Niere und im Serum von Typ I diabetischen, hypertensiven Ratten verhindern (73). Da AGEs unterschiedliche Strukturen und Effekte auf Proteine haben, sollte der Einfluss des ACEInhibitors Ramipril und des Vasopeptidase Inhibitors AVE7688 auf die Akkumulation von den drei prototypischen AGEs 3-DG-Imidazolon, Pentosidin und CML in einem Typ II diabetischen Tiermodell untersucht werden. Für den AGE-Subtyp CML wurde zusätzlich noch die Konzentration im Serum und die CML Clearance in ZDF Ratten bestimmt. Des Weiteren sollte der Effekt von Ramipril und AVE7688 auf die AGE Bildung in vitro analysiert werden. Die Charakterisierung der ZDF Ratten ergab, dass es zu einer 40, 50 und 55%igen Akkumulation der AGE-Subtypen 3-DG-Imidazolon, Pentosidin und CML in der Niere von 37 Wochen alten ZDF Ratten kommt. Diese Akkumulation konnte durch die Behandlung mit AVE7688 komplett verhindert werden, während Ramipril nur die CML Akkumulation in 37 Wochen alten ZDF Ratten leicht reduzierte. Auch wurde die CML Akkumulation im Serum von 37 Wochen alten ZDF Ratten durch AVE7688 verhindert. AVE7688 reduzierte nicht nur die AGE Akkumulation, sondern verbesserte auch die CML Clearance, während Ramipril keinen Effekt hatte. Die Effekte zur AGE Reduktion gingen einher mit einer Verhinderung der Albuminurie durch AVE7688 und einer 30%igen Reduktion durch Ramipril. In vitro Studien zu AGE Bildung zeigten, dass AVE7688 die Bildung von CML und Pentosidin verhindern kann und dass chelatierende Eigenschaften von AVE7688 an diesem Effekt beteiligt sein könnten. Ramipril hatte nur sehr schwach chelatierende Eigenschaften und keinen Einfluss auf die in vitro Bildung von CML oder Pentosidin. Neben der Akkumulation von AGEs trägt auch die Aktivierung der intrazellulären Signaltransduktion des Receptor of Advanced Glycation End Products (RAGE) zur Entwicklung von diabetischer Nephropathie bei. Dies wurde in doppelt transgenen diabetischen Mäusen gezeigt, die aufgrund der RAGE Überexpression verstärkt diabetische Nephropathie im Vergleich zu diabetischen Mäusen mit normaler RAGE Expression entwickeln (64). Die Aktivierung der RAGE Signaltransduktion mit den Liganden AGEs und S100B führt zu Entzündungsprozessen und zu einer Hochregulation der RAGE Expression (97). Da es in ZDF Ratten zur Akkumulation von AGEs kommt, wurde untersucht, ob ihr Rezeptor RAGE vermehrt in ZDF Ratten exprimiert wird und ob AVE7688 oder Ramipril die RAGE Expression beeinflussen. Die Substanzen könnten zum einen die RAGE-Liganden Interaktion direkt beeinflussen oder über eine Reduktion der Liganden die RAGE Expression verändern. Um dies zu untersuchen, wurde zunächst biochemisch die Interaktion von RAGE mit den Liganden AGEs und S100B näher analysiert, und die Bindedomaine von RAGE charakterisiert. Anhand dieser Daten wurde der Effekt von AVE7688 und Ramipril auf die biochemische RAGE-Liganden Interaktion und zelluläre RAGE Aktivierung in Makrophagen im Vergleich zu einem RAGE Antagonisten untersucht. In den ZDF Ratten korrelierte die AGE Akkumulation mit einer erhöhten RAGE Expression in der Niere von 37 Wochen alten ZDF Ratten. AVE7688, nicht jedoch Ramipril, reduzierte die erhöhte RAGE Expression in den ZDF Ratten. Bei der Charakterisierung der RAGE-Liganden Interaktion stellte sich heraus, dass AGEs, die Pentosidin und CML enthalten, ebenso wie S100B an RAGE binden und dass die V-Domaine von RAGE ausreichend für die Bindung der Liganden ist. Kreuzkompetitionen zeigten, dass AGEs und S100B innerhalb der gleichen Bindungsstelle von RAGE binden und dass