Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Molekulargenetische Optimierung der Sphingoidbasen-Produktion der nicht-konventionellen Hefe Pichia ciferrii
(2012)
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Christoph Schorsch
- Die nicht-konventionelle Hefe P. ciferrii produziert große Mengen der tetra-acetylierten Sphingoidbase Phytosphingosin (TAPS). Sphingoidbasen sind essentielle Komponenten des stratum corneums, der multilamellaren Barriere der menschlichen Haut, und daher in der Kosmetik-Industrie von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die biotechnologische Produktion der Sphingoidbasen Phytosphingosin, Sphinganin und Sphingosin auf molekularbiologischer Ebene in P. ciferrii charakterisiert und optimiert werden. Die Hefe P. ciferrii konnte durch Etablierung einer einfachen und hoch-effizienten Transformations-Methode auf genetischer Ebene leicht zugänglich gemacht werden. Durch Inaktivierung des für NHEJ essentiellen PcLIG4 Gens konnte die Effizienz zielgerichteter genomischer Integrationen von transformierten DNA-Konstrukten von 1 % auf 87 % erhöht werden. Die Etablierung des Cre-loxP Systems erlaubte das mehrfache Verwenden eines Selektions-Markers wodurch sukzessiv mehrere genomische Integrationen in einem Stamm ermöglicht wurden. Durch diese Errungenschaften konnte das Ziel „Optimierung der Sphingoidbasen-Produktion der nicht-konventionellen Hefe P. ciferrii“ im Folgenden erfolgreich verfolgt werden. Der initiale Schritt der Sphingoidbasen-Biosynthese ist die von der Serin-Palmitoyl-Transferase katalysierte Kondensation von L-Serin und Palmitoyl-CoA. Durch die Deletion von Genen, die am L-Serin-Katabolismus von P. ciferrii beteiligt sind (PcSHM1, PcSHM2und PcCHA1), konnte die de novo Sphingoidbasen-Biosynthese optimiert werden und führte in einem lig4? Stamm zu einer etwa dreifachen Erhöhung der TAPS-Produktion. Weitere Ansätze den (vermutlich durch L-Serin feed back regulierten) L-Serin-Biosyntheseweg bzw. die in vivo L-Serin-Verfügbarkeit zu optimieren, führten nicht zu einer gesteigerten TAPS-Produktion. Durch weitere Deletion und Überexpression von Genen des Sphingolipid-Stoffwechsels konnte die TAPS-Produktion jedoch um ein Vielfaches verbessert werden. So konnte ein Stamm konstruiert werden, der die Gene PcLCB1, PcLCB2 und PcSYR2 überexprimiert und Deletionen der Gene PcSHM1, PcSHM2, PcCHA1, PcLCB4 und PcORM12 trägt. Dieser Stamm (CSS.L4.O.L2.L1.S2) wies eine mehr als fünffach erhöhte maximale spezifische TAPS-Produktbildungsrate (q Pmax ) auf und produzierte mit 2 g * L rund siebenmal mehr TAPS als der lig4? Ausgangsstamm, weshalb ein Einsatz dieses Stammes für die industrielle TAPS-Produktion denkbar wäre. Ausgehend von einem für die TAPS- (und somit Sphingoidbasen-) Produktion optimierten Stamm sollten Stämme mit optimierter TriASa- oder TriASo-Produktion für industrielle Zwecke generiert werden. Es stellte sich allerding heraus, dass erhöhte Mengen dieser Sphingoidbasen wahrscheinlich wachstumshemmend für P. ciferrii sind, weshalb eine weitere Produktions-Optimierung nicht ohne Weiteres möglich ist. In einem Laborstamm gelang es jedoch, durch Konstruktion und anschließende Transformation eines optimierten integrativen Plasmids (trägt die Gene, die für die Produktion von Sphingosin bzw. TriASo nötig sind) eine TriASo-Produktion von bis zu 30 mg * g (BTM) zu erzielen, wobei gleichzeitig die Bildung des Nebenprodukts TriASa auf weniger als 4 mg * g (BTM)reduziert wurde. Weiterhin konnte durch Deletion von PcSCS7 in einem TriASo-Produktionsstamm die TriASa-Produktion mehr als vierfach reduziert werden. Die Bildung eines weiteren von P. ciferrii gebildeten Nebenproduktes [Tri-Acetyl-Sphingadienin (TriASd)] konnte durch Deletion des PcSLD1 Gens unterbunden werden. Nach Inaktivierung von PcSCH9 konnte eine fast 20 %ige Verbesserung der TriASo-Produktion erreicht werden. Es konnten zwei putative Acetyl-Transferasen identifiziert werden (PcAft2 und PcSli1), die an der Acetylierung von Phytosphingosin (zu TAPS), Sphinganin (zu TriASa) und Sphingosin (zu TriASo) beteiligt sind. Die Aufklärung und Optimierung dieser von PcAtf2 und PcSli1 katalysierten Schritte sind vielversprechende Ansatzpunkte die Sphingoidbasen-Produktion in P. ciferrii weiter zu optimieren.
