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Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Wechselwirkung des AD-assoziierten Proteins PS1 mit dem Cytoskelett in verschiedenen biochemischen und immuncytochemischen Modellen zu untersuchen. Auf diese Weise sollten Hinweise für das Verständnis der bisher nur in Grundzügen bekannten physiologischen Funktion von PS1 erhalten werden. Ausgehend vom Nachweis der Anreicherung endoproteolytischer PSI-Fragmente in Cytoskelett-Fraktionen aus Hirngewebe wurde die spezifische Assoziation des Proteins mit Mikrofilamenten, Mikrotubuli und Neurofilamenten untersucht. Alle durchgeführten biochemischen und immuncytochemischen Experimente zeigen übereinstimmend die spezifische Assoziation von PS1 mit Mikrofilamenten. So konnten PSI-Fragmente über zwei Depolymerisations/ Polymerisations-Zyklen zusammen mit Actin aus Rattenhirn aufgereinigt werden. Die spezifische Spaltung von Actin-Filamenten durch Gelsolin in cytoskelettreichen Fraktionen aus Hirngewebe führte zur Freisetzung kürzerer Filamente, die nach Zentrifugation zusammen mit PS1- Fragmenten im Überstand erschienen. In immuncytochemischen Färbungen kolokalisierte PS1 mit Actin-Filamenten in primären Gliazellen und der neuronalen Zelinie NT2. Eine vor kurzem veröffentlichte Arbeit zeigte außerdem die Kolokalisation von PS1 und Mikrofdamenten in primären Hippocampus-Neuronen. Die fehlende Kosedimentation von in-vitro translatiertem PS1 und Deletionskonstrukten von PS1 mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Actin-Filamenten, das Fehlen konservierter Actin-Bindungsmotive in der Aminosäuresequenz von PS1 sowie bekannte Interaktionen von PS1 mit Actin-bindenden Vertretern der Filamin- und Armadillo-Proteinfamilien lassen auf eine indirekte Assoziation von PS1 mit Mikrofdamenten schließen. Die vorliegende Arbeit konnte die Frage, welche Rolle Mikrotuli oder Neurofilamente bei der Cytoskelett-Assoziation von PS1 spielen, nicht abschließend Mären. PS1-Fragemente wurden im ersten, nicht jedoch im zweiten Depolymerisations/Polymerisations-Zyklus zusammen mit Tubulin aus Rattenhirn aufgereinigt. In dem gleichen Versuchsansatz kosedimentierte in-vitro translatiertes PS1 nicht mit Mikrotubuli. Immuncytochemische Färbungen zeigten dagegen die Kolokalisation von PS1 mit Mikrotubuli in primären Hippocampus-Neuronen, die auch von zwei aktuellen Arbeiten in primären Hippocampus-Neuronen und murinen Embryonen bestätigt wurde. Die spezifische Depolymerisation von Mikrotubuli in cytoskelettreichen Fraktionen war unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bedingungen nicht erfolgreich, so daß aus diesem Experiment keine Aussagen zur Assoziation von PS1 mit Mikrotubuli abgeleitet werden konnten. Es Iäßt sich die Hypothese aufstellen, daß sehr kleine PSI-haltige Vesikel über andere Proteine als PS1 mit Mikrotubuli verbunden sind, so daß PS1 mit Mikrotubuli scheinbar kolokalisiert ist. Hochauflösenden lichtmikroskopische bzw. elektronenmikroskopische Aufnahmen oder biochemische Versuche, die nicht zur Zerstörung der Vesikel durch Detergens führen, könnten für die Überprüfung dieser Hypothese herangezogen werden. In-vitro translatiertes PS1 sowie Deletionskonstrukte von PS1 kosedimentierten nicht mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Neurofilamenten, und in primären Hippocampus-Neuronen kolokalisierte PS1 nicht mit Neurofilamenten. Es wäre jedoch wünschenswert, die Experimente mit geeigneten Positiv-Kontrollen für die Kosedimentation und geeigneteren Antikörpern, die bei einem besseren Signal/Hintergrund-Verhältnis eine stärkere Vergrößerung der Immunfluoreszenzen erlauben, zu wiederholen. Im transgenen Tiermodell beeinträchtigten pathogene Mutationen von PS1 nicht, zumindest nicht quantitativ, die Fähigkeit von PS1, an Cytoskelett-Elemente zu binden. Es wäre jedoch möglich, daß es Unterschiede in der Cytoskelett-Assoziation von wt PS1 und PS1 mit pathogenen Mutationen gibt, die nur im Gewebe von FAD-Patienten zu detektieren sind, nicht aber im transgenen Tiermodell, da die bisher bekannten AD-Tiermodelle nicht alle Aspekte der Erkrankung reproduzieren. Die vorliegenden Ergebnisse können die Basis bilden für weitergehende Untersuchungen zur Funktion von PS1 und der Bedeutung von PS1-Cytoskelettinteraktionen in der Alzheimer Demenz. Aktuelle Arbeiten fokussieren dabei stark auf die Interaktion von PS1 mit Mikrofilament-bindenden Vertretern der Armadillo-Proteinfamilie, die bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Im Diskussionsteil wurde ausgeführt, daß aber, gerade im Hinblick auf die Neurodegeneration bei der Alzheimer Demenz, ein möglicher Einfluß von PS1 auf den schnellen axonalen Transport ein interessanter Ansatz für weitere Versuche sein kann.
Es wurden Antidepressiva verschiedener Klassen bezüglich ihrer Hemmung von Pgp in zwei Zellsystemen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Calcein-AM) untersucht. Die untersuchten Substanzen zeigen alle in höheren Konzentrationen eine Hemmung von Pgp. Da diese Konzentrationen nach Applikation therapeutisch relevanter Dosen in-vivo nicht erreicht werden, lässt sich die These, dass ein Teil der antidepressiven Wirkung dieser Substanzen durch Normalisierung der HPA-Achse zu Stande kommt, durch die Ergebnisse dieser Arbeit nicht bestätigen. Weiterhin sollte untersucht werden, ob die Hemmung von Pgp eine Eigenschaft ist, die Antidepressiva von anderen zentral-wirksamen Substanzklassen unterscheidet. Ausgehend von der Annahme, dass die Hemmung von Pgp zur antidepressiven Wirksamkeit beiträgt, wäre die Schlussfolgerung naheliegend, dass andere Gruppen, wie z.B. Antipsychotika diese Eigenschaft nicht aufweisen. Daher wurden drei verschiedene Antipsychotika bezüglich der Modulation der Aktivität von Pgp im Calcein-AM Assay untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Antipsychotika ebenfalls Pgp in höheren Konzentrationen – ähnlich der hemmenden Konzentrationen von Antidepressiva - inhibieren. Von daher ist die Hemmung von Pgp keine substanzklassenabhängige Eigenschaft der Antidepressiva, sondern eher eine unspezifische Eigenschaft, die verschiedene ZNS-wirksame Wirkstoffklassen aufweisen. Des Weiteren wurde die Modulation der Expression von Pgp durch Antidepressiva untersucht. Denn beide Veränderungen, zum einen bezüglich der Aktivität von Pgp und zum anderen bezüglich der Expression von Pgp, können zu klinisch relevanten Arzneimittelinteraktionen führen. Der Hauptuntersuchungsgegenstand dieser Arbeit ist Johanniskrautextrakt, daher wurde in-vitro der Extrakt selbst und die aus dem Calcein-Assay als potenteste Modulatoren anzusehenden Inhaltsstoffe bezüglich der Expression untersucht. