Refine
Year of publication
- 2006 (5) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (5)
Has Fulltext
- yes (5)
Is part of the Bibliography
- no (5)
Keywords
- ADAM10 (1)
- Aktivitätsmuster (1)
- Bindungsaffinität (1)
- Clathrin-vermittelte Endozytose (1)
- Ectodomain Shedding (1)
- Exozytose (1)
- G-Protein-gekoppelter Rezeptor (1)
- GLUT4 (1)
- GSVs (1)
- Immunadsorption (1)
Institute
Die Zusammensetzung der Plasmamembran tierischer Zellen kann unter anderem durch regulierte Exozytose und durch hydrolytische Abspaltung von Ektodomänen membran-assoziierter Proteine (Ectodomain Shedding) modifiziert werden. Regulierte Exozytose spezialisierter Vesikel, den sogenannten GSVs (GLUT4 containing small vesicles), dient der intrazellulären Speicherung des Glucosetransporters4 (GLUT4) sowie seinem insulin-abhängigen Einbau in die Plasmamembran. Die proteolytische Abspaltung der Ektodomänen von Zelloberflächenproteinen wie z.B. des Heparin-bindenden epidermalen Wachstums-faktors (heparin binding-epidermal growth factor = HB-EGF) führt zur Modifikation der Plasmamembranzusammensetzung. Wir zeigten, dass GSVs in vielen Säugerzellen für die intrazelluläre Speicherung spezifischer Plasmamembranproteine und deren stimulations-abhängigen Transfer in die Plasmamembran zuständig sind. Um GSVs eindeutig identifizieren zu können, wurden Rat1-Zellen stabil mit GLUT4myc als heterologem Marker für dieses spezifische Speicherkompartiment transfiziert. Die intrazelluläre GLUT4-Lokalisation in den als positiv identifizierten Rat1/GLUT4myc-Klonen entsprach dem für CHO/GLUT4-Zellen beschriebenen Verteilungsmuster. In der Folge wurden mehrere potentiell vesikel-assoziierte Membranproteine in die Untersuchungen zur Membran-zusammensetzung einbezogen: eine endogene proHB-EGF hydrolysierende Proteaseaktivität und die Metalloproteasen ADAM10 und TACE. Es zeigte sich, dass GSVs eine Proteaseaktivität enthielten, die VSVG-proHB-EGF hydrolysierte. Eine Colokalisation der beiden endogenen Metalloproteasen ADAM10 und TACE mit GLUT4 in GSVs konnte gezeigt werden. Untersuchungen zeigten, dass beide endogenen Proteasen ADAM10 und TACE in Rat1/GLUT4myc-Zellen mit einer Subpopulation von GSVs assoziiert zu sein scheinen. Die Stimulation des G-Protein-gekoppelten Thrombinrezeptors löste in diesen Zellen eine regulierte Exozytose der GSVs aus. Die Metalloproteasen-enthaltenden GSVs reagierten jedoch nicht auf diese Art der Stimulation. Sie bildeten möglicherweise eine Reservepopulation von GSVs, die erst bei stärkerer Stimulation mobilisiert werden kann. Unter Ruhebedingungen schien auch diese Vesikelpopulation über andere intrazelluläre Kompartimente, nicht jedoch über die Plasmamembran, zu rezirkulieren.