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NMR-spektroskopische Methodenentwicklung an RNA und strukturelle Charakterisierung des transkriptionellen Adenin-RNA-Schalters
(2012)
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Senada Nozinovic
- Die Untersuchung von RNA mittels NMR-Spektroskopie hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, weil die Zahl der neu entdeckten RNA-Funktionen, wie z.B. RNA-Schalter in Bakterien, stark gestiegen ist. Ziel dieser Arbeit war es, mithilfe der NMR-Spektroskopie einen Beitrag zum besseren Verständnis der biochemischen Prozesse, in die RNA-Moleküle involviert sein können, zu leisten.
Im ersten Teil dieser Arbeit (Kapitel 2, 3 und 4) werden zum einen die Entwicklung neuer Methoden für die RNA-Strukturbestimmung vorgestellt und zum anderen die Leistungsfähigkeit der modernen NMR-spektroskopischen Strukturaufklärung demonstriert.
Im zweiten Teil dieser Arbeit (Kapitel 5) wird die NMR-Spektroskopie zur Untersuchung der RNA-Schalter-Funktion eingesetzt. Die biologische Funktion von RNA oder Proteinen setzt oftmals eine dynamische Struktur voraus und involviert Konformationsänderungen infolge biochemischer Signalweiterleitung. Für die Charakterisierung solcher Prozesse eignet sich die NMR-Spektroskopie insbesondere gut, weil sie in Lösung unter verschiedenen Reaktionsbedingungen angewandt wer-den kann. Durch den direkten NMR-spektroskopischen Nachweis von Basenpaarungen können wichtige strukturelle Eigenschaften (Faltung, Strukturhomogenität und Dynamik) entschlüsselt und in einen Zusammenhang mit der Funktion gebracht werden.
Im Folgenden werden die einzelnen Kapitel vorgestellt.
Nachdem das erste Kapitel eine allgemeine Einleitung in die NMR-Spektroskopie, RNA-Struktur und Funktion der RNA-Schalter darstellt, folgt im Kapitel 2 die Einführung einer neuen Methode, die eine quantitative Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta in RNA/DNA mittels NMR-Spektroskopie ermöglicht (Abb. 1). Sie basiert auf der Wechselwirkung zwischen dem CH-Dipol und der 31P-CSA, die von der relativen Orientierung abhängig ist. Die Methode wurde für die CH- und CH2-Gruppen in Form von zwei Pulssequenzen (2D- und 3D-G-HCP) zur Messung von insgesamt fünf kreuz-korrelierten Relaxationsraten entlang des RNA/DNA-Rückgrats optimiert. Die Funktionsfähigkeit der Methode wurde zunächst an der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA getestet und zur Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta genutzt. Die Ergebnisse flossen in die Strukturrechnung der 14mer RNA, die im Kapitel 3 vorgestellt wird, mit ein. Des Weiteren gelang es die Anwendbarkeit der Experimente an einer größeren 27mer RNA zu demonstrieren. Die neue Methode ist deswegen von Bedeutung, weil die Winkel alpha und zeta nicht über 3J-Kopplungskonstanten gemessen werden können.
(Nozinovic, S., Richter, C., Rinnenthal, J., Fürtig, B., Duchardt-Ferner, E., Weigand, J. E., Schwalbe, H. (2010), J. Am. Chem. Soc. 132, 10318-10329.)
Im Kapitel 3 wird die NMR-spektroskopische Bestimmung der Struktur einer Model-RNA, der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA, vorgestellt. Die Strukturrechung wurde mit verschiedenen NMR-Datensätzen, die in der Arbeitsgruppe einschließlich dieser Doktorarbeit gesammelt wurden, durchgeführt. Zusammen mit den Ergebnissen aus dem Kapitel 2 konnte eine sehr präzise Struktur mit einem RMSD von 0,37 Å (20 Strukturen) in sehr guter Übereinstimmung mit experimentellen Daten ermittelt werden. Die gerechnete Struktur repräsentiert eine der gegenwärtig genauesten und umfassendsten Strukturbestimmungen einer RNA, bei der jeder Torsionswinkel quantitativ bestimmt wurde. Einen besonderen Höhepunkt stellt die strukturelle Analyse der 2’OH-Gruppen dar, die im anschließenden Kapitel 4 weiter vertieft wurde.