AGEs, die Pentosidin enthalten, wesentlich affiner an RAGE binden als reine CML AGEs, wobei S100B von den untersuchten Liganden am affinsten an RAGE gebunden hat. Eine Untersuchung des Einflusses der Substanzen auf die RAGE-Liganden Interaktion ergab, dass die aktiven Metabolite von AVE7688 und Ramipril in physiologisch relevanten Konzentrationen keinen Effekt auf die Interaktion von RAGE mit AGEs oder S100B hatten. Da weder AVE7688 noch Ramipril die RAGE-Liganden Interaktion beeinflussten, wurde ein Homologiemodell der RAGE V-Domaine erstellt, um die Struktur eines RAGE Antagonisten besser vorhersagen zu können. Anhand des Modells konnte eine stark positiv geladene Fläche identifiziert werden, was vermuten lies, dass elektrostatische Wechselwirkungen an der RAGE-Liganden Interaktion beteiligt sein könnten. Diese Hypothese wurde durch die Daten unterstützt, dass Heparin aufgrund seiner negativen Ladung an die RAGE V-Domaine bindet und die Bindung von AGEs und S100B an RAGE kompetieren kann. Punktmutationen von ausgewählten positiven Resten innerhalb der RAGE V-Domaine zeigten, dass die Mutation von einer Aminosäure kaum einen Effekt hatte, während die Mutation von drei oder fünf positiv geladenen Resten, die Bindung der Liganden an RAGE reduzierte. Auch zellulär konnte Heparin die RAGE vermittelte Sekretion von TNFα in Makrophagen verhindern. Die erhöhte AGE Clearance und die Inhibition der AGE Bildung, vermutlich durch die chelatierenden Eigenschaften von AVE7688, könnten zur Reduktion der renalen AGE Akkumulation und einer Verbesserung der Nephropathie bei Typ II Diabetes beitragen. Die Daten lassen auch vermuten, dass die Aktivierung der RAGE Signaltransduktion bei Diabetes durch AVE7688 verhindert werden kann, wobei AVE7688 keinen Effekt auf die Bindung der pathogenen RAGE-Liganden AGEs und S100B an RAGE hatte. Die Inhibition der RAGE Signaltransduktion könnte auf eine Reduktion der Liganden zurückgeführt werden, wobei der Effekt eine differenzielle Regulation der Expression von sRAGE nicht ausgeschlossen werden kann. Dieser neu identifizierte Wirkungsmechanismus der Vasopeptidasehemmung trägt mutmaßlich zur hohen Wirksamkeit dieser Substanzklasse bei diabetischer Nephropathie bei.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle retinaler Perizyten nach einer Infektion mit dem Humanen Zytomegalievirus und deren mögliche Beteiligung an einer HCMV-Retinitis untersucht. Zunächst wurde die Isolation, Kultivierung und Vermehrung von humanen retinalen Perizyten (HRP) etabliert. Eine erfolgreiche Isolation der HRP ist abhängig vom Alter des Spenders, welches unter 50 Jahren liegen sollte, als auch vom Zeitpunkt der Entnahme des Auges. Dabei sollten die Retinae spätestens nach 48 h post mortem aus den Augen präpariert werden. Nach Aufschluss mit einem Dispase/Kollagenase-Gemisch und Separation über ein Zellnetz wurden die isolierten Perizyten auf mit Fibronektin oder ECM (extrazelluläre Matrix) beschichtete Kulturflaschen ausgebracht. Aufgrund der Optimierung des Mediums war es zum ersten Mal möglich, humane retinale Perizyten über 12-15 Passagen zu kultivieren. Somit standen genügend Zellen zur Analyse der Infizierbarkeit mit HCMV und für die Reportergenanalyse zu Verfügung.