In dieser Arbeit wurde das Proteom synaptischer Vesikel mit Hilfe vier verschiedener elektrophoretischer Techniken in Kombination mit Massenspektrometrie eingehend charakterisiert. Die bisherigen Proteomansätze resultierten in der Identifizierung einer deutlich geringeren Anzahl von Proteinen. Bis auf wenige Ausnahmen wurden alle in der Literatur beschriebenen Proteine detektiert. Dies zeigt, daß die Verwendung der eingesetzten Techniken die umfassende Charakterisierung der Proteinbestandteile der Vesikel zuläßt. Ferner kann aus den Analysen geschlossen werden, daß zum jetzigen Zeitpunkt die technischen Grenzen für die Charakterisierung nicht weiter subfraktionierter synaptischer Vesikel erreicht sind. Die Anwendung der drei Techniken legt nahe, daß jede Technik ihre Vor- und Nachteile für die Identifizierung bestimmer Proteinklassen besitzt. Dies wurde bisher noch nicht in dieser Form gezeigt und liefert wertvolle Informationen für weitere Proteomanalysen. Zu den in der Summe 238 identifizierten Proteinen gehören neun Proteine, für die weder Lokalisations- noch Funktionsdaten vorliegen. Die zwei ausgewählten Proteine Svap30 und SV35 zeigen eine gliale bzw. neuronale Verteilung. SV35 befindet sich in Subpopulationen von Neuronen, die nach immunhistochemischer Untersuchung als GABAerg und glutamaterg zu werten sind. Welche Funktion dieses Protein in diesen Neuronen ausübt, bleibt zu klären. Analysen mittels RNA-Intereferenz in PC12-Zellen und Untersuchungen zur Änderung der catecholaminergen Transmitterausschüttung könnten erste Indizien liefern. Zudem könnte über Transfektion des Proteins in Oozyten die Identität des putativ transportierten Substrates bestimmt werden. All diese Arbeiten werden in Zukunft zu einer eingehenden Charakterisierung des Proteins beitragen.
Induktion verschiedener Aktivitätsmuster über differentielle Rezeptor-Rekrutierung von Typ I IFN
(2006)
Für die grundlagenorientierte Forschung sowie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt der Mechanismus der interzellullären Kommunikation über Botenstoffe, wie Cytokine, eine einflussreiche Rolle. Cytokine sind Proteine, welche von Leukozyten sekretiert werden und von großer Bedeutung für die Stimulierung des angeborenen Immunsystems sind. Hierbei bewirken die Typ I Interferone (Interferone, IFN) durch ihre antivirale, immunmodulatorische, antiproliferative und antiflammatorische Wirkung. Zudem stellen sie eine Verbindung zu der zellulären Immunantwort dar, wirken bei antionkogenen Prozessen mit und aktivieren eine Vielzahl an weiteren Funktionen in der Zelle. Bekannt sind bisher eine Vielzahl verschiedener humaner Interferone (verschiedene IFNa-Subtypen, b, w und e), die über einen gemeinsamen Rezeptor wirken, der sich aus den Untereinheiten ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt. Auffallend ist, dass verschiedene Interferone unterschiedliche zelluläre Aktivitätsmuster induzieren. Mit dieser Arbeit sollte daher ein möglicher Zusammenhang zwischen der differentiellen Rezeptor-Rekrutierung verschiedener Interferone und der Induktion verschiedener Aktivitäten geklärt werden. Voraussetzung hierfür war die Aufreinigung verschiedener Interferone (IFNa1, IFNa2, IFNa8, IFNa21, IFNb), Mutanten sowie Cystein-Mutanten zur selektiven Fluoreszenzmarkierung in ausreichender Menge und Reinheit. Um den Einfluss der Bindungsaffinität auf die Aktivität zu untersuchen, wurden