Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der vergleichenden funktionalen Charakterisierung der E.coli Transporter LacY, FucP und XylE und des Glucose-Transporters GlcP aus Staphylococcus epidermidis sowie funktionsrelevanter Mutanten. Sie katalysieren in vivo den PMF-gekoppelten Zuckertransport und repräsentieren die major facilitator superfamily (MFS), einer der größten Transporter-Familien überhaupt. Die Studien wurden mithilfe einer elektrophysiologischen Methode auf Basis Festkörper-unterstützter Membranen (SSM) durchgeführt. Komplementär dazu wurden radioaktive Transportassays, fluorometrische Messungen, kinetische Simulationen und theoretische Berechnungen auf Basis der 3D-Strukturen durchgeführt. Experimentell bestimmte Zucker- und pH-Abhängigkeiten elektrogener steady-state und pre steady-state Reaktionen wurden verwendet, um ein allgemeingültiges kinetisches Modell aufzustellen.
Insgesamt konnten bei allen Transportern zwei elementare elektrogene Reaktionen identifiziert werden. Eine schnelle Zucker-induzierte Konformationsänderung wurde dem induced fit des Zuckermoleküls zugeordnet. Die Elektrogenität im steady-state wird dagegen durch den langsamen Transfer der negativ geladenen Protonenbindestelle bestimmt. Die für den Symport ratenlimitierende Reaktion ist abhängig von den äußeren Bedingungen wie pH-Werten, Zuckerkonzentrationen, Substrat-Spezies und Membranpotential meist die Konformationsänderung des leeren (P) oder des beladenen (PSH) Carriers, welche die Substratbindestellen im Zuge des Alternating Access über die Membran transferieren. Ein Wechsel zwischen hohen Protonenbindungs-pK-Werten und niedrigen Protonenfreisetzungs-pK-Werten durch weitere lokale Konformationsänderungen ist zentraler Bestandteil des Transportmechanismus. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Kopplung zwischen Zucker- und Protonen-Translokation, die sich zwischen E.coli Transportern und GlcP strikt unterscheidet. In E.coli Transportern erfolgt eine kooperative Bindung von Zucker und Proton. Zudem erfolgt keine Konformationsänderung im Zucker-gebundenen, unprotonierten Carrier (PS). In GlcP ist die Kopplung erheblich reduziert. Der Transport-Modus selbst ist abhängig von den äußeren Bedingungen. So katalysiert GlcP abhängig vom pH-Gradienten Uniport, Symport oder Antiport.
Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des PMF-gekoppelten Zuckertransports und zeigt die Grenzen des für LacY formulierten 6-Zustands-Modells mit nur zwei Konformationsänderungen auf. Ein erweitertes 8-Zustands-Modell mit vier Konformationsänderungen, die unterschiedliche Ratenkonstanten aufweisen können, erklärt sowohl Symport, Antiport als auch Uniport und berücksichtigt zudem die zahlreichen Ergebnisse für LacY aus der Literatur.
Die Differenzierung zwischen Teilpopulationen hin zu unterschiedlichen Arten kann nur erfolgen, wenn zwischen diesen Teilpopulationen reproduktive Isolation besteht. Wie die unterschiedlichen Arten von reproduktiver Isolation zusammenwirken und welche Voraussetzungen bestehen müssen, um neue Arten zu bilden, muss in jedem Studiensystem untersucht werden. Ein idealer Ansatzpunkt sind Arten, die sich mehrfach an anspruchsvolle Habitate angepasst haben, deren Artbildung also von ökologischen Habitatparametern bestimmt wird. Dieser Vorgang wird als Ökologische Artbildung bezeichnet. Im Artkomplex Poecilia spec., der im Süden Mexikos mehrere schwefelangepasste Ökotypen ausgebildet hat, wurden erste Hinweise auf eine Korrelation zwischen der Selektionsstärke von natürlicher und sexueller Selektion gefunden, deren Einfluss zusammen die bestehenden reproduktiven Barrieren zwischen Klarwasser- und Schwefelökotyp formen. Wie diese Reproduktionsbarrieren beschaffen sind und wie die Umweltvariable Schwefel auf die Morphologie und das Verhalten der Poeciliiden Einfluss nimmt, wurde in der vorliegenden Arbeit anhand von fünf Fragestellungen untersucht. (1) Die Körperfärbung kann ein aussagekräftiges Signal für die Qualität des potentiellen Partners bei der Fortpflanzung sein. Wie beeinflusst die extreme Umweltvariable Schwefel die Ausbildung von Färbung? (2) Sind die gefundenen Anpassungen der Färbung erblich oder werden sie plastisch entsprechend des Nahrungsangebots ausgebildet? (3) In einem der untersuchten Flusssysteme konnte unvollständige reproduktive Isolation zwischen der Klarwasser- und Schwefelpopulation nachgewiesen werden. Sind in den Mischzonen zwischen diesen beiden Habitaten Hybriden genetisch nachweisbar und bilden diese die Färbungsanpassungen der Klarwasser-, der Schwefelpopulation oder eine intermediäre Form aus? (4) Die Gelbfärbung der Flossen bei Männchen scheint ein geeignetes Merkmal für die Anzeige der Qualität zu sein, da es möglicherweise unabhängig vom Nahrungsangebot ausgebildet wird. Besteht eine weibliche Präferenz für dieses Merkmal? (5) Auch die weibliche Partnerwahlpräferenz wird vom Habitat und dem eigenen Zustand beeinflusst. Wie verändert sich die Präferenz für Männchen mit gutem Ernährungszustand bei Weibchen, die hungrig sind?