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Zellen mit HCMV infizierbar sind, jedoch keine lytische Infektion stattfindet und nur wenige Zellen einen zytopathischen Effekt zeigen. Mithilfe von Titerbestimmungen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen infizierter Perizyten konnte die Virusreplikation und die Bildung reifer bzw. funktioneller Viruspartikel nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die Expression der viralen IE- und late-Proteine in HCMV-infizierten Perizyten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und quantitativer RealTime-PCR nachgewiesen. Während einer HCMV-Infektion werden unterschiedliche inflammatorische Prozesse induziert. Dazu gehört z. B. die Aktivierung zellulärer Transkriptionsfaktoren, welche durch ihre Bindung an Promotorregionen die Transkription verschiedener Gene die für Zytokine und Adhäsionsmoleküle kodieren, und andere Transkriptionsfaktoren beeinflussen (Pahl, 1999). Der Transkriptionsfaktor NF-κB wird als Hauptregulator für die HCMV-Replikation beschrieben, in retinalen Perizyten wird NF-κB jedoch nicht aktiviert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung und Genexpressionsstudien konnte ein weiterer proinflammatorischer Prozess, die Überexpression von ICAM-1, in infizierten Perizyten nachgewiesen werden. ICAM-1 bewirkt die Infiltration und Anhaftung von Leukozyten an infizierten Zellen. Durch Adhäsionsstudien wurde eine 4,6-fach gesteigerte Anhaftung an HCMV-infizierten Perizyten nachgewiesen, welche durch blockierende Antikörper wieder aufgehoben werden konnte. Durch Expressionanalysen von Chemokin- und Interleukingenen mittels qRT-PCR und ELISA-Analysen konnten erhöhte Sekretionen von CCL2, CCL5, CXCL10 und IL-8 in HCMV-infizierten HRP nachgewiesen werden. Die Resultate einer Infektion mit Vollvirus wurden durch die Transfektion mit Expressionsplasmiden für die viralen Proteine IE1/2 bestätigt. Eine gesteigerte Expression der Zytokine wurde vor allem durch die Überexpression von IE2 und synergistisch durch IE1/2 nachgewiesen. Eine durch IE1 induzierte Expression wurde nur für CCL2 detektiert. Die viralen IE-Proteine sind potentielle Transaktivatoren viraler und zellulärer Promotoren. Ziel war es, den Einfluss auf die Promotoren der Zytokingene (von -3000bp bis 100 bp) durch Koexpression der viralen IE1/IE2-Proteine mittels Luciferase-Reportergenassays in HRP zu untersuchen. Nur der CCL2-Promotor (-1355/+55) zeigte eine erhöhte basale Promotor-aktivität. Um den Einfluss der IE-Proteine auf die Promotoren zu untersuchen, wurden Kotransfektionen mit den Expressionsplasmiden für IE1/2 und den Reportergen-konstrukten der Zytokingene durchgeführt. Dabei zeigten die Analysen mit den Minimalpromotoren (TATA-Box/NF-κB Bindungsstellen) keine erhöhten Luciferaseaktivitäten. NF-κB wurde durch eine HCMV-Infektion nicht aktiviert, somit ist die Transaktivierung der Promotoren von CCL2, CCL5, CXCL10, IL-8 und ICAM-1 in infizierten Perizyten vermutlich NF-κB unabhängig. Die Transaktivierung dieser Promotoren könnte durch AP-1 vermittelt sein, da die höchsten Luciferaseaktivitäten durch die Kotransfektion mit strangabwärts gelegenen Promotorbereichen erhalten wurden, in diesen Bereichen befinden sich potentielle Bindungsstellen für AP-1, SP-1 und anderer Transkriptionsfaktoren. Mittels Western Blot-Analyse wurde eine Induktion der Expression von AP-1 durch HCMV nachgewiesen, somit wird die HCMV-Replikation in HRP vermutlich über AP-1 vermittelt.