Aminosäuren innerhalb der Bindungsstellen zu den Rezeptoruntereinheiten ausgetauscht. Die Änderung der Bindungsaffinität sowie deren Effekt auf die Aktivität wurden überprüft. Mit Hilfe der Cystein-Mutanten an der Position a2S136C / a/wS137C konnte eine ortsspezifische Fluoreszenzmarkierung durchgeführt werden. Für die Untersuchung der Interaktion wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über einen Deka-Histidin-tag immobilisiert wurden. Die Interaktion wurde in Echtzeit mit der markierungsfreien reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) und der totalinternen Reflektions-Fluoreszenzspektroskopie (TIRFS) detektiert. Hierzu wurden die Stöchiometrie, die Kinetik der Interaktion sowie die Bindungsstelle durch Kompetition zu den Rezeptoruntereinheiten charakterisiert. Dabei zeigten sich in der Stöchiometrie (binärer/ternärer Komplex), den Bindungsstellen oder der Konformationsänderung durch ifnar1 keine Unterschiede zwischen den IFN. Als einziges Unterscheidungsmerkmal konnten signifikant unterschiedliche Bindungsaffinitäten an die Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 nachgewiesen werden. Dabei war die Rezeptoruntereinheit ifnar2 gegenüber ifnar1 stets die höher affine Komponente mit deutlichen Affinitätsunterschieden von bis zu drei Größenordnungen. Ebenfalls wurde die Assemblierung eines ternären Komplexes untersucht, für den eine 1:1:1-Stöchiometrie für alle IFN beobachtet wurde. Für Assemblierung ternärer Komplexe konnte ein Einfluss durch die Bindungsaffinitäten sowie den relativen sowie absoluten Konzentration der Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Für die Untersuchung verschiedener zellulärer Aktivitäten, die durch die IFN induziert werden, wurde die Assemblierung des Transkriptionsfaktors ISGF3 (Interferon stimulierten Genfaktors 3), die antivirale Aktivität gegen vesikuläre Stomatitis Viren (VSV) sowie die antiproliferative Aktivität überprüft. Für die ISGF3-Aktivität konnten große Unterschiede für die effektiven Konzentrationen (EC50) zwischen den IFN beobachtet werden (pM- bis nM-Bereich). Für eine antiproliferative Aktivität wurde Konzentrationen im nM-Bereich benötigt. Insbesondere konnten Unterschiede zwischen den Aktivitätsmustern beobachtet werden. Durch die Korrelation der Bindungsaffinitäten mit den jeweiligen Aktivitäten konnte ein deutlicher Zusammenhang beobachtet werden. So wurde für die Induktion der ISGF3-Assemblierung eine Abhängigkeit zu der ifnar2-Affinität nachgewiesen. Bei niedrigen IFN-Konzentrationen wird über die ifnar2-Affinität die Verweildauer der Interferone auf der Oberfläche beeinflusst, wodurch Einfluss auf die Anzahl an ternären Komplexen genommen wird. Im Gegensatz hierzu zeigte sich für die antiproliferative Aktivität eine Korrelation zu der Affinität an ifnar1. Auffällig war zudem die Korrelation der differentiellen antiproliferativen Aktivität zu der relativen Bindungsaffinität von ifnar1 zu ifnar2. Dies lässt sich durch eine mögliche Adaption der Zellen gegenüber IFN erklären, die eine Regulation der Rezeptorkonzentration auf der Membran bewirkt. Durch die Modulation der Bindungsaffinität zu ifnar2 und ifnar1 konnte der Einfluss auf die Aktivität bestätigt werden. In der Medizin könnte dies für eine verbesserte therapeutische Anwendung von Bedeutung sein, da der Einsatz von Interferonen zurzeit durch eine Vielzahl an Nebenwirkungen eingeschränkt ist.