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass der Extrakt selbst und auch Hyperforin die Expression von Pgp induzieren. Die Induktion durch Hyperforin entspricht der durch den Gesamtextrakt, so dass man sagen kann, dass Hyperforin der Inhaltsstoff von Johanniskrautextrakt ist, der die Expression von Pgp induziert. Diese Wirkung kommt über eine Aktivierung des PXR zu Stande, der seinerseits die Expression von Pgp moduliert. Hyperforin ist als starker PXR Ligand charakterisiert. Die Induktion konnte ebenfalls im Gehirn von Mäusen nach 14tägiger oraler Applikation von Johanniskrautextrakt gesehen werden. Für die Versuche bezüglich der Expression von Pgp im Gehirn von Mäusen und für das nächste Untersuchungsziel, die Untersuchung der Verteilung von Corticosteron in Mäusen, wurden Behandlungsstudien durchgeführt. Es wurden männliche, 2-3 Monate alte NMRI-Mäuse oral durch Schlundsondierung mit den entsprechenden Substanzen behandelt. Es wurden akute (einmalige Applikation und Tötung der Tiere 1h später) und subchronische (14tägige Applikation, Tötung an Tag 15) Studien durchgeführt. Es sollte überprüft werden, ob Antidepressiva die Verteilung von Glucocorticoiden im Körper (Gehirn/Plasma) modulieren können. Diesbezüglich wurde der Effekt von Johanniskrautextrakt, Mirtazapin, Amitriptylin und Fluoxetin nach akuter Einmalgabe und nach subchronischer 14tägiger oraler Applikation der Substanzen untersucht. Amitriptylin zeigt keinen Effekt auf die Konzentration und/oder Verteilung von Corticosteron, weder nach akuter noch nach subchronischer Gabe. Fluoxetin erhöht die Corticosteronlevel in Gehirn und Plasma sowohl nach Einmalgabe als auch nach subchronischer Applikation signifikant. Mirtazapin erhöht akut ebenfalls Corticosteron in Gehirn und Plasma, nach subchronischer Applikation nivelliert sich dieser Effekt jedoch wieder. Nach 14tägiger Gabe ist kein signifikanter Unterschied mehr zur Kontrolle zu erkennen. Johanniskrautextrakt verhält sich ähnlich wie Fluoxetin. Es erhöht im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle Corticosteron in Plasma und Gehirn sowohl nach akuter als auch nach subchronischer Applikation. Keine der untersuchten Substanzen verschiebt die Verteilung von Corticosteron zwischen Gehirn und Plasma im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Konzentration von Corticosteron im Körper wird über 5-HT2 Rezeptoren gesteuert. Indirekte Agonisten wie Fluoxetin und Johanniskrautextrakt erhöhen sie, Antagonisten wie Mirtazapin und Amitriptylin verändern sie nicht. Zusammenfassend kann man bezüglich des Hauptuntersuchungsgegenstandes Johanniskrautextrakt sagen, dass der Extrakt selbst, Hyperforin und Quercetin in der Lage sind, die Transportaktivität von Pgp konzentrationsabhängig zu modulieren. Nach längerer Inkubation induziert der Extrakt durch die Wirkung von Hyperforin als PXR-Aktivator die Expression von Pgp. Darüber hinaus verändert Johanniskrautextrakt die Corticosteronausschüttung bei Mäusen, die oral mit dem Extrakt behandelt wurden, ohne die Verteilung zwischen Gehirn und Plasma zu verändern.
Untersuchungen zur ZNS-Bioverfügbarkeit wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoffe von Johanniskraut
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde die ZNS-Bioverfügbarkeit der Quercetin-Flavone und der Naphthodianthrone aus Hypericum perforatum untersucht. Hierzu wurde jew. eine HPLC-gestütze Methode zur Quantifizierung der genannten Stoffe in ZNS und Plasma erstellt und in enger Anlehnung an internationale Richtlinien (ICH- u. FDAGuidelines) validiert. Mit Hilfe dieser Methoden wurden im Anschluss Rattenfütterungsstudien durchgeführt und ausgewertet. Im Falle der Quercetin-Flavone konnte eindeutig gezeigt werden, dass diese Stoffgruppe ZNS-bioverfügbar ist und bei wiederholter Gabe (1 x tgl.) über den beobachteten Zeitraum von 8 Tagen im ZNS kumuliert. Ferner ist es gelungen, erste ZNS-Spiegelkurven der Quercetin-Flavone nach Einmal- und Mehrfach-Gabe aufzuzeichnen. Im Gegensatz hierzu weisen die Naphthodianthrone, unter Berücksichtigung der analytischen Grenzen, keine ZNS-Bioverfügbarkeit auf. Betrachtet man diese Ergebnisse im Kontext der bisher erschienenen Publikationen zu Johanniskraut, lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit die Rolle der Flavonoide eindeutig an Bedeutung gewinnt und die der Naphthodianthrone eindeutig an Bedeutung verliert. Schaut man auf die bisher untersuchten Inhaltsstoffe von Johanniskraut, wird deutlich, dass den Phloroglucinolen die wohl herausragendste Bedeutung zukommt, was nicht zuletzt durch Keller et al.[137] und Müller et al. [27,59,67] gezeigt werden konnte. Für die klinische Wirksamkeit des Hypericum-Extraktes sind jedoch auch die Flavonoide essentiell, was durch Tierstudien gezeigt und durch diese Arbeit unterstüzt werden konnte[114]. Der Mechanismus, durch den die Flavonoide zur antidepressiven Wirksamkeit beitragen, liegt, im Gegensatz zu dem der Phloroglucinole, jedoch noch im Dunklen. Durch die Präsenz von Quercetin bzw. dessen Metaboliten im ZNS auf der einen und den Ergebnissen von Tierstudien zur antidepressiven Wirksamkeit isolierter Flavonoide mit Hilfe des Porsolt-Tests auf der anderen Seite[33] lässt sich jedoch spekulieren, dass die Flavonoide einen direkten antidepressiven Effekt ausüben und nicht nur indirekt durch Verbesserung, beispielsweise der ZNS-Bioverfügbarkeit der Phloroglucinole o. ä., zu den antidepressiven Eigenschaften des Extraktes beitragen. Durch ihr Unvermögen, die Blut-Hirn-Schranke in nennenswerten Konzentrationen zu überschreiten, treten die Naphthodianthrone, die in der Vergangenheit als für die Wirksamkeit wichtigsten Inhaltsstoffe angesehen wurden, eindeutig in den Hintergrund. Als Beitrag dieser Stoffgruppe zur antidepressiven Wirksamkeit ist demnach erstens ein wie auch immer gearteter indirekter Effekt durch Verbesserung der ZNS-Bioverfügbarkeit der ZNS-gängigen Substanzen, zweitens ein wegen der bestenfalls möglichen, niedrigen Konzentrationen schwacher antidepressiver Effekt im ZNS, drittens ein antidepressiver Effekt durch aktive Metaboliten oder viertens ein antidepressiver Effekt, der sich in der Peripherie beispielsweise durch Beeinflussung der HPA-Achse abspielt, denkbar. Für ersteres existieren bis dato keinerlei Anhaltspunkte, für den zweiten Punkt existieren weder Beweis noch Gegenbeweis noch Spekulationen in der Literatur, dasselbe gilt für den dritten Punkt, der vierte Punkt wird hingegen kontrovers diskutiert[44,97,143]. In Publikationen wurde hierzu festgestellt, dass unter dem Einfluss von Hypericin sich die Blutspiegel an Cortisol und ACTH, die bei Depressiven erhöht bzw. gestört sind, wieder normalisieren. Der Einwand der Kritiker dieses Wirkmodells scheint hierbei aber plausibel, da es sich bei dem mit Hilfe von Hypericin beeinflussbaren, beobachteten Phänomen der Erhöhten Cortisol- und ACTH-Plasmaspiegel auch nur um ein Symptom einer Depression und nicht um einen für die Depression ursächlichen Vorgang handeln kann. Nicht jeder, bei dem erhöhte Cortisol- und veränderte ACTH-Spiegel vorliegen ist zwangsläufig depressiv. Das exakte Zusammenspiel der einzelnen Extrakt-Komponenten, von denen die bisher in den Focus der Untersuchungen geratenen Stoffe nur etwa 10 bis 15% ausmachen, bleibt jedoch auch weiterhin zum größten Teil im Unklaren, wenngleich gerade dieses Zusammenspiel die besonderen Eigenschaften des Extraktes und dessen Wirkung ausmachen. Unverzichtbare Bestandteile sind hierbei Phloroglucinole und Flavonoide, die in angemessenen Konzentrationen im Extrakt repräsentiert sein müssen, um ein klinisch hochwertiges Produkt zu gewährleisten. Inwieweit ein repräsentativer Gehalt an Hypericinen im Extrakt vorhanden sein sollte, ist nicht zuletzt auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit mit einem Fragezeichen zu versehen, wenngleich die Datenlage zur Zeit keinesfalls ausreicht, die Hypericine gänzlich aus dem Extrakt zu verbannen. In wie weit die An- oder Abreicherung einzelner Komponenten zu einer Verbesserung der klinischen Wirksamkeit führt, muss jedoch stets in zusätzlichen Studien eruiert werden. Insgesamt steht aber mit dem Johanniskraut-Extrakt für die erfolgreiche Therapie von milden bis mittelschweren Depressionen ein wichtiges, fast unverzichtbares Werkzeug zur Verfügung, das sich insbesondere durch sein verglichen mit synthetischen Antidepressiva, überaus günstiges Profil an unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen auszeichnet. Trotz in jüngster Zeit propagierter Bedenken hinsichtlich der Unbedenklichkeit der Anwendung von Johanniskraut Extraktpräparaten besonders in Kombination mit anderen Arzneistoffen, was jedoch einer genaueren Betrachtung nur schwer standhält[144], stellt der Johanniskraut-Extrakt zur Behandlung milder bis mittelschwerer Depressionen ein unverzichtbares Werkzeug dar.