In der vorliegenden Arbeit wurden primäre humane Perizyten isoliert und erstmals mit HCMV infiziert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Zellen als Modellsystem zur Untersuchung einer HCMV-Retinitis von großer Bedeutung sind. Aufgrund ihres hohen Anteils in der Retina, ihrer schützenden Funktion für die Blut-Retina Schranke sowie ihrer Beteiligung an der HCMV-Retinitis spielen diese bisher nur wenig untersuchten Zellen, offensichtlich eine große Rolle im immunpriviligiertem Auge. Für die Etablierung neuer Therapieansätze für eine HCMV-Retinitis könnten detailliertere Untersuchungen retinaler Perizyten Aufschluss über den Replikationsmechanismus von HCMV und die damit verbundenen inflammatorischen Prozesse während einer HCMV-Retinits bieten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere Zielrichtungen verfolgt: 1. Vergleichende Testung von Kavainhaltsstoffen, Kava-Fertigarzneimitteln und chemischen Anxiolytika auf Hepatotoxizität Mit Hilfe der Hepatocarcinom-Zelllinie Hep-G2 wurden alle noch verfügbaren Kava-Fertigarzneimittel einem Cytotoxizitätstest unterzogen, durch die Herkunft der Zelllinie aus der Leber handelt es sich um eine spezifische Cytotoxizität – um Hepatotoxizität. Ebenso wurden isolierte, reine Inhaltsstoffe von Piper methysticum, Strukturverwandte und chemische Anxiolytika diesen Hepatotoxizitätstests unterzogen. Da alle Tests unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurden und bei jedem Test auf den microtiter-plates Kontrollen mitgeführt wurden, erlauben die Ergebnisse eine vergleichende Aussage zur Cytotoxizität. Besonders die Kava-Fertigarzneimittel, weniger die reinen Kava-Inhaltsstoffe (Kava-Lactone) fallen durch eine gewisse Cytotoxizität bei Hep-G2 auf. Die mit getesteten, handelsüblichen, chemischen Anxiolytika waren deutlich weniger cytotoxisch im Hep-G2-Assay. 2. Aufklärung der möglichen Ursache für die Fälle von Hepatotoxizität in Zusammenhang mit Kava Parallel zu den Hep-G2-Tests wurde eine Arbeit über die starke Hepatotoxizität des Kava-Alkaloids Pipermethystin publiziert. Nach Extraktion und Synthese von Pipermethystin wurden noch zwei weitere Kava-Alkaloide synthetisiert und Strukturverwandte mit in die Tests aufgenommen. Die starke Hepatotoxizität des Pipermethystins konnte bestätigt werden. Durch weitere Versuche mit Abbauprodukten und Strukturverwandten des Pipermethystins konnte ein Dihydropyridon-Heterocyclus als toxisches Prinzip des Pipermethystins bestimmt werden. 3. Vergleichende Untersuchung der Ergebnisse mit Primärzellen, humanen Hepatocyten Durch Kooperation mit der Universität Mainz war es möglich, die in den Hep-G2-Tests aufgefallenen Substanzen an humanen Hepatocyten zu testen. Teilweise gab es bei diesen Untersuchungen Parallelen, teilweise variierten die Ergebnisse erheblich. Der Grund liegt in den unterschiedlichen enzymatischen Ausstattungen der Hep-G2-Zellen bzw. der humanen Hepatocyten und den daraus resultierenden unterschiedlichen metabolischen Fähigkeiten.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Anti-PGE2-Antikörperfragment exprimiert werden, mit dem über NMR-Spektroskopie genauere Strukturdaten der Antikörperbindungsdomäne zu erhalten wären. Da Fab-, Fv- und scFv-Fragmente die Antigenbindungsstelle besitzen und sich gegenüber einem vollständigem IgG zusätzlich durch ihre geringere Größe auszeichnen, wurden die korrespondierenden Antikörperfragmente für diese Arbeiten gewählt. Ausgehend von einer etablierten Hybridom-Zelllinie konnten über cDNA-Synthese und Assembly-PCR die Gene für die Antikörperfragmente bereitgestellt werden. Zum Verifizieren von DNA-Sequenz und Bindungseigenschaften stand ein Anti-PGE2-Fab-Fragment früherer Arbeiten von Frau Dr. Ilse Zündorf zur Verfügung. Für Strukturuntersuchungen müssen relativ große Proteinmengen bereit gestellt werden, daher ist es notwendig, hohe Ausbeuteverluste durch Präzipitation, Degradierung, Aufreinigungsverluste