(Nozinovic, S., Fürtig, B., Jonker, H. R. A., Richter, C., Schwalbe, H. (2010), Nucleic Acids Res. 38, 683-694)
Über Jahre war bekannt, dass die Größe der 1J(C1’,H1’)- und 1J(C2’,H2’)-Kopplungskonstanten innerhalb der Ribonukleotide von der lokalen Struktur des Zuckers und der Orientierung der Nukleobase beeinflusst wird. In dieser Arbeit (Kapitel 4) wurde zum ersten Mal ein systematischer Vergleich zwischen NMR-Messungen und DFT-Rechnungen durchgeführt, der eine eindeutige Zuordnung der Hauptkonformationen des Zuckers (C3’- oder C2’-endo) und der Nukleobase (anti oder syn) anhand der 1J(C,H)-Kopplungskonstanten erlaubt. Die beschriebene Methode wurde an einer größeren 27mer RNA erfolgreich erprobt. Weiterhin wurde erstmalig entdeckt, dass zudem die Orientierung der 2’OH-Gruppe einen signifikanten Einfluss auf die 1J(C,H)-Kopplungen hat (Abb. 3). Mithilfe von NMR-Messungen und DFT-Rechnungen konnte aus 1J(C,H)-Kopplungskonstanten die Orientierung von allen 2’OH-Gruppen in der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA bestimmt werden. Die Methode hat den großen Vorteil, dass 2’OH-Gruppen, die aufgrund des schnellen Austauschs mit Wasser oder D2O keine NMR-Signale liefern, analysiert werden kön-nen.
(Nozinovic, S., Gupta, P., Fürtig, B., Richter, C., Tüllmann, S., Duchardt-Ferner, E., Holthausen, M. C., Schwalbe, H. (2011), Angew. Chem. Int. Ed. 50, 5397-5400)
Im Kapitel 5 wird eine NMR-spektroskopische Untersuchung an der Aptamerdomäne des Adenin-bindenden RNA-Schalters (pbuE) vorgestellt. Im Fokus der Forschung stand die Frage: Welchen Einfluss hat die Länge der P1-Helix auf die Struktur und die Ligandbindung der freien Aptamer-domäne?
Durch den Vergleich von zwei Konstrukten mit unterschiedlich langer P1-Helix war es möglich, intrinsische Scherkräfte, die durch die Ausbildung der P1-Helix in der freien Aptamerdomäne entstehen, festzustellen. Es hat sich im Konstrukt mit der verlängerten P1-Helix gezeigt, dass diese zur Destabilisierung der P3-Helix und des Schlaufenkontakts führen. Diese strukturellen Änderungen haben außerdem zur Folge, dass die Bindungsstärke des Liganden reduziert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass ein strukturelles Gleichgewicht zwischen Sekundärstrukturelementen die tertiäre Faltung beeinflusst und die Funktion moduliert.
(Nozinovic, S., Reining, A., Noeske, J., Wöhnert, J., Schwalbe, H. (2011), in Vorbereitung)
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Gravierende Veränderungen in der submersen Makrophytenvegetation der Alten Fahrt bei Senden in Westfalen
(1997)
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Rüdiger Wittig
- Die Makrophytenvegetation eines stillgelegten Kanalabschnittes ("Alte Fahrt") bei Senden in Westfalen hat sich seit Beginn der 90er Jahre drastisch verändert. Aus einem typischen
Potamogetonetum lucentis sind Reinbestände von Myriophyllum spicatum geworden, denen stellenweise
Ceratophyllum demersum beigemischt ist. Die Ursachen für diese gravierenden Vegetationsveränderungen
sind nicht klar. Da es sich um einen der bedeutendsten westfälischen Standorte des Potamogetonetum lucentis, einer in Nordrhein-Westfalen stark gefährdeten Pflanzengesellschaft, handelte, sind weiterführende Untersuchungen und Versuche zur Wiederansiedlung zu fordern.