Rationale und traditionelle Johanniskrautextrakt-Präparate : pharmazeutische Qualität im Vergleich
(2003)
Durch die zunehmende Bedeutung der Selbstmedikation wird die Beratungskompetenz der Apotheker immer wichtiger. Johanniskrautextrakt-Präparate sind in Deutschland nicht nur in der Apotheke, sondern auch in Drogerien und Supermärkten erhältlich. Sie besitzen einen unterschiedlichen Zulassungsstatus und damit verbunden Unterschiede in den qualitativen Anforderungen, die an sie gestellt werden. Nur durch eine kritische Bewertung von Erkenntnismaterial ist es möglich, aus einer sehr inhomogenen Gruppe qualitativ gute Johanniskrautextrakt-Präparate hervorzuheben. Bei den nach AMG zugelassenen und dem aktuellen Wissensstand entsprechenden Johanniskrautextrakt-Präparaten handelt es sich ausschließlich um Monopräparate, die als Wirkstoff Johanniskraut-Trockenextrakt enthalten. Für den Einsatz von gepulverter Droge fehlen bis heute klinische Belege. Auch für die Anwendung von fixen Kombinationen von mehreren pflanzlichen Extrakten steht eine rationelle Begründung bislang aus. Der Trockenextrakt muss durch ein Droge-Extrakt-Verhältnis und durch das verwendete Extraktionsmittel charakterisiert sein. Als Extraktionsmittel zur Herstellung der Extrakte sollte Methanol oder Ethanol verwendet werden. Als therapeutisch wirksame Tagesdosis gelten 2 – 4 g Drogenäquivalente. Die eingangs gestellte Frage, ob sich apothekenpflichtige Johanniskrautextrakt- Präparate von den Johanniskrautprodukten aus dem Drogerie-Segment abgrenzen, kann an Hand der vorliegenden Datenlage beantwortet werden. Untersuchungen hinsichtlich des Inhaltstoffspektrums zeigen, dass die Gehalte an wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffen, besonders die Hyperforin Werte, bei apothekenpflichtiger Ware deutlich höher sind, als dies bei nicht apothekenpflichtigen Präparaten der Fall ist. Die nicht apothekenpflichtigen Johanniskraut-Präparate sind dadurch charakterisiert, dass die mit der empfohlenen Tagesdosis zugeführte Wirkstoffmenge zum Teil erheblich unter jener liegt, die heute als erforderlich für eine Depressionsbehandlung angesehen wird. Bei den nicht apothekenpflichtigen Präparaten kam es zu erheblichen Schwankungen im Wirkstoffgehalt einzelner Chargen. Im pharmakologischen in vitro Assay schnitten die nicht apothekenpflichtigen Produkte bezüglich ihrer Wirkstärke, die Serotoninwiederaufnahme zu hemmen, deutlich schlechter ab als die apothekenpflichtigen Präparate. Es konnte eine sehr gute Korrelation der erotoninwiederaufnahmehemmung mit den jeweiligen Hyperforin-Gehalten der untersuchten Fertigarzneimittel aufgestellt werden. Die Wirksamkeit von Johanniskrautextrakt-Präparaten bei leichten bis mittelschweren Formen der Depression gilt heute als gesichert, sofern qualitativ hochwertige Extrakte in ausreichend hoher Dosierung eingesetzt werden. Die apothekenpflichtigen Präparate werden dem Anspruch, der an rationale Phytopharmaka gestellt wird, gerecht und sind daher als qualitativ besser einzustufen als nicht apothekenpflichtige Produkte. Die Untersuchung des Freisetzungsverhaltens von Hyperforin aus Jarsin® Präparaten macht deutlich, wie wichtig die Galenik von Johanniskrautextrakt-Präparaten im Hinblick auf die Bioverfügbarkeit der Inhaltstoffe ist. Jarsin®300 zeigt lediglich in 4 von 18 untersuchten Prüflingen eine 90-prozentige Freisetzung. Die Ursache hierfür liefert das Ergebnis der Untersuchungen der Dragee-Kerne. Zu hohe Presskräfte bei der Herstellung und ein Fehlen von Sprengmitteln in der Formulierung führen dazu, dass die Dragees in der vorgeschriebenen Versuchsdauer nicht zerfallen und Hyperforin nur unzureichend freigesetzt wird. Jarsin® 450 Tabletten entsprechen den Anforderungen, die an ein rationales Johanniskrautextrakt-Präparat gestellt werden. Bei dem Präparat Jarsin®750 müsste die Galenik dahingehend verbessert werden, dass die Freisetzung nicht vom Lösen des Überzugs und vom Zerfall der Tablettenkerne abhängig ist. Chargenkonformität ist bei allen untersuchten Jarsin® Präparaten gewährleistet. Untersuchungen zur Löslichkeit und zum Freisetzungsverhalten von Biapigenin aus Johanniskrautextrakt-Präparaten zeigen eine deutliche Abhängigkeit vom erwendeten Freisetzungsmedium. Wie schon für die Inhaltstoffe Hyperforin und Hypericin festgestellt werden konnte, besitzt nur das Medium FeSSIF diskriminierende und zugleich lösungsvermittelnde Eigenschaften. Um eine vollständige Freisetzung aller pharmazeutisch relevanten Inhaltstoffe zu gewährleisten, sollte die Einnahme von Johanniskrautextrakt-Präparaten nur mit einer Mahlzeit erfolgen. Durch den Vergleich der Freisetzungsprofile unterschiedlicher Johanniskrautextrakt-Präparate konnte deutlich gemacht werden, dass sie nicht vergleichbar und damit nicht ohne weiteres austauschbar sind. Für die Entscheidung, ob ein Johanniskrautextrakt-Präparat im Sinne der „aut idem Regelung“ durch ein anderes ausgetauscht werden kann, genügt es nicht, dass beide Produkte dieselbe Menge Extrakt derselben Ausgangsdroge aufweisen. Es muss zunächst sichergestellt werden, dass die beiden Präparate pharmazeutische Äquivalenz aufweisen. Die Untersuchungen von vermeintlich äquivalenten Johanniskrautextrakt-Präparaten zeigten deutlich, dass sie sich sowohl im Gehalt an pharmazeutisch relevanten Inhaltstoffen als auch im Freisetzungsverhalten erheblich unterscheiden. Die „autidem Regelung“ ist für Phytopharmaka somit nicht anwendbar. Die Möglichkeit, zwei Märkte zu beliefern, den apothekenpflichtigen und den nicht apothekenpflichtigen Arzneimittelmarkt, bietet der Industrie die Möglichkeit, sehr ähnliche Produkte mit allerdings erheblich unterschiedlichen Anforderungen anzubieten. Dies stellt für die rationalen Phytopharmaka in sofern eine Gefahr dar, als dass der Laie im Zweifelsfall eher zu den günstigen nicht apothekenpflichtigen Präparaten greift. Zusätzlich wird dem Patienten durch gezielte Werbekampagnen in Bezug auf die nicht apothekenpflichtige Ware gute Qualität durch traditionelle Anwendung suggerieren. Nicht apothekenpflichtige Präparate dürften nach heutigem Kenntnisstand jedoch gar nicht