u.a. zu vermeiden. Um zunächst eine möglichst gute Proteinexpression zu erhalten, wurde der Bakterienstamm Escherichia coli BL21DE3 und das pET-Expressionssystem gewählt. In diesem System war zu erwarten, dass die überexprimierten Antikörperfragmente unter den gewählten Bedingungen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter inclusion bodies, in den Zellen vorliegen werden. Die der Klonierung der VH-, Vk- und scFv-Gene folgende Expression der Proteine zeigte, dass es tatsächlich zur Bildung von inclusion bodies kommt. Die Vorteile dieser Aggregatbildung, wie hohe Proteinmenge, Proteaseunempfindlichkeit aufgrund der hohen Dichte sowie die hohe Homogenität, sollten für die Gewinnung nativer Antikörperfragmente genutzt werden. Hierfür konnte ein System etabliert werden, das im wesentlichen auf der Solubilisierung der Aggregate und der Reduktion falscher Disulfidbrücken mit anschließender Rückfaltung und Rekonstituierung der Disulfidbrücken beruht. Kritische Parameter, die den Rückfaltungsprozess beeinflussen, wurden untersucht. Hierunter fallen insbesondere die Zusammensetzung des Renaturierungssystems wie Pufferbedingungen, das Verhältnis von oxidierten zu reduzierten Glutathion und der Zusatz von sogenannten Faltungsenhancern, die Additiva. Für fast alle wesentlichen Punkte konnten Systemkomponenten etabliert werden, die für das scFv-Fragment eine nahezu vollständige Überführung der inclusion bodies in die lösliche Form erlauben. Auch eine Bindung an das Antigen Prostaglandin E2 konnte unter Anwendung von Radioimmunoassays gezeigt werden. Problematisch ist die Aufkonzentrierung der in niedriger Konzentration vorliegenden renaturierten scFv-Fragmente. Je stärker aufkonzentriert wird, desto stärker präzipitieren die scFv-Moleküle in der Ultrafiltrations- bzw. Zentrifugationsfiltereinheit. Antikörper und Antikörperframente sind ohne Frage eine sehr wichtige Molekülgruppe von molekularbiologischen und biochemischen Interesse, nicht nur in dieser Arbeitsgruppe. Im Rahmen einer möglichen Weiterführung dieser Arbeit müsste geklärt werden, ob das Präzipitationsverhalten der scFv-Fragmente eine inhärente Eigenschaft des Anti-PGE2 scFv ist, oder ob hier doch eine zumindest teilweise inkorrekte Faltung der Proteinkette vorliegt. Mögliche weitere Experimente könnten in der Variation des Linkers liegen oder das etablierte Verfahren an einem weiteren scFv-Fragment zu testen. Da die genannten Probleme bei der Aufkonzentrierung der Proteinlösung auftreten, sollten statt der angewandten Techniken alternative Methoden geprüft werden. Auch wäre es interessant zu sehen, ob sich ein z.B. kommerziell verfügbares scFv-Fragment, dessen Bindungseigenschaften bekannt sind, nach Denaturierung wieder in die native Form überführen lässt. Abschließend lässt sich sagen, dass die Herstellung von nativen Protein aus inclusion bodies viele Vorteile bietet, die für die Präparation größerer Proteinmengen nicht ungenutzt bleiben sollten.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen aufzuklären, die im Rahmen inflammatorischer Erkrankungen zur Expression sogenannter Akute Phase Proteine führen. Der Fokus lag hierbei auf der Untersuchung von Signaltransduktionkaskaden, die aktiviert durch proinflammatorische Zytokine in der Leber die Bildung proatherogener Plasmaproteine wie C-reaktives Protein zur Folge haben. Zu diesem Zweck sollten verschiedene in vitro Zellmodelle etabliert und evaluiert werden. Neben Genexpressionsanalysen in zytokin-stimulierten primären humanen Hepatozyten, sowie in den