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Structural analysis of SHARPIN, a subunit of a large multi-protein E3 ubiquitin ligase, reveals a novel dimerization function for the pleckstrin homology superfold
(2012)
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Benjamin Stieglitz
Lesley F. Haire
Ivan Dikic
Katrin Rittinger
- SHARPIN (SHANK-associated RH domain interacting protein) is part of a large multi-protein E3 ubiquitin ligase complex called LUBAC (linear ubiquitin chain assembly complex), which catalyzes the formation of linear ubiquitin chains and regulates immune and apoptopic signaling pathways. The C-terminal half of SHARPIN contains ubiquitin-like domain and Npl4-zinc finger domains that mediate the interaction with the LUBAC subunit HOIP and ubiquitin, respectively. In contrast, the N-terminal region does not show any homology with known protein interaction domains but has been suggested to be responsible for self-association of SHARPIN, presumably via a coiled-coil region. We have determined the crystal structure of the N-terminal portion of SHARPIN, which adopts the highly conserved pleckstrin homology superfold that is often used as a scaffold to create protein interaction modules. We show that in SHARPIN, this domain does not appear to be used as a ligand recognition domain because it lacks many of the surface properties that are present in other pleckstrin homology fold-based interaction modules. Instead, it acts as a dimerization module extending the functional applications of this superfold.
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Nephronectin regulates atrioventricular canal differentiation via Bmp4-Has2 signaling in zebrafish
(2011)
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Chinmoy Patra
Florian Diehl
Fulvia Ferrazzi
Machteld J. van Amerongen
Tatyana Novoyatleva
Liliana Schäfer
Christian Mühlfeld
Benno Jungblut
Felix B. Engel
- The extracellular matrix is crucial for organogenesis. It is a complex and dynamic component that regulates cell behavior by modulating the activity, bioavailability and presentation of growth factors to cell surface receptors. Here, we determined the role of the extracellular matrix protein Nephronectin (Npnt) in heart development using the zebrafish model system. The vertebrate heart is formed as a linear tube in which myocardium and endocardium are separated by a layer of extracellular matrix termed the cardiac jelly. During heart development, the cardiac jelly swells at the atrioventricular (AV) canal, which precedes valve formation. Here, we show that Npnt expression correlates with this process. Morpholino-mediated knockdown of Npnt prevents proper valve leaflet formation and trabeculation and results in greater than 85% lethality at 7 days post-fertilization. The earliest observed phenotype is an extended tube-like structure at the AV boundary. In addition, the expression of myocardial genes involved in cardiac valve formation (cspg2, fibulin 1, tbx2b, bmp4) is expanded and endocardial cells along the extended tube-like structure exhibit characteristics of AV cells (has2, notch1b and Alcam expression, cuboidal cell shape). Inhibition of has2 in npnt morphants rescues the endocardial, but not the myocardial, expansion. By contrast, reduction of BMP signaling in npnt morphants reduces the ectopic expression of myocardial and endocardial AV markers. Taken together, our results identify Npnt as a novel upstream regulator of Bmp4-Has2 signaling that plays a crucial role in AV canal differentiation.
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Modelling the impact of future climate and land use change on vegetation patterns, plant diversity and provisioning ecosystem services in West Africa
(2012)
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Jonathan Heubes
- Global climate change and land use change will not only alter entire ecosystems and
biodiversity patterns, but also the supply of ecosystem services. A better understanding
of the consequences is particularly needed in under-investigated regions, such as West
Africa. The projected environmental changes suggest negative impacts on nature, thus
representing a threat to the human well-being. However, many effects caused by climate
and land use change are poorly understood so far.
Thus, the main objective of this thesis was to investigate the impact of climate and
land use change on vegetation patterns, plant diversity and important provisioning
ecosystem services in West Africa. The three different aspects are separately explored
and build the chapters of this thesis. The findings help to improve our understanding of
the effects of environmental change on ecosystems and human well-being.
In the first study, the main objectives were to model trends and the extent of
future biome shifts in West Africa that may occur by 2050. Also, I modelled a trend in
West African tree cover change, while accounting for human impact. Additionally,
uncertainty in future climate projections was evaluated to identify regions with reliable
trends and regions where the impacts remain uncertain. The potential future spatial
distributions of desert, grassland, savanna, deciduous and evergreen forest were
modelled in West Africa, using six bioclimatic models. Future tree cover change was
analysed with generalized additive models (GAMs). I used climate data from 17 general
circulation models (GCMs) and included human population density and fire intensity to
model tree cover. Consensus projections were derived via weighted averages to: 1)
reduce inter-model variability, and 2) describe trends extracted from different GCM
projections. The strongest predicted effect of climate change was on desert and
grasslands, where the bioclimatic envelope of grassland is projected to expand into the
Sahara desert by an area of 2 million km2. While savannas are predicted to contract in the
south (by 54 ± 22 × 104 km2), deciduous and evergreen forest biomes are expected to
expand (64 ± 13 × 104 km2 and 77 ± 26 × 104 km2). However, uncertainty due to different
GCMs was particularly high for the grassland and the evergreen forest biome shift.
Increasing tree cover (1–10%) was projected for large parts of Benin, Burkina Faso, Côte d’Ivoire, Ghana and Togo, but a decrease was projected for coastal areas (1–20%).