Active neurogenesis continuously takes place in the dentate gyrus of the adult mammalian brain. The dentate gyrus of the adult rodent hippocampus contains an astrocytelike cell population that is regarded as residual radial glia. These cells reside with their cell bodies in the subgranular layer (SGL). Radial processes traverse the granule cell layer (GCL) and form bushy ramifications in the inner molecular layer (IML). The residual radial glial cells apparently represent neuronal progenitor cells that can give rise to functionally integrated granule cells. To date the cellular and molecular events driving a subpopulation of these cells into neurogenesis as well as the cellular transition states are poorly understood. The present study shows, that in the mouse dentate gyrus, this cell type selectively expresses surfacelocated ATPhydrolyzing activity and is immunopositive for nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2). NTPDase2 is an ectoenzyme and hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates such as ATP or UTP to their respective nucleoside diphosphates. The enzyme becomes expressed in the hippocampus during late embryogenesis from E17 onwards, and is thus not involved in early brain development. Its embryonicpattern of expression mirrors dentate migration of neuroblasts and the formation of the primary and finally the tertiary dentate matrix. NTPDase2 is also expressed by a transient population of cortical radial glia from late embryonic development until postnatal day 5. NTPDase2 can be employed as a novel markerfor defining cellular transition states along the neurogenic pathway. It is associated with subpopulations of GFAP and nestinpositive cells. These intermediate filaments are typically expressed by the progenitor cells of the dentate gyrus. In addition there is a considerable overlap with doublecortinand PSANCAM positive cells. The expression of the microtubuleassociated protein doublecortin and of PSANCAM which are expressed by migrating neuroblasts is indicative of a transition of progenitors to a neural phenotype or an immature form of granule cell. NTPDase2 is no longer associated with young neurons and with maturegranule cells, as indicated by the lack of doubleimmunostaining for III tubulin and NeuN, respectively. Furthermore, β S100positive astrocytes do not express NTPDase2 validating that NTPDase2 is also not associated with later stages of gliogenesis. Experiments with the Sphase marker bromodeoxyuridine (BrdU) demonstrate that NTPDase2positive cell proliferate. Postmitotic BrdU-labeled cells preferentially acquire an NTPDase2positive phenotype. Many of these cells were also positive for GFAP. The contribution of BrdUlabeled cells positive for NTPDase2 increased with time from 2 h to 72 h, validating a strong association of NTPDase2 with proliferating cells of the dentate gyrus. The colocalization studies with various markers and the results of the experiments suggestthat NTPDase2 is associated with cell types of varying maturation states but not with mature neurons or astrocytes. Studies on the formation of neurospheres from the dentate gyrus validate previous data suggesting that the hippocampal progenitors have little capacity for self renewal in vitro. In situ hybridization results indicate the presence of one of the metabotropic purinergic receptor subtypes (the P2Y1 receptor) within the adult neurogenic regions, the dentate gyrus and the lateral walls of the lateral ventricles. A patchclamp analysis demonstrates the presence of functional ionotropic nucleotide receptor (P2X receptors) in progenitor cells expressing nestin promotordriven GFP. They suggest that the signaling pathway via extracellular nucleotides and nucleotide receptors may play a role in the control of adult hippocampal neurogenesis.