wirksam sein. Rechtlich gesehen erheben sie auch keinen Anspruch auf Wirksamkeit, da sie sich durch Hinweise in der Packungsbeilage von den apothekenpflichtigen Präparaten abgrenzen müssen. Das Problem liegt in der für den Laien fehlenden Transparenz. Nur Fachleuten sind die Unterschiede im Zulassungsstatus und den damit verbundenen Anforderungen an Qualität und Wirksamkeit der Johanniskrautextrakt-Präparate bekannt. Auf europäischer Ebene ist der Phytopharmakamarkt nicht einheitlich geregelt. Phytopharmaka zählen in vielen Ländern zu den Nahrungsergänzungsmitteln. Um zu verhindern, dass auch seriöse Phytopharmaka durch Harmonisierungsverfahren der EU aus dem Arzneimittelsegment herausgenommen werden, ist es notwendig, dass die rationalen Phytopharmaka den Anforderungen die an chemisch synthetische Arzneimittel gestellt werden, gewachsen sind. In diesem Zusammenhang ist die seit diesem Jahr gültige USP Monographie „Powdered St. Johns Wort Extract“ zu begrüßen, da sie hohe Anforderungen bezüglich des Gehaltes an Inhaltstoffen stellt. Nur wenn gesetzlich vorgeschrieben wird, welche Kriterien rationelle Phytopharmaka erfüllen müssen, wird einheitliche Qualität gewährleistet. Auf europäischer Ebene wäre die Einführung einer Johanniskrautextrakt-Monographie mit definierten Anforderungen nach dem Vorbild der USP wünschenswert. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Wirksamkeit von Johanniskrautextrakt-Präparaten bei leichten bis mittelschweren Formen der Depression heute als gesichert gilt. Vorraussetzung ist allerdings, dass qualitativ hochwertige Extrakte mit gleich bleibender Qualität in ausreichend hoher Dosierung eingesetzt werden. Da mit Veränderungen in der Zusammensetzung eines Fertigarzneimittels auch Veränderungen in der Wirksamkeit entstehen können, ist die reproduzierbare Qualität aus pharmazeutischer Sicht eine elementare Forderung. Apothekenpflichtige Arzneimittel sind auf Grund ihrer Überlegenheit bezüglich ihres Gehalts an pharmazeutisch relevanten Inhaltsstoffen, Chargenkonformität sowie ihrer Wirksamkeit im pharmakologischen Sinne, den nicht apothekenpflichtigen Arzneimitteln vorzuziehen. Vor dem Hintergrund, dass die Droge Johanniskraut auf der Indikationsliste nach § 109a Absatz 3 AMG des BfArM lediglich in Form von öligen Zubereitungen aus Johanniskrautflüssigextrakt, äußerlich angewandt, zur Unterstützung der Hautfunktion geführt wird, sollte die Freiverkäuflichkeit von nicht apothekenpflichtigen Johanniskrautextrakt-Präparaten bereits aufgehoben sein. In wirksamer Dosierung handelt es sich bei Johanniskrautextrakt-Präparaten um Arzneimittel, die nicht ohne die kompetente Beratung des Apothekers bzw. des pharmazeutischen Fachpersonals eingenommen werden sollten.
Dopamin-D2- und -D3-Rezeptorliganden als pharmakologische Werkzeuge und potenzielle Arzneistoffe
(2007)
Mit der Identifizierung der D2-ähnlichen Rezeptoren D2, D3 und D4 um das Jahr 1990 herum, begann die Erforschung deren physiologischer Bedeutung und die Suche nach selektiv bindenden Liganden. Die einzelnen Rezeptorsubtypen unterscheiden sich in ihrer Struktur, chromosomalen Lokalisation, Expressionsrate, anatomischen Verteilung und intrazellulären Signalweiterleitung. Verglichen mit D2-Rezeptoren sind D3-Rezeptoren insgesamt geringer an ihrer Zahl, weisen aber ein charakteristisches Verteilungsmuster im ZNS auf. Um eine vorwiegende Wirkung über D3-Rezeptoren hervorrufen zu können, ist eine Bindungsselektivität der Liganden gegenüber D2-Rezeptoren erforderlich, durch die die unterschiedliche Häufigkeit der beiden Rezeptorsubtypen wieder ausgeglichen wird. In einer richtungsweisenden Arbeit wurde 2003 die Rolle der D3-Rezeptoren in der Therapie des Morbus Parkinson und der Entstehung von L-DOPA-induzierten Dyskinesien aufgezeigt. Neuste Untersuchungen geben valide Hinweise auf klinisch relevante neuroprotektive und neuroregenerative Effekte bei Behandlung der neurodegenerativen Erkrankung mit D3-Rezeptoragonisten. Das Rückfallrisiko ehemals Drogenabhängiger durch mit dem Suchtstoff in Zusammenhang gebrachte Umweltstimuli ist entscheidend mit dem gleichen Rezeptorsubtyp verbunden. Die mögliche Behandlung Drogenabhängiger mit D3-Rezeptorliganden wird gegenwärtig intensiv untersucht. Mangels geeigneter Tiermodelle bisher wenig erforscht ist die therapeutische Bedeutung der D3-Rezeptorliganden bei schizophrenen Erkrankungen.Möglicherweise liegt hier ein besonderes Potential in der Behandlung von Negativsymptomen. Der im Handel befindliche Arzneistoff Pramipexol (Sifrol®) diente als Leitstruktur für die Synthese zahlreicher Liganden an D2- und D3-Rezeptoren. Weitere Leitstrukturen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit identifiziert und variiert. In einem ersten Schritt wurde die Bedeutung der 2-Aminogruppe an der Thiazolstruktur des Pramipexols untersucht. Sollte diese entgegen der in der Literatur verbreiteten Ansicht für die Ligand-Rezeptorinteraktion entbehrlich sein, könnten Verbindungen mit höherer Lipophilie und damit optimierter ZNS-Gängigkeit geschaffen werden. Für das L-Etrabamin, einem 2-unsubstituierten Derivat des Pramipexols, wurde bereits 1978 in einem Patent eine dopaminerge Aktivität beschrieben. Entgegen der in der Literatur verbreiteten Auffassung konnten durch Austausch der Aminogruppe gegen verschiedene Substituenten affine Derivate des Pramipexols entwickelt werden. Darüber hinausgehende Veränderungen der Leitstruktur dienten dem Aufbau umfangreicher Struktur-Wirkungsbeziehungen. Die Entwicklung einer konvergenten Synthesestrategie ermöglichte die Darstellung einer größeren Anzahl komplexer zusammengesetzter Etrabaminderivate. Die Umsetzung von Pramipexolderivaten zu den entsprechenden Diazoniumsalzen und anschließende Reduktion mit Hypophosphoriger Säure verbesserte die Verfügbarkeit von Etrabamin und seinen Derivaten gegenüber in der Literatur beschriebenen Synthesen. Das resultierende Etrabaminderivat konnte mit Aldehyden unter Verwendung komplexer Hydride reduktiv alkyliert werden. Die Aldehyde wurden entweder durch Acetalhydrolyse oder durch SWERN-Oxidation von Alkoholen erhalten. ....
Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie
(2010)
Bei chronischen Erkrankungen ist eine regelmäßige Arzneimitteleinnahme eine der Vo-raussetzungen für den Therapieerfolg. Trotzdem nehmen viele Patienten ihre Arzneimit-tel nicht wie vorgeschrieben ein. Dies kann im Rahmen von kardiovaskulären Erkrankun-gen (z. B. Hypertonie) schwerwiegende Folgen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall haben. Es ist bekannt, dass die Therapietreue (Adhärenz bzw. Compliance und Persistenz) bei Hypertonikern nur bei 30 – 55 % liegt. Daher ist es von größter Wichtigkeit, die Therapie-treue und die Gründe für mangelnde Adhärenz zu erfassen, um danach gezielte Interven-tionen zur Verbesserung dieser entwickeln zu können. Allerdings liegen aus Deutschland zu dieser Thematik nur wenige Untersuchungen aus Feldstudien in Apotheken oder Ana-lysen aus Verordnungsdatenbanken vor.
Um die zur Verfügung stehenden Möglichkeiten zur Ermittlung der Therapietreue großflä-chig abzudecken, wurden unterschiedliche Erfassungswege genutzt. Zum einen wurde eine Patientenbefragung in öffentlichen Apotheken zur Erfassung der Adhärenz und Ein-nahmegewohnheiten unter medikamentöser Therapie mit Antihypertensiva durchge-führt. Zum anderen diente die Analyse von Verordnungsdaten der DAPI-Datenbank dazu, die Persistenz und Compliance von Patienten unter antihypertensiver Therapie zu be-stimmen. Als Spezialfall wurde weiterhin betrachtet, ob die Umstellung von einem Origi-nal- auf ein generisches Ramipril-Präparat nach dessen Patentauslauf mit einer vermin-derten Compliance einhergeht.
Die Patientenbefragung wurde sowohl von Patienten wie auch von den 24 teilnehmenden Apotheken gut angenommen. Dies zeigen die Rücklaufquoten der ausgegebenen Frage-bögen (46,8 % für die Befragung per zugesandtem Fragebogen (KF; kurze Form des Frage-bogens) und 32,8 % für das Interview in der Apotheke (LF; lange Form des Fragebogens)) Gemessen anhand des eingesetzten Adhärenz-Scores beschrieben sich 71,9 % der Patien-ten im LF und 58,2 % im KF selbst als adhärent. Der Bedarf für strukturierte, einfach durchführbare Adhärenz-Erfassungsinstrumente für die öffentliche Apotheke wurde sehr deutlich, wie u. a. der Abschlussbericht, welcher von den Apotheken nach Abschluss der Befragung ausgefüllt wurde, zeigte. Demnach hielten die Apotheken die Befragung von Umfang und Verständlichkeit für angemessen. Die Patienten waren bereit, detaillierte
Kapitel V Zusammenfassung V
Dissertation Miriam Ude
Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie 160
Auskünfte über ihre Erkrankung zu geben. Dies zeigten auch die vielen in den Bogen ein-getragenen Anmerkungen seitens der Patienten und Apothekern, in denen individuelle Probleme dokumentiert wurden.
Bei der Analyse von Persistenz und Compliance im Substanzklassenvergleich wurde ein-drücklich gezeigt, dass die Therapietreue unter den First-line-Antihypertensiva (AHT) sub-optimal ist. Patienten unter der Therapie mit β-Blockern (77,3 %) weisen den geringsten non-persistenten Anteil auf, gefolgt von Patienten mit Verordnungen über ACE-Hemmer (78,7 %), AT1-Antagonisten (79,0 %), Calcium-Kanal-Blocker (81,4 %) und Diuretika (83,0 %). Hinsichtlich der Compliance findet sich in der Gruppe der mit AT1-Antagonisten be-handelten Patienten der niedrigste Anteil mit Non-Compliance (52,1 %), gefolgt von ACE-Hemmern (54,1 %), β-Blockern (54,7 %), Calcium-Kanal-Blockern (58,5 %) und Diuretika (63,6 %).
Die primäre Hypothese, dass die Compliance nach Umstellung von einem Ramipril-Original-Präparat nach dessen Patentauslauf auf ein Generikum signifikant abnimmt, konnte nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden für Patienten ermittelt, welche mit Ramipril-Monopräparaten, nur mit Fixkombinationen aus Ramipril mit einem Diuretikum, oder mit beidem (duale Therapie) behandelt wurden.
Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Dissertation untersuchten Projekte zeigen, dass die medikamentöse Therapietreue bei Patienten unter antihypertensiver Therapie in Deutschland verbesserungswürdig ist, und dass die Ermittlung der Adhärenz, Compliance und Persistenz von immenser Wichtigkeit ist. Trotz der unterschiedlichen gewählten An-sätze kongruieren die Ergebnisse sehr gut. Patienten benötigen Unterstützung in der Durchführung ihrer medikamentösen Therapie mit AHT, um gesteckte Therapieziele zu erreichen, welche dazu beitragen können, Morbidität und Mortalität zu verringern bzw. die Lebensqualität zu verbessern. Ein erster Schritt dazu ist das zielgerichtete Erkennen therapiebezogener Probleme. Da es hierfür in Deutschland bisher keine strukturierten Instrumente gibt, welche flächendeckend in den Apothekenalltag implementiert wurden, könnte das neu entwickelte und auf Machbarkeit getestete Befragungsinstrument ein Ansatz sein, die Patienten gezielt und zeitsparend nach ihren Problemen mit der Arznei-mitteleinnahme zu befragen und frühestmöglich intervenieren zu können.
Die Alzheimer-Demenz (AD) ist gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen bestehend aus dem Amyloidbeta-Peptid (Aß), durch neurofibrilläre Bündel bestehend aus dem Tau-Protein, massiven Neuronenverlust und synaptische Dysfunktion. Weiterhin ist bekannt, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der AD spielt. Mit Hilfe von dissoziierten Hirnzellen von NMRI, Thy1-APP-, P301L Tau- und JNK-Knockout-Mäusen wurden Veränderungen, verursacht durch genetisch, alters- und geschlechtsbedingten Risikofaktoren, auf die mitochondriale Funktion untersucht. Die Abeta-Belastung der untersuchten Thy1-APP Mäuse führte zu einer mitochondrialen Fehlfunktion durch intrazelluläres Abeta und damit zu einem Energiedefizit. Aß hemmte die Atmungskette, vor allem die COX-Aktivität, indem es an die COX-Untereinheit bindet und damit die Anlagerung von Cytochrom C verhindert. Eine zusätzliche Mutation wie PS1M146L verursacht eine größere und früher einsetzende Abeta-Akkumulation im Gehirn der Mäuse und führte zu größerer mitochondrialer Schädigung im Vergleich zu den APP transgenen Mäusen. Der Grad der Abeta-Schädigung ist auch von dem Aggregationszustand von Abeta abhängig. Eine Akkumulation von intra- und extrazellulären Oligomeren reicht aus, um das mitochondriale Membranpotential zu erniedrigen. Die Aß-Belastung nimmt im Alter zu und es bilden sich ab dem 6. Monat Amyloid-Plaques im Gehirn der Thy1-APP Mäuse aus, die zu einem veränderten Verhältnis von Bcl-xL und Bax in Richtung Bax führten. Bax und Bcl-2 sind an der Bildung der mitochondrialen Pore beteiligt. Durch die Öffnung der mitochondrialen Pore sinkt das mitochondriale Membranpotential und die ATP-Spiegel. Bax begünstigt zusätzlich die Freisetzung von Cytochrom C und Smac. Der Abfall des mitochondrialen Membranpotentials, die geringen ATP-Spiegel und die Cytochrom C Freisetzung werden mit der Apoptose in Verbindung gebracht und erklären die erhöhte Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber oxidativem Stress. Desweiteren muss die JNK3 berücksichtigt werden. Sie ist der mitochondrialen Fehlfunktion vorgeschaltet und löst eine degenerative Apoptose aus. Abeta und Tau werden bei der Entstehung von AD miteinander in Verbindung gebracht. Dieser Synergismus führt zu einer mitochondrialen Fehlfunktion im Kortex der Mäuse. Aufgrund des unveränderten Transmembranpotentials der dissoziierten