Furthermore, human impact negatively affected tree cover and partly changed the
direction of the projected climate-driven tendency from increase to decrease.
Considering climate change alone, the model results of potential vegetation (biomes)
showed a ‘greening’ trend by 2050. However, the modelled effects of human impact
suggest future forest degradation. Thus, it is essential to consider both climate change
and human impact in order to generate realistic future projections on woody cover.
The second study focused on the impact and the interplay of future (2050) climate
and land use change on the plant diversity of the West African country Burkina Faso.
Synergistic forecasts for this country are lacking to date. Burkina Faso covers a broad
bioclimatic gradient which causes a similar gradient in plant diversity. Thus, the impact of
climate and land use change can be investigated in regions with different levels of species
richness. The LandSHIFT model from the Centre of Environmental System research CESR
(Kassel, Germany) was adapted for this study to derive novel regional, spatially explicit
future (2050) land use simulations for Burkina Faso. Additionally, the simulations include
different assumptions on the technological developments in the agricultural sector. Oneclass
support vector machines (SVMs), a machine learning method, were performed with
these land use simulations together with current and future (2050) climate projections at
a 0.1° resolution (cell: ~ 10 × 10 km). The modelling results showed that the flora of
Burkina Faso will be primarily negatively impacted by future climate and land use
changes. The species richness will be significantly reduced by 2050 (P < 0.001, paired
Wilcoxon signed-rank test). However, contrasting latitudinal patterns were found.
Although climate change is predicted to cause species loss in the more humid regions in
Southern Burkina Faso (~ 200 species per cell), the model projects an increase of species
richness in the Sahel. However, land use change is expected to suppress this increase to
the current species diversity level, depending on the technological developments. Climate
change is a more important threat to the plant diversity than land use change under the
assumption of technological stagnation in the agricultural sector.
Overall, the study highlights the impact and interplay of future climate and land
use change on plant diversity along a broad bioclimatic gradient in West Africa.
Furthermore, the results suggest that plant diversity in dry and humid regions of the tropics might generally respond differently to climate and land use change. This pattern
has not been detected by global studies so far.
Several of the plant species in West Africa significantly contribute to the
livelihoods of the population. The plants provide so-called non-timber forest products
(NTFPs), which are important provisioning ecosystem services. However, these services
are also threatened by environmental change. Thus, the third study aimed at developing a
novel approach to assess the impacts of climate and land use change on the economic
benefits derived from NTFPs. This project was carried out in cooperation with Katja
Heubach (BiK-F) who provided data on household economics. These data include 60
interviews that were conducted in Northern Benin on annual quantities and revenues of
collected NTFPs from the three most important savanna tree species: Adansonia digitata,
Parkia biglobosa and Vitellaria paradoxa. The current market prices of the NTFPs were
derived from respective local markets. To assess current and future (2050) occurrence
probabilities of the three species, I calibrated niche-based models with climate data (from
Miroc3.2medres) and land use data (LandSHIFT) at a 0.1° resolution (cell: ~ 10 × 10 km).
Land use simulations were taken from the previous study on plant diversity. Three
different niche-based models were used: 1) generalized additive models (regression
method), 2) generalized boosting models (machine learning method), and 3) flexible
discriminant analysis (classification method). The three model simulations were averaged
(ensemble forecasting) to increase the robustness of the predictions. To assess future
economic gains and losses, respectively, the modelled species’ occurrence probabilities
were linked with the spatially assigned monetary values. Highest current annual benefits
are obtained from V. paradoxa (54,111 ± 28,126 US$/cell), followed by P. biglobosa
(32,246 ± 16,526 US$/cell) and A. digitata (9,514 ± 6,243 US$/cell). However, in the
prediction large areas will lose up to 50% of their current economic value by 2050.
Vitellaria paradoxa and Parkia biglobosa, which currently reveal the highest economic
benefits, are heavily affected. Adansonia digitata is negatively affected less strongly by
environmental change and might regionally even supply increasing economic benefits, in
particular in the west and east of the investigation area. We conclude that adaptive
strategies are needed to create alternative income opportunities, in particular for women
that are responsible for collecting the NTFPs. The findings provide a benchmark for local policy-makers to economically compare different land use options and adjust existing
management strategies for the near future.
Overall, this thesis improves our understanding of the impacts of climate and land
use changes on West African vegetation patterns, plant diversity and provisioning
ecosystem services. Climate change had spatially varying impacts (positive and negative
effects) on the vegetation cover and plant diversity, while predominantly negative effects
resulted from human pressure. Regional contrasting impacts of environmental change
were also found considering the provisioning ecosystem services.