Hepatoma-Zellinien HepG2 und Hep3B sollte die Manipulation der CRP-Expression durch gezielten Gentransfer und die Anwendung der siRNA-Technologie im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen. Zu diesem Zweck sollten Transkriptionsfaktoren der NFKB-Familie, sowie der Familie der „Signal transducer and activator of transcription“ (STAT) und der CCAAT/Enhancer-bindenden Proteine (C/EBP) überexprimiert werden, bzw. deren Expression durch die Transfektion mit entsprechenden siRNA-Oligonukleotide gehemmt werden. Ein weiteres wichtiges Ziel war es, ein zelluläres Modellsystem zu generieren und zu charakt-erisieren, das zur Identifizierung von Substanzen geeignet ist, die die CRP-Expression modu-lieren oder inhibieren.
Retrovirale Gen-Therapie-Vektoren haben die ethisch problematische Eigenschaft, ungerichtet in das Genom der therapierten Zellen zu integrieren und somit die Zelle gegebenenfalls durch Insertions-Mutagenese zu schädigen. Diese Problematik könnte gelöst werden, indem das zugrunde liegende Prinzip spezifisch integrierender, mobiler genetischer Elemente (Transposons) aufgeklärt und in die Retrovirus-basierten Gen-Therapie-Vektoren mit einbezogen werden könnte. Das Genom des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum enthält eine Reihe von Non-LTR-Retrotransposons, die ausnahmslos Positions- und Orientierungs-spezifisch in die genetisch unproblematischen Regionen vor oder hinter tRNAGene integrieren (tRNA-Gen-assoziierte Retroelemente oder kurz TRE). Zur Untersuchung des Mechanismusses der Positions- und Orientierungs-spezifischen Integration von TRE-Retrotransposons wurde in D. discoideum ein in vivo Retrotranspositions-Testsystem etabliert, mit welchem de novo auftretende Retrotranspositions-Ereignisse endogener TRE-Retrotransposons auf methodisch einfache Weise festgestellt und analysiert werden konnten. Das in vivo Testsystem beruht auf der positiven Selektion derjenigen Zellen eines D. discoideum-Reporterstammes, in denen eines der selten auftretenden Retrotranspositions-Ereignisse stattgefunden hat. Die Herstellung des D. discoideum- Reporterstammes erfolgte durch die Veränderung des UMP-Synthase-Gens (pyr5-6), in welches artifiziell ein Intron (cbfAint) inklusive eines „Köder“-tRNA-Gens (valUAC) integriert wurde. Aufgrund der Integration eines TRE-Retrotransposons in die Nähe des „Köder“-tRNA-Gens kann das Intron nicht mehr korrekt aus der UMP-Synthase-Vorläufer-mRNA gespleißt werden, die Zellen konvertieren dadurch bedingt vom ura+- zum ura--Phänotyp und können deshalb mit dem für ura+-Zellen toxischen Zytostatikum 5-Fluoro-orotat (5-FO) positiv selektiert werden. Durch die detaillierte Analyse zahlreicher 5-FO-resistenter Klone konnte gezeigt werden, daß in modernen D. discoideum-Stämmen ausschließlich die oberhalb von tRNA-Genen integrierenden TRE5-Retrotransposons vom Subtyp A.1 und A.2 gleichermaßen aktiv sind und daß ein beliebiges „Köder“-tRNA-Gen in einer artifiziellen genomischen Umgebung als Integrations-Ziel für TRE5-A-Retrotransposons dienen kann. Die TRE5-A-Retrotransposons zeigten entsprechend den genomischen Kopien eine Positions-Spezifität von ca. 48 (±3) bp oberhalb des tRNA-Gens und Ziel-Sequenz-Verdopplungen von 12 – 15 bp. Alle de novo integrierten TRE5- A.1-Retrotransposons waren 5’-verkürzt, während 64% der TRE5-A.2-Retrotransposons ein intaktes 5’-Ende aufwiesen. Das nukleäre D. discoideum-Protein CMBF (C-Modul-bindender Faktor) bindet Sequenzspezifisch an das C-Modul von TRE5-A-Retrotransposons und könnte deshalb an der Regulation