Hirnzellen im Gehirn der Thy1APP Mäuse ab dem 6. Monat scheinen nur die aggregierten Polypeptide für die Neurotoxizität bei der AD eine Rolle zu spielen. Die COX-Aktivität wurde im Alter ebenfalls wieder verbessert und stabilisierte dadurch die ATPSpiegel. Die P301L-Taumäuse entwickeln ebenfalls erst im Alter neurofibrilläre Bündel (NFT) durch die Akkumulation von hyperphosphorylierten Tau. Ab dem 2. Lebensjahr der Mäuse wurde ein starker signifikanter Abfall des mitochondrialen Membranpotentials und der ATPSpiegel beobachtet. Der Anstieg der ROS-Spiegel der zwei Jahre alten Mäuse führte direkt zu einer Reduzierung der Komplex-I-Aktivität. Für diese Neurotoxizität scheint die Bildung der NFT verantwortlich zu sein. Die Wirkung von Ginkgo-biloba-Extrakt (EGb 761) und Piracetam auf die mitochondriale Fehlfunktion in jungen und alten NMRI-Mäusen untersucht. Eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials und die Normalisierung der ATP-Spiegel konnte mit Hilfe von EGb 761 und Piracetam festgestellt werden. Besonders bei alten Mäusen konnte die schon angefangene mitochondriale Fehlfunktion fast komplett kompensiert werden. EGb 761 und Piracetam waren in der Lage nach zweiwöchiger Behandlung der APP transgenen Mäusen die löslichen Abeta-Spiegel im Gehirn signifikant zu senken. Durch diese Entlastung wurde die durch Abeta-verursachte Destabilisierung der mitochondrialen Membranen aufgehoben und die Mitochondrien vor oxidativen Schädigungen geschützt. Drei wichtige Angriffspunkte werden aufgrund der Daten für Piracetam vorgeschlagen: 1. die Senkung der Abeta-Spiegel im Gehirn, 2. die Stabilisierung der mitochondrialen Membranen und eine dadurch verbesserte Membranfluidität und 3. die Verbesserung der mitochondrialen Funktion vor altersbedingten Schädigungen. Die drei Punkte sind miteinander verknüpft, aufgrunddessen, dass Abeta die mitochondriale Membranen destabilisiert und dies zu einer mitochondrialen Fehlfunktion führen kann. Die neuroprotektiven Effekte von EGb 761 wurden durch 1. Senkung der Aß-Spiegel, 2. Mitochondrienmembranstabilisierende Wirkungen, 3. antioxidative Effekte, und 4. durch Modulation von Chloridkanälen hervorgerufen. In APP transgenen Mäusen wird trotz gleicher APP Expression in weiblichen Mäuse eine erhöhte Beta-Sekretasespaltung von APP mit verstärkter Bildung von C99 und Abeta (unlösliches und lösliches) im Vergleich zu den männlichen Tieren gebildet. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, dass die erhöhten Abeta-Spiegel und der damit verbundene oxidative Stress in transgenen Mäusen zusätzlich die Mitochondrien der weiblichen Tiere besonders schädigen und die Atmungskette beeinträchtigen. Damit bestätigt sich, dass das Geschlecht ein weiterer Risikofaktor der AD ist. Daher unterstützen die im Rahmen dieser Doktorarbeit erhobenen Befunde grundsätzlich die weitere Erforschung pharmakologischer Ansätze besonders von Ginkgo-biloba-Extrakt und Piracetam zur Verbesserung kognitiver Störungen als Therapie oder auch zur Prophylaxe der Alzheimer Krankheit. Der Schutz von EGb 761 und Piracetam auf die Mitochondrien vor oxidativem Stress kann daher zur Vorbeugung vor allgemeinen Alterungsprozessen dienen. Abeta und Tau spielen zusammen beim Untergang der Neurone eine große Rolle. Therapien, welche die Ablagerungen von Abeta im Gehirn verringern, sollten in einem frühen Stadium der Krankheit besonders wirksam sein. In einem späteren Stadium wären hingegen zusätzlich Medikamente nötig, die gegen die neurofibrilläre Bündel gerichtet sind. Damit ließe sich theoretisch der fortschreitende Zelluntergang bei Alzheimerpatienten zu mindestens verlangsamen.
Ziel dieser Arbeit war es, zentrale Wirkungen von Statinen näher zu untersuchen. Hierbei sollten zum einen die Statin-Effekte auf die zerebrale und membranäre Cholesterinhomöostase näher untersucht werden, zum anderen sollten Effekte von Statinen auf die APP-Prozessierung sowie auf apoptotische Regulatoren im Gehirn in vivo analysiert werden. Einfluss unterschiedlicher Applikationsformen auf zentrale Statin-Effekte Bislang ist noch nicht vollständig aufgeklärt, ob und inwieweit Statine die zerebrale Cholesterin- oder Isoprenoidsynthese beeinflussen. Statine werden in tierexperimentellen in vivo-Studien bei oraler Wirkstoffapplikation über unterschiedliche Applikationsformen verabreicht wie Schlundsondierung, über das Trinkwasser oder das Futter – der Einfluss der unterschiedlichen Applikationsformen auf die zentralen Statineffekte ist allerdings nicht bekannt. Die zerebralen Statinkonzentrationen wurden bislang nur nach Applikation per Schlundsonde im Tiermodell bestimmt. Für alle anderen oralen Applikationsformen liegen keine Konzentrations-Zeit-Profile der zerebralen Statinspiegel vor. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten über einen direkten Vergleich der Applikation von Lovastatin und Pravastatin über das Futter und per Schlundsonde zeigen, dass zentrale Statin-Effekte insbesondere auf membranärer Ebene entscheidend durch die Wahl der Applikationsform beeinflusst werden. Effekte von Simvastatin auf die zerebrale Cholesterinhomöostase – Vergleich Maus – Meerschweinchen In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von Simvastatin auf die zentrale und periphere Cholesterinhomöostase in zwei verschiedenen in vivo-Modellen, Mäusen und Meerschweinchen, untersucht. Sowohl Mäuse wie auch Meerschweinchen stellen etablierte Tiermodelle für Untersuchungen des Cholesterin- und Lipoprotein-Metabolismus dar. Allerdings weisen Meerschweinchen eine grössere Ähnlichkeit zum Menschen im Bezug auf den Lipidstoffwechsel auf als die Maus. Die auffälligste Übereinstimmung zwischen Mensch und Meerschweinchen ist, dass auch bei Meerschweinchen die Mehrheit des Cholesterins in LDL transportiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass insgesamt eine subchronische Simvastatin-Behandlung in Mäusen und Meerschweinchen nicht die gleichen Effekte auf die periphere und zentrale Cholesterinhomöostase hat. Allerdings belegen die Ergebnisse an beiden Tiermodellen, dass generell eine subchronische Simvastatin-Gabe die zerebrale Cholesterinhomöostase nicht negativ beeinflusst. Allerdings werden insbesondere die Serumcholesterinspiegel, die Cholesterinkonzentration in synaptosomalen Plasmamembranen und die DPH-Anisotropie in den beiden Tiermodellen vermutlich aufgrund von Speziesunterschieden im Lipidstoffwechsel in unterschiedlichem Ausmaß beeinflusst, so dass Speziesunterschiede bei der Interpretation tierexperimentellen Statin-Studien immer beachtet werden sollten. Effekte von Simvastatin auf die APP-Prozessierung in vivo Es ist bekannt, dass Statine einen unmittelbaren Einfluss auf die membranäre Cholesterinhomöostase ausüben und dabei vermutlich über eine Veränderung von Raft-Strukturen die APP-Prozessierung modulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt einer subchronischen Simvastatin-Gabe auf die APP-Prozessierung in einem transgenen AD-Mausmodell (APP751SL-Mäuse) untersucht. Durch die Simvastatin-Behandlung wird eine Umverteilung des Cholesterins aus dem cytofacialen Membranblatt ins exofaciale Membranblatt in synaptosomalen Plasmamembranen induziert und die Proteinexpression des Raft-Markers Flotillin wird signifikant reduziert. Diese Veränderungen innerhalb der synaptosomalen Plasmamembranen sind mit einer Zunahme der Spiegel von unlöslichem Abeta im Gehirn der APP751SL-Mäuse assoziiert. Vermutlich war die Cholesterinsenkung in der Membran nicht stark genug, um die an der APP-Prozessierung beteiligten Sekretasen per se zu inaktivieren. Es scheint vielmehr zu einer Dislokalisation der Rafts zu kommen, die über eine räumliche Annäherung von APP und β-Sekretase/γ-Sekretase letztendlich zu einer erhöhten APP-Prozessierung führt. Darüberhinaus ist in unserer Studie eine Abnahme der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Gehirn der Simvastatin behandelten APP751SL-Mäuse nachweisbar sowie eine gleichzeitige Erhöhung der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Plasma. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Clearance von zerebralem löslichem Abeta1-40 ins Blut durch Simvastatin erhöht wurde. Neuroprotektive Effekte von Simvastatin Es gibt vermehrt Hinweise darauf, dass Statine neben ihrer cholesterinsenkenden Wirkung zentrale protektive Effekte im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer Demenz (AD) oder ischämischem Schlaganfall vermitteln. In einer vorangehenden Studie an Mäusen konnten wir zeigen, dass eine subchronische Simvastatin-Gabe eine erhöhte Genexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 induziert. In der vorliegenden Arbeit kann dieser Befund im Gehirn von Meerschweinchen bestätigt werden und darüberhinaus kann nachgewiesen werden, dass Simvastatin eine Reduktion der Proteinexpression des proapoptotischen Proteins Bax im Gehirn der behandelten Meerschweinchen induziert. An dissoziierten Hirnzellen wurde anschließend untersucht, ob die signifikante Reduktion der Ratio Bax/Bcl-2 durch Simvastatin-Gabe im Gehirn von Meerschweinchen auf mitochondrialer Ebene protektiv wirkt gegen oxidativen und nitrosativen Stress sowie gegen den Bcl-2 Antagonisten HA 14-1. An dissoziierten Hirnzellen der behandelten Meerschweinchen wirkt Simvastatin über eine Senkung der Ratio Bax/Bcl-2, nachfolgende Hemmung der Caspase-Aktivierung und eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials protektiv. Diese protektiven Wirkungen von Simvastatin sind im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie der AD und dem ischämischem Schlaganfall von großer Bedeutung, da bei diesen Erkrankungen Apoptose und mitochondriale Dysfunktion eine Schlüsselrolle in neurodegenerativen Prozessen spielt.
Tauopathien sind eine Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen zu denen auch die Alzheimer Demenz zählt, die als gemeinsames pathologisches Merkmal die intrazelluläre Akkumulation von neurofibrillären Bündeln (NFTs) aufweisen. Diese bestehen aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein, das hierdurch seine physiologische Funktion, die Assemblierung von Mikrotubuli zu fördern und diese zu stabilisieren, verliert. Der genaue Mechanismus, der bei diesen Erkrankungen zur Neurodegeneration führt und mit Demenz, Parkinsonismus und motorischen Störungen einhergehen kann, ist bisher weitgehend ungeklärt. Da mitochondriale Dysfunktion bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen eine entscheidende Rolle spielt, wurde in der vorliegenden Arbeit anhand eines Zellmodells zum Einen der Effekt durch die Überexpression von gesundem Wildtyp-Tau (hTau40) und zum Anderen die Auswirkungen der P301L-Mutation, wie sie auch bei der frontotemporalen Demenz mit Parkinsonismus (FTDP-17) auftritt, auf die mitochondriale Morphologie und Funktion untersucht. Die grundlegende Charakterisierung deckte eine weitreichende Einflussnahme von Tau auf den Energiestoffwechsel der Zellen auf. Die Überexpression von Tau führt zu einer verminderten Expression der Komplexe I, II und IV sowie einer veränderten Aktivität der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I-III. Zudem weist die verminderte Aktivität der Citrat-Synthase auf eine Beeinträchtigung des Citratzyklus hin. Der maßgebliche Unterschied zwischen den Tau überexprimierenden Zellen besteht in dem deutlich erniedrigtem Gehalt (NADH:HAR-Aktivität) und der drastisch erniedrigten Aktivität (NADH:DBQ-Aktivität) von Komplex I in den TauP301L-Zellen, wohingegen die hTau40-Zellen trotz eines vermindertem Gehalts im Vergleich zu den Kontroll-Zellen eine deutlich erhöhte Aktivität (DBQ/HAR-Aktivität) aufweisen. Diese gegensätzliche Aktivität von Komplex I führt zu weitreichenden Veränderungen der Zellphysiologie, was sich am deutlichsten in der daraus resultierenden metabolischen Aktivität (NADH-Spiegeln), den ATP-Spiegeln und dem mitochondrialen Membranpotential zeigt. Diese Parameter sind in den hTau40-Zellen aufgrund der hohen Komplex I-Aktivität erhöht und in den TauP301L-Zellen entsprechend erniedrigt. Ebenso spiegeln sich diese funktionellen Parameter in der veränderten Morphologie, Dynamik sowie der Ultrastruktur der Mitochondrien wieder. Die Cristae-Struktur sowie die Dichte der Matrix lassen eindeutige Rückschlüsse auf die aus den unterschiedlichen Komplex I-Aktivitäten resultierenden ATP-Spiegel zu. Weiterhin gibt es in der Literatur Hinweise, dass zum Einen die Transportrichtung der Mitochondrien von der Affinität der Motormoleküle von dem ATP-Gehalt der Mitochondrien abhängig zu sein scheint und zum Anderen, dass die Hemmung von Komplex I zu einem retrograden Transport und perinukleären Morphologie der Mitochondrien führt. Dies konnte ebenfall in den TauP301L-Zellen gezeigt werden. Zusätzlich sind hier die mitochondriale Bewegung sowie die Dynamik (Fusion und Fission) verringert. Interessanterweise spiegeln viele der funktionellen und strukturellen Veränderungen der TauP301L-Zellen den Alterungsprozess wieder, da es im Alter zu einer erhöhten Rate an oxidativen mtDNA-Schäden, einer verminderten Aktivität von Komplex I sowie zu einer verringerten Effektivität und Kapazität der oxidativen Phosphorylierung kommt, die in niedrigeren ATP-Spiegeln resultiert. Anhaltspunkte aus der Literatur bringen auch die morphologischen und dynamischen Veränderungen der Mitochondrien mit dem Alterungsprozess in Verbindung, wodurch das in dieser Arbeit verwendete Zellmodell anscheinend den Alterungsprozess widerspiegelt, der bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen den Hauptrisikofaktor für die Erkrankung darstellt. Die Mutation P301L führt weiterhin dazu, dass die Zellen eine erhöhte Vulnerabilität gegenüber sekundären Insulten aufweisen. Obwohl die Toxizität der einzelnen Stimuli – seien es nun Inhibitoren der einzelnen Atmungskettenkomplexe oder oxidativer sowie nitrosativer Stress – sich unterschiedlich auf die gemessenen physiologischen Parameter der Zellen auswirkte, so zeigt sich durchgängig bei den TauP301L-Zellen ein stärkerer Abfall der metabolischen Aktivität und der ATP-Spiegel. Zudem führte die Überexpression von hTau40 zu einer geringeren Vulnerabilität gegenüber den sekundären Insulten. Trotz der geringen Auswirkungen von oligomerem und fibrillärem Aß1-42 auf die mitochondriale Funktion der SH-SY5Y Zellen kann nicht ausgeschlossen werden, dass in vivo nicht doch ein Teufelskreislauf besteht, sodass sich die Toxizität von Aß und Tau potenziert. Insgesamt machen die Ergebnisse dieser Arbeit deutlich, dass mitochondriale Dysfunktion auch bei Tauopathien eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielt und sich hierdurch neue Aspekte zur therapeutischen Intervention ergeben.