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Optical mapping as a routine tool for bacterial genome sequence finishing
(2007)
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Phil Latreille
Stacie Norton
Barry S. Goldman
John Henkhaus
Nancy Miller
Brad Barbazuk
Helge Björn Bode
Creg Darby
Zijin Du
Steve Forst
Sophie Gaudriault
Brad Goodner
Heidi Goodrich-Blair
Steven Slater
- Background: In sequencing the genomes of two Xenorhabdus species, we encountered a large number of sequence repeats and assembly anomalies that stalled finishing efforts. This included a stretch of about 12 Kb that is over 99.9% identical between the plasmid and chromosome of X. nematophila.
Results: Whole genome restriction maps of the sequenced strains were produced through optical mapping technology. These maps allowed rapid resolution of sequence assembly problems, permitted closing of the genome, and allowed correction of a large inversion in a genome assembly that we had considered finished.
Conclusion: Our experience suggests that routine use of optical mapping in bacterial genome sequence finishing is warranted. When combined with data produced through 454 sequencing, an optical map can rapidly and inexpensively generate an ordered and oriented set of contigs to produce a nearly complete genome sequence assembly.
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Methoden zur Konformationsbestimmung an Peptiden und Nukleinsäuren mittels skalarer und dipolarer Kopplungen
(2012)
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Daniel Mathieu
- Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen an GXG Modellpeptiden konnten eindeutig zeigen, dass diese Peptide, auch ohne das Vorhandensein von langreichweitigen Wechselwirkungen, bestimmte Sekundärstrukturen präferieren. Ein Teil der beobachteten, auftretenden Strukturmotive lässt sich hierbei über den sterischen Anspruch der Seitenkette erklären, ein anderer Teil über die Ladung der Seitenkette. In Kombination mit anderen Spektroskopischen Methoden konnten zehn dieser Peptide genauestens untersucht werden. Hierbei zeigte sich, dass diese Peptide nicht nur die favorisierten Regionen des Ramachandran-Diagramms besetzen. Ein Vergleich mit dem Vorkommen bestimmter Aminosäuren, beispielsweise in loop Regionen von Proteinen, zeigt dass die Sequenz dieser loops nicht zufällig ist. Tatsächlich besitzt ein Teil der Aminosäuren, die besonders häufig an bestimmten loop Positionen vorkommen, bereits die intrinsische Vorliebe, die notwendige Konformation einzunehmen. Diese Aminosäuren und die umgebenden loops sind somit eventuell nicht nur das simple Verbindungsglied zwischen zwei Sekundärstrukturen, sondern kommen selbst als Ausgangspunkte für Peptid- bzw. Proteinfaltung in Frage.
Ein weiteres Augenmerk der Arbeit lag auf der Messung von skalaren und dipolaren Kopplungen an isotopenmarkierter RNA. Es wurden vier Pulssequenzen entwickelt, die es ermöglichen, 1J skalare bzw. dipolare Kopplungen in der Zuckerregion von 13C- markierter RNA mit hoher Präzision zu messen. Die entwickelten J-modulierten Experimente ermöglichen die Messung von 1J(H2’C2’), 1J(C1’C2’) sowie 1J(C2’C3’) Kopplungen selbst für größere RNA Moleküle. Die Detektion erfolgt hierbei auf den C1’H1’ Signalen, die Zuordnung der Kerne, deren Kopplung gemessen wird, ist nicht einmal erforderlich. Die Anwendbarkeit konnte für verschiedene Systeme mit 14 bis 70 Nukleotiden demonstriert werden. Die erreichte Präzision ermöglichte es außerdem auch sehr kleine Effekte, wie beispielsweise die Ausrichtung von RNA im Magnetfeld zu detektieren.
Diese Arbeit zeigt außerdem zwei Beispiele für die gezielte Modifikation, um Lanthanid Bindungsstellen einführen zu können. Auf chemischen und biochemischen Weg konnte isotopenmarkierte, in vitro transkribierte RNA modifiziert werden. Die Ergebnisse zeigen eindeutig eine Bindung von Lanthanid-Ionen an die modifizierte RNA. Die auftretenden, eher kleinen Effekte, sind vermutlich auf die noch zu hohe Flexibilität der eingeführten Modifikationen. Vor allem bei der chemischen Modifikation besteht hier noch Potential zur Optimierung, nachdem die generelle Anwendbarkeit der Methode demonstriert wurde.
Der letzte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse von Kopplungsmustern zur Analyse und zum Vergleichen von Naturstoffen. Hier konnten aus einer Reihe von Derivaten eindeutig die identifiziert werden, die verglichen mit der Ausgangsstruktur, die gleiche Konformation besitzen. Die gewonnenen Ergebnisse decken sich hier mit durchgeführten biologischen Tests, die ebenfalls dasselbe Derivat als aktiv identifizieren konnten, was klar für eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung spricht.