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Insektenzellen /Baculovirus-System für die heterologe Expression der NTPDase6 etabliert. Nach der Herstellung und Selektion des NTPDase6-positiven Baculovirus wurden drei Insektenzelllinien hinsichtlich der optimalen Expressions-bedingungen für die NTPDase6 analysiert. In Sf9(+Serum)-, Sf9(-Serum)- und High FiveTM-Zellen wurde eine Expression und Sekretion des aktiven Enzyms nachgewiesen. Ferner konnte durch die Analyse mit PNGaseF eine partielle N-Glykosilierung experimentell gezeigt werden. Die Aktivität im Kulturüberstand übertraf generell die Aktivität in der löslichen Zellfraktion. Die höchste GDPase-Aktivität war mit 22,96 nmol Pi /(106 Zellen x min) nach 6 Tagen im Kulturüberstand der SF9(-Serum)-Zellen zu verzeichnen. Nachdem die Erntequelle sowie der Erntezeitpunkt feststanden, wurden in den folgenden Experimenten verschiedene chromatographische Verfahren für eine Reinigung der NTPDase6 analysiert. Eine Bindung der NTPDase6 konnte für die Chromatographie mit Con A-Sepharose 4B, Q Sepharose Fast Flow, Reactive Red 120-Agarose, Reactive Green 19-Agarose, Cibacron Blue 3GA-Agarose und die Reactive Brown 10-Agarose verzeichnet werden. Hingegen wurde eine nur partielle Bindung der NTPDase6 für die Reactive Yellow 86-Agarose, Reactive Blue 4-Agarose und die Ni2+-NTA-Agarose nachgewiesen. Nicht oder kaum NTPDase6-bindend waren die CM Cellulose, GDP-Agarose, Protino Ni-TED und BD TALON. Ebenfalls analysiert wurde die Größenausschluss-Chromatographie mit Sephacryl S-100 HR unter verschiedenen Bedingungen. Für das finale Reinigungsschema wurde die Con A-Sepharose 4B-Chromato-graphie aufgrund der geringen Kosten und des großen Volumens als erster Reinigungsschritt eingesetzt. Als zweite Phase der sequentiellen Reinigung wurde die Cibacron Blue 3GA-Agarose ausgewählt, da in der Pilotstudie über die Reaktivfarbstoffe mit diesem Material die höchste Elution der GDPase-Aktivität beobachtet werden konnte. Für den dritten Schritt wurde aufgrund der hohen Trennschärfe die Ni2+-NTA-Agarose verwendet. Insgesamt wurde mit diesen drei Schritten eine 180 fache, partielle Reinigung der NTPDase6 erreicht. Es erwies sich, dass die erhaltene Proteinmenge für die geplanten Röntgenstrukturanalyse und die Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie nicht ausreichte. Als weitere Möglichkeit für die Untersuchung des angereicherten Enzyms stand die MALDI-TOF-Analyse zur Verfügung. In diesen Untersuchungen wurde die Aminosäuresequenz zu 43,9 % verifiziert und es ergaben sich Hinweise darauf, dass die potenzielle N256-Glykosilierungssstelle bei der heterologen Expression in Insektenzellen nicht genutzt wird. Weiterhin wurden die potenziellen N-terminale Signalpeptide und Spaltstellen der NTPDase6 in silico mit Hilfe des SignalP 3.0-Algorithmus analysiert. Diese Untersuchungen ergaben putative Spaltstellen an den Aminosäurepositionen L25 und A40 mit einer Wahrscheinlichkeit von 37 % und 7 %. Mit Triton X-114-Separationen wurde ferner nachgewiesen, dass 60,7 % der NTPDase6 in der Zelle in löslicher Form und 39,3 % in membrangebundener Form vorliegen. Die hier erbrachten Nachweise einer putativen N-terminalen Spaltstelle und der intrazellulären Spaltung des hydrophoben Signalpeptides deuten darauf hin, dass es sich bei der Sekretion des Proteins um einen physiologischen Vorgang handelt. Es ist wahrscheinlich, dass die gleichzeitige Lokalisation des Enzyms im Golgi-Apparat und im Kulturüberstand einen physiologisch relevanten Mechanismus darstellt und das Enzym extra- sowie intra-zellulär für die Hydrolyse von 5’-Nukleosid-Diphosphaten verantwortlich ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Lokalisation der NTPDase6 in vivo untersucht. Dazu wurden NTPDase6-Antikörper hergestellt und mit Hilfe von Immunoblots sowie in der Immunzytologie charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die NTPDase6-Antikörper nur in der Immunzytologie verwendet werden können. Zur Untersuchung der zellspezifischen Expression der NTDPase6 wurden anschließend immunhistologische Analysen am adulten Rattengehirn durchgeführt. Markierte Zellen präsentierten sich z.B. im gesamten Kortex des Gehirns, im Gyrus dentatus des Hippokampus, im Corpus striatum und im Septum. Die markierten Zellen zeigten eine organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns, die eine Markierung von Golgi-Stapeln vermuten lässt. Nur in Zellen mit einem großen Nukleus, bei welchen es sich um große Nervenzellen handeln dürfte, konnte die beschriebene Fluoreszenz nachgewiesen werden. Diese Markierungen als NTPDase6-spezifisch zu beurteilen ist jedoch schwierig, da die Präimmunkontrollen eine schwache, organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns von Zellen mit einem großen Nukleus aufwiesen. Insgesammt liefern die Untersuchungen einen neuen Beitrag zum Verständnis der Struktur und der Prozessierung der NTPDase6 sowie ein Verfahren zur heterologen Expression und zur anschließenden partiellen Aufreinigung des Enzyms.