Substanzen, die den intrazellulären pH-Wert beeinflussen, verändern den proteolytischen Abbau des Amyloidvorläuferproteins (APP) teilweise so, dass weniger Beta-Amyloid (A-Beta) entsteht. A-Beta ist nach heutigen Vorstellungen als Hauptbestandteil der senilen Plaques kausal in die Pathogenese der Alzheimer´schen Erkrankung involviert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war zu überprüfen, ob Hyperforin, ein wichtiger Inhaltsstoff des Johanniskrauts, in der Lage ist, in die APP-Prozessierung einzugreifen und eine Verschiebung der proteolytischen Spaltung von APP, die das Entstehen der senilen Plaques möglicherweise verringert, auszulösen, da bekannt war, dass Hyperforin den intrazellulären pH-Wert in Thrombozyten verändert. Für die Arbeit wurden untransfizierte und stabil transfizierte PC12 und HEK Zellen, zwei in der Alzheimer-Forschung geläufige Zell-Modelle, verwendet. Die Zellen waren entweder mit menschlichem wild-typ APP (APPwt) oder mit APP, das die schwedische Mutation beinhaltet (APPsw), eine Alzheimer-relevante Mutation, die einen frühzeitigen Erkrankungsbeginn zur Folge hat, stabil transfiziert. Um die Relevanz möglicher Hyperforin-Effekte abschätzen zu können, wurden PMA (Phorbolester, bekannter Alpha-Sekretase-Aktivator), Bafilomycin A1 (V-ATPase-Hemmer) und FCCP (Protonophor), für die eine Beeinflussung der APP-Prozessierung bekannt ist, zum Vergleich mit untersucht. Als erstes wurden an den verwendeten Zell-Linien die intrazellulären pH-Wert-Veränderungen durch Hyperforin, FCCP und Bafilomycin A1 gemessen und miteinander verglichen, wobei Hyperforin und FCCP den intrazellulären pH-Wert in gleichen Konzentrationsbereichen ähnlich schnell und stark reduzierten, während Bafilomycin A1 den intrazellulären pH-Wert kaum beeinflusste. Es konnte kein Einfluss von Transfektion und Mutation auf die Empfindlichkeit der intrazellulären pH-Wert-Verschiebung gefunden werden. Mögliche zelltoxische Eigenschaften von Hyperforin, PMA, FCCP und Bafilomycin A1 wurden überprüft, wobei auch ein Einfluss von Hyperforin und FCCP auf die Mitochondrien getestet wurde. Die Quantifizierung möglicher zytotoxischer Eigenschaften der Substanzen mittels MTT- und LDH-Tests ergaben, dass alle Ergebnisse bis zu einer Inkubationsdauer von 2 Stunden nicht auf eine Bioaktivitätsstörungen der Zellen zurückzuführen sind. Auch wenn Hyperforin, ähnlich wie FCCP, die Mitochondrien depolarisierte. Als nächstes wurde der mögliche Einfluss von Hyperforin auf die proteolytische Prozessierung von APP untersucht. Von Interesse war, ob ein Zusammenhang zwischen einer intrazellulären pH-Wert-Beeinflussung und einer veränderten proteolytischen Spaltung von APP durch Hyperforin besteht. Hyperforin zeigte einen deutlichen Einfluss auf die APP-Prozessierung, es erhöhte konzentrationsabhängig die Alpha-Sekretase-Spaltung, die Spaltung, die die Bildung des Alzheimer-relevanten A-Beta-Peptides verhindert. Da kein sAPP-Beta-spezifischer AK zur Verfügung stand, kann zu diesem Zeitpunkt nicht ausgeschlossen werden, dass auch die Beta-Sekretase-Spaltung durch Hyperforin beeinflusst wurde. Da die in dieser Arbeit verwendeten PC12 Zell-Linien nicht die abnorme hohe APP-Überproduktion wie andere Zell-Linien zeigen, war die Menge des in der kurzen Behandlungsdauer von 2-4 Stunden gebildeten A-Beta zu gering, um im ELISA erfasst zu werden. Die Tatsache, dass A-Beta unter den gegebenen Versuchsbedingungen durch ELISA nicht nachweisbar war, lässt eine stark erhöhte A-Beta-Produktion durch Hyperforin jedoch unwahrscheinlich erscheinen. Dadurch ist zum jetzigen Zeitpunkt auch der Einfluss der sw-Mutation auf die Hyperforin-Effekte noch unklar. Die Tatsache, dass Alpha- und Beta-Sekretasen in verschiedenen Kompartimenten aktiv sind und über verschiedenen Mechanismen aktiviert werden (vgl. Abschnitte 1.2.1.1 und 1.2.1.2), dass die Alpha-Sekretase-Spaltung bereits 90% der APP-Spaltung ausmacht und diese durch Hyperforin noch gesteigert wurde, wobei gleichzeitig intrazelluläres APP erniedrigt wurde (so dass die vermehrte Spaltung nicht auf ein erhöhtes Substratangebot zurückgeführt werden kann), lässt aber eine gleichzeitige Aktivierung von Alpha- und Beta-Sekretase unwahrscheinlich erscheinen. Vergleichende Untersuchungen mit FCCP und Bafilomycin A1 ergaben, dass für die Verschiebung der proteolytischen Prozessierung von APP weder die intrazelluläre pH-Wert-Erniedrigung, noch ein möglicher Einfluss auf Endosomen und Lysosomen, als Hauptursache in Frage kommt. Ein Vergleich mit PMA, das die Alpha-Sekretase durch eine direkte PKC-Aktivierung stimuliert, zeigte, dass Hyperforin auch keinen Phorbolester-ähnlichen Wirkungsmechanismus haben kann. Allerdings sieht es nach einigen Vorversuchen (SK&F, BAPTA/AM, Staurosporin, PKC-down Regulation Versuchen) so aus, als ob durch Hyperforin erhöhtes intrazelluläres Kalzium und/oder aktivierte PKC-Isoenzyme bei der Spaltung des intrazellulären APP und damit bei der Erhöhung der löslichen Spaltprodukte involviert ist/sind. Kalzium kann auch unabhängig von PKC die Alpha-Sekretase aktivieren (Buxbaum et al., 1994). Es aktiviert ERKs (Luo et al., 1997; Rosen et al., 1994; Rusanesco et al., 1995; Zhu et al., 2002), wobei aktivierte ERKs in der Lage sind, die Alpha-Sekretase zu stimulieren (Mills et al., 1997). Auch FCCP erhöht intrazelluläres Kalzium (Friel and Tsien, 1994; Luo et al., 1997; Park et al., 2002; Jensen and Rehder, 1991), wodurch es in PC12 Zellen zu einer Aktivierung von ERK1 und 2 kommen kann (Luo et al., 1997). Es muss aber bedacht werden, dass Hyperforin und FCCP unterschiedlich starke Effekte auf intrazelluläres APP und sAPP zeigten, so dass auch Mechanismen in Betracht gezogen werden müssen, bei denen Hyperforin anders als FCCP agiert. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Beeinflussung der Membranfluidität durch Hyperforin (Eckert and Müller, 2001) einen Einfluss auf die APP-Spaltung hat, da Veränderungen des Membrancholesterol-Gehaltes den Gehalt an sAPP und ABeta ändern, z.B. erniedrigt ein erhöhter Membran-Cholesterol-Gehalt sAPPAlpha (Bodovitz und Klein 1996, Racchi et al., 1998) und erhöht ABeta (Gouras et al., 2000). Eine Behandlung von Zellen, die zu einer Verringerung von intrazellulärem Cholesterol führt (Statine bzw. Cyclodextrin), reduziert die Spaltung von APP zu ABeta und erhöht sAPPAlpha (Fassbender et al., 2001; Kojro et al., 2001; Refolo et al., 2001).