In der vorliegenden Arbeit werden Methoden und Anwendungen gezeigt, um skalare und dipolare Kopplungen im Bereich von Peptiden, Nukleinsäuren und kleinen Molekülen zu nutzen. Die durchgeführten Arbeiten reichen dabei von der speziellen Probenpräparation zur Messung von dipolaren Kopplungen bis hin zur Entwicklung neuer NMR-spektroskopischer Methoden zur Messung von Kopplungen mit höherer Präzision und an größeren Systemen als bisher.
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Impact of tumour microenvironmental factors on dendritic cell differentiation and function
(2012)
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Divya Sekar
- Um der Erkennung durch das körpereigene Immunsystem entkommen, weisen Tumore
Modifikationen in ihrer Mikroumgebung auf. Zu diesen gehören u. a. veränderte
Sauerstoffkonzentrationen im Tumorkern und die Freisetzung biochemischer Faktoren aus
Tumorzellen, welche die Funktion von Tumor-assoziierten Phagozyten, wie z.B.
Dendritischen Zellen (DC) beeinflussen. DC sind professionelle Antigen-präsentierende
Zellen, die eine Spezialisierung in verschiedene funktionale Subtypen aufweisen. Myeloische
DC (mDC) sind besonders effizient in Hinsicht auf die Präsentation von Antigenen,
wohingegen plasmazytoide DC (pDC) regulatorisch auf das Immunsystem einwirken. Beide
Subtypen spielen eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese.
Während humane mDC, zur therapeutischen Verwendung, ex vivo aus Monozyten
hergestellt werden können, war dies für humane pDC bisher nicht möglich. Ein war deshalb
ein erstes Ziel dieser Arbeit, ein Protokoll zur Generierung humaner pDC aus humanen
Monozyten zu entwickeln. Diese wurden mittels des Wachstumsfaktors Fms-related tyrosine
kinase 3 ligand (Flt3-L) zu pDC-Äquivalenten differenziert, welche als monocyte-derived pDC
(mo-pDC) bezeichnet wurden. In der Tat zeigten mo-pDC ein für humane pDC
charakteristisches Oberflächenmarkerprofil und wiesen, im Vergleich zu mDC, eine geringe
Kapazität zur Induktion der Proliferation autologer T Zellen und zur Phagozytose
apoptotischer Zellen auf. Mo-pDC erwarben im Verlauf ihrer Differenzierung aus Monozyten
eine kontinuierlich erhöhte Expression des pDC-spezifischen Transkriptionfaktors E2-2 und
seiner spezifischen Zielgene. Der wichtigste funktionale Parameter von pDC ist die
Produktion großer Mengen von Interferon-α (IFN-α). Mo-pDC sezernierten, nach vorheriger
Aktivierung mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) oder wenn zu ihrer Differenzierung neben
Flt3-L auch Vitamin D3 oder all-trans-Retinolsäure verwendet wurde, ebenfalls große
Mengen IFN-α.
Wurden mo-pDC unter Hypoxie, einem prominenten Faktor der Tumormikroumgebung,
generiert, so waren die Expression des spezifischen Transkriptionsfaktors E2-2 und die
Freisetzung von IFN-α stark vermindert. Diese Daten zeigten zunächst, dass mo-pDC für das
Studium von Differenzierung und Funktion humaner pDC eingesetzt werden können.
Weiterhin lieferten sie Hinweise auf eine veränderte Differenzierung humaner pDC unter
Hypoxie. In einem nächsten Schritt wurde folglich untersucht, ob Hypoxie auch die
Differenzierung von pDC aus deren physiologischen Vorläufern beeinflusst. Wurden
Knochenmarkszellen der Maus mit Flt3-L unter Normoxie oder Hypoxie kultiviert, so war die
Differenzierung zu pDC unter Hypoxie in der Tat unterdrückt. Dies war abhängig von der
Hypoxie-induzierten Aktivität des Hypoxie-induzierten Faktors 1 (HIF-1), da die Flt3-Linduzierte
Differenzierung von murinen Knochenmarkszellen, in denen die Expression von
HIF-1 in pDC-Vorläuferzellen ausgeschaltet war, unter Hypoxie normal verlief.
Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass Hypoxie, durch Aktivierung von HIF-1,
Differenzierung und Funktion von pDC unterdrückt. Dieser Mechanismus könnte zu ihrer
beschriebenen Dysfunktion in humanen Tumoren beitragen.