der Transkription und/oder Mobilisierung der TRE5-A-Retrotransposons beteiligt sein. Zur Untersuchung des Einflusses von CMBF auf die TRE5-A-Retrotranspositions-Frequenz wurde das in vivo Retrotranspositions-Testsystem im D. discoideum-Stamm JH.D2 etabliert, welcher mit ca. 5% des Wildtyp-Niveaus CMBF stark unterexprimiert. Die Herstellung von JH.D2 erfolgte durch Einführung eines amber-Translationsstop-Codons in das cbfA-Gen des Wildtyp-Stamms AX2 sowie Expression einer amber-Suppressor-tRNA. Durch die Herstellung eines murinen monoklonalen Anti-CMBF-Antikörpers konnte bewiesen werden, daß die CMBF-Unterexpression auf eine partielle Suppression des cbfA(amber)-Stop-Codons zurückzuführen ist. Die Unterexpression von CMBF führte zu einer Erniedrigung der zellulären Menge an Sense- und Antisense-Transkripten der TRE5-A-Retrotransposons und im in vivo Testsystem zu einer maßgeblichen Reduktion der Retrotranspositions-Frequenz. Das Protein CMBF zeigt in der JumonjiC-Domäne (JmjC) Homologie zu einer Vielzahl von Proteinen prokaryontischer und eukaryontischer Organismen und könnte daher neben der Regulation der TRE5-A-Retrotransposition noch weitere biologische Funktionen in D. discoideum erfüllen. Die eingehende Untersuchung des Phänotyps der CMBFunterexprimierenden Mutante JH.D2 zeigte ein verlangsamtes Wachstum sowie einen um ca. 24 Stunden verzögerter Beginn der Entwicklung aufgrund der Inhibition des cAMP-Signalsystems. Durch die homologe Expression von CMBF und N-terminal verkürzter CMBF-Derivate konnte der Entwicklungs-Phänotyp von JH.D2 revertiert und somit der zelluläre CMBF-Mangel als alleinige Ursache für die phänotypische Veränderung von JH.D2 verantwortlich gemacht werden. Aufgrund von Zweifeln an der Richtigkeit des bislang angenommenen CMBF-kodierenden Gens (cbfA-Gen) wurde der Transkriptionsstart des cbfA-Locus mittels der 5’-RACE-Methode bestimmt und somit der Beginn des cbfA-Gens korrekt definiert. Das cbfA-Gen umfaßt demnach 3412 bp inklusive eines Introns von 409 bp und kodiert somit für ein 1000 Aminosäuren langes Protein mit einem rechnerischen Molekulargewicht von 114 198 kDa. Durch die Etablierung des in vivo Retrotranspositions-Testsystems in Dictyostelium discoideum sind die Voraussetzung für eine detaillierte Untersuchung der spezifischen Retrotransposition der TRE5-Retrotransposons gegeben. Die Herstellung der CMBF-unterexprimierenden D. discoideum-Mutante JH.D2 bietet die Möglichkeit einer eingehenden Funktions-Analyse der charakteristischen Domänen von CMBF.
Leukämien sind maligne Erkrankungen des hämatopoietischen Systems, die teilweise mit einer sehr schlechten Prognose einhergehen. Die Phänotypen sowie die verursachenden Mutationen in den hämatopoietischen Vorläuferzellen sind vielfältig. 5-10 % aller Akuten Leukämien korrelieren mit genetischen Veränderungen des MLLGens auf Chromosom 11q23. Besonders häufig findet man reziproke, chromosomale Translokationen. Leukämien mit diesen Mutationen zählen fast ausschließlich zu den Hochrisiko-Leukämien, wobei der Partner des MLL-Gens Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung hat. Bisher sind 43 Translokationspartner des MLL-Gens bekannt, von denen jedoch in der Routinediagnostik nur die 6 häufigsten, MLLT2, MLLT1, MLLT3, MLLT4, ELL und MLLT10 untersucht werden. Seltene oder unbekannte Partnergene werden von den Analysen ausgenommen. Da das Partnergen aber wichtig für die Risikoeinstufung der Erkrankung ist, ist es notwendig, dieses rasch zu identifizieren, um ein optimales Therapieprotokoll anwenden zu können. Aus diesem Grund wurde eine universelle, PCR-Methode entwickelt und etabliert, die es erlaubt, jede MLL-Translokation, auch ohne vorherige Kenntnis des Partnergens, zu identifizieren. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, sowohl das Partnergen, als auch den chromosomalen Bruchpunkt basengenau auf DNA-Ebene zu analysieren. Mit dieser Technik sind im Verlauf der Studie 501 Patienten untersucht worden (319 Kinder, 179 Erwachsene, 3 ohne Altersangabe). Bei diesen Analysen wurden 9 neue Partnergene entdeckt: ACACA, SELB, SMAP1, TIRAP, ARHGEF17, BCL9L, KIAA0284, MAML2 und APBB1IP. Für alle positiven Patientenproben sind außer den Partnergenen auch die basengenauen Bruchpunkte kartiert worden. Die Kenntnis des Patienten-spezifischen Bruchpunktes erlaubt eine exakte Quantifizierung der Blastenlast mittels qPCR und ermöglicht somit ein empfindliches Monitoring des Krankheitsverlaufs unter Therapie und die Detektion einer minimalen Resterkrankung (MRD).
Klonierung und Charakterisierung eines ecotropen porzinen endogenen Retrovirus der Klasse C (PERV-C)
(2006)
Durch die vertikale Vererbung von endogenen Retroviren, deren Fähigkeit humane Zellen in vitro zu infizieren und ihrer Rekombinationsfähigkeit besteht ein Risikopotential bei der Verwendung porziner Gewebe bzw. Organe im Rahmen der XTx, weshalb ein Screening auf PERV im Genom von Spendertieren und eine immunologische Kontrolle von Xenotransplantatempfängern von Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnten vier native, teilweise unvollständige, provirale Sequenzen aus einer Genbibliothek einer Zelllinie von Minischweinen isoliert werden. Der Molekularklon PERV-C(1312) zeigt die vollständigen Leserahmen für das gag-, pol- und env-Gen, die 5LTR Sequenz beinhaltet einen Repeat mit 39 bp. Das Virus ist in der Lage produktiv porzine ST-IOWA Zellen in vitro zu infizieren und nach Transfektion in humane Nierenzellen in das Genom zu integrieren. Eine Rekombination mit PERV-B(33)/ATG Partikeln konnte nicht gezeigt werden. Nach Transfektion von Deletionsmutanten von PERV-B(33)/ATG in MAX-T Zellen, denen das gag- und pol-Gen fehlte und lediglich der offene Leserahmen für das env-Gen intakt war, konnte keine Rekombination bzw. Inkorporation von Env-B Proteinen in PERV-C Partikeln nachgewiesen werden. Für eine immunologische Detektion des Env-C Proteins wurde ein polyklonales Antiserums in Kaninchen generiert und ein monoklonaler Antikörper hergestellt. Die Epitope für beide Antikörper sind im SU des env-C Gens lokalisiert. Das Env-C Protein kann durch das polyklonale Antiserum durch Western Blot Analyse in Zelllysaten und in immunhistochemischen Analysen in verschiedenen Zelllinien detektiert werden. In PERV-C Partikeln wird das Env-Protein sowohl durch das polyklonale Antiserum als auch durch den monoklonalen Antikörper spezifisch detektiert. Durch den immunologischen Nachweis von PERV-C Proteinen ist es möglich im Hinblick auf eine XTx den Nachweis dieser Proteine in möglichen Rezipienten durchzuführen. Durch die zusätzlich isolierten Flankensequenzen des replikationskompetenten Molekularklons PERV-C(1312) wäre eine Screening Methode, durch die Verwendung einer spezifischen Flankensonde, möglich, um genomische Integrationsorte und somit die Präsenz dieses Provirus in den Zellen des Spendertieres vorab zu überprüfen, um möglichst Spendertiere für eine XTx zu verwenden, die frei von PERV-C(1312) sind. Somit leistet diese Arbeit einen Beitrag zur besseren Evaluierung des Risikopotentials zukünftiger Xenotransplantationen.