Neben Hypoxie sind viele andere Faktoren an der Immunsuppression in Tumoren beteiligt.
Eine Komponente der Mikroumgebung in Tumoren ist das Vorhandensein apoptotischer
Tumorzellen. Apoptose von Tumorzellen findet, im Kontrast zur generellen Sicht von
Tumoren als Apoptose-resistente Entitäten, auch in unbehandelten Tumoren im Überfluss
statt. Apoptotische körpereigene Zellen unterdrücken unter physiologischen Bedingungen
das Immunsystem. Deshalb könnte das Freisetzen von apoptotischem Material oder die
Sekretion von Faktoren aus sterbenden Tumorzellen einen starken Einfluss auf die Funktion
von Tumor-assoziierten DC und die damit verbundene Aktivierung von tumoriziden
Lymphozyten haben. Eine diesbezügliche Studie war das zweite Ziel der vorliegenden
Arbeit. Humane mDC wurden zu diesem Zweck mit Überständen lebender, apoptotischer
oder nekrotischer humaner Brustkrebszellen aktiviert und anschließend mit autologen T
Zellen ko-kultiviert. Danach wurde das zytotoxische Potential der ko-kultivierten T Zellen
analysiert. Interessanterweise unterdrückte die Aktivierung mit Überständen apoptotischer
Tumorzellen die DC-vermittelte Generierung tumorizider T Zellen durch die Ausprägung
einer Population von regulatorischen T Zellen (Treg), die durch die gleichzeitige Expression
der Oberflächenmoleküle CD39 und CD69 charakterisiert war. Die Ausprägung der CD39-
und CD69-exprimierenden Treg Zell-Population war abhängig von der Freisetzung des
bioaktiven Lipids Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aus apoptotischen Zellen, welches durch den
S1P-Rezeptor 4 zur Freisetzung des immunregulatorischen Zytokins IL-27 aus mDC führte.
Neutralisierung von IL-27 in AC-aktivierten Ko-Kulturen von mDC und T Zellen blockierte die
Generierung von CD39- und CD69-exprimierenden Treg Zellen und resultierte folglich in der
Aktivierung zytotoxischer T Zellen. Weiterhin war die Bildung von Adenosin in den Ko-
Kulturen für die Unterdrückung zytotoxischer T Zellen vonnöten. Erste Experimente lieferten
Hinweise auf eine direkte Interaktion von CD69- und CD39-exprimierenden Treg Zellen mit
CD73-exprimierenden zytotoxischen T Zellen. CD39 und CD73 werden für die Bildung von
Adenosin aus ATP benötigt, weswegen die Interaktion von Treg Zellen und zytotoxischen T
Zellen die Adenosin-Produktion fördern könnte.
Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Befunde wie Faktoren der
Tumormikroumgebung die Funktion von humanen DC Subtypen beeinflussen können. Ein
Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen kann wertvolle Informationen für die Wahl
effektiver Immuntherapien oder Chemotherapien liefern und so die Therapie humaner
Tumore unterstützen.
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Coordinated optimization of visual cortical maps (I) symmetry-based analysis
(2012)
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Lars Reichl
Dominik Heide
Siegrid Löwel
Justin C. Crowley
Matthias Kaschube
Fred Wolf
- In the primary visual cortex of primates and carnivores, functional architecture can be characterized by maps of various stimulus features such as orientation preference (OP), ocular dominance (OD), and spatial frequency. It is a long-standing question in theoretical neuroscience whether the observed maps should be interpreted as optima of a specific energy functional that summarizes the design principles of cortical functional architecture. A rigorous evaluation of this optimization hypothesis is particularly demanded by recent evidence that the functional architecture of orientation columns precisely follows species invariant quantitative laws. Because it would be desirable to infer the form of such an optimization principle from the biological data, the optimization approach to explain cortical functional architecture raises the following questions: i) What are the genuine ground states of candidate energy functionals and how can they be calculated with precision and rigor? ii) How do differences in candidate optimization principles impact on the predicted map structure and conversely what can be learned about a hypothetical underlying optimization principle from observations on map structure? iii) Is there a way to analyze the coordinated organization of cortical maps predicted by optimization principles in general? To answer these questions we developed a general dynamical systems approach to the combined optimization of visual cortical maps of OP and another scalar feature such as OD or spatial frequency preference. From basic symmetry assumptions we obtain a comprehensive phenomenological classification of possible inter-map coupling energies and examine representative examples. We show that each individual coupling energy leads to a different class of OP solutions with different correlations among the maps such that inferences about the optimization principle from map layout appear viable. We systematically assess whether quantitative laws resembling experimental observations can result from the coordinated optimization of orientation columns with other feature maps.