Um diese Fragen zu beantworten, wurden in mehreren Jahren Männchen und Weibchen der Arten Poecilia mexicana und Poecilia sulphuraria aus sieben Populationen im Studiengebiet in Südmexiko gefangen und auf ihre Färbung untersucht sowie Laborpopulationen getestet. Es konnten generelle Anpassungen der Färbung an die Umweltvariable Schwefel nachgewiesen werden. Dazu gehören die Aufhellung der Körperregionen, die durch Tarnung (konkret: countershading und background matching) vor Entdeckung durch Prädatoren schützen, und die Reduktion von Gelb- und Rottönen. Diese Anpassung ist vermutlich auf das geringe Angebot an Karotinoiden in den schwefelbelasteten Extremhabitaten zurückzuführen. Außerdem konnten zahlreiche flusssystem¬spezifische Anpassungen beschrieben werden, deren Ursachen in den Unterschieden zwischen den Schwefelhabitaten untereinander begründet sind. Das Flusssystem des Río Tacotalpa stellt hier eine Besonderheit dar, da Männchen eine besonders starke Gelbfärbung der Flossen aufweisen. Wildgefangene und laborgeborene Männchen dieses Flusssystems wurden verglichen, um einen Hinweis auf den Einfluss des Nahrungsangebots auf dieses Merkmal zu untersuchen. Tatsächlich ist die Ausprägung dieses Merkmals, die Gelbfärbung der Flossen, unabhängig vom Angebot an Karotinoiden. Während die hier verwendeten genetischen Analysen nicht geeignet waren, Hybriden aus den Mischzonen zwischen Schwefel- und Klarwasserhabitat nachzuweisen, ergaben die Untersuchungen von Individuen aus den Mischzonen keine eindeutigen Ergebnisse über eine etwaige intermediäre Ausbildung der Färbung. Die Präsentation von Männchen, deren Gelbintensität an den Flossenspitzen künstlich verändert wurde, konnte bei Weibchen keine eindeutige Präferenz für stärker gefärbte Männchen aufzeigen. Vielmehr weist dieses Ergebnis auf eine starke Korrelation zwischen mehreren Merkmalen (z. B. weitere morphologische Merkmale, Verhalten) hin, die für die Beurteilung der männlichen Qualität herangezogen werden. Die weibliche Präferenz für konditionsabhängige Merkmale wird bei schwefelangepassten Weibchen leicht verstärkt, wenn diese hungrig sind. Eine solche flexible Präferenz sollte gerade in Habitaten mit starken Fluktuationen im Nährstoffangebot existieren. Dabei waren Weibchen, denen Videoaufnahmen präsentiert wurden, eher in der Lage, das qualitativ hochwertigere Männchen zu identifizieren, als Weibchen, denen animierte Bilder präsentiert wurden. Auch hier wird davon ausgegangen, dass die Reduktion auf eines oder wenige Merkmale, die für die Partnerwahl zur Verfügung stehen, keine ausreichend starke Reaktion auslösen können. Vielmehr ist der Zugriff auf alle Aspekte der männlichen Erscheinung wichtig, um die Qualität des potentiellen Partners zu beurteilen.
Färbung ist also generell geeignet, den Ökotyp eines Individuums zu bestimmen und ein solches Merkmal kann der Artbestimmung im ersten Schritt der Partnerwahl dienen. Dasjenige männliche Färbungsmerkmal, das über mehrere Generationen gleichbleibend ausgeprägt wurde – die Gelbfärbung der Flossen – reicht jedoch nicht aus, um bei der weiblichen Partnerwahl eine Reaktion auszulösen. Vielmehr deuten die Ergebnisse auf eine enge Korrelation der Färbung mit weiteren Merkmalen in Morphologie und Verhalten eines Individuums hin, die vom wählenden Weibchen stets gemeinsam entsprechend der Multiple-message-Theorie betrachtet werden. Auch der Vergleich zwischen Videoaufnahmen und animierten Fotografien als Stimuli bei der Partnerwahl ergab, dass der Aspekt Verhalten (nur verfügbar mit Videoaufnahmen) für eine Partnerwahlentscheidung von Bedeutung ist.
Meine Arbeit konnte den bestehenden Wissensschatz um die bestehenden reproduktiven Barrieren im Studiensystem um den Aspekt der Färbung erweitern. Meine Ergebnisse zeigen weitere spannende Fragestellungen auf. Je größer das Verständnis der vorliegenden Selektionskräfte und Mechanismen reproduktiver Isolation ist, desto besser kann die Wissenschaft verstehen, welche Umgebungsvariablen welchen Einfluss auf den Prozess der Artbildung haben.
In conclusion our data show, that Flightless I function is essential for striated muscle development in zebrafish. Myofibrillar bundling and focal adhesion formation represent the basis for this development, and are ultimately a prerequisite for cardiac trabeculation. Future analysis of Actin polymerization in trabeculation will provide addition knowledge about the sensitivity of the developing and adult heart to a disequilibrium in F-actin versus G-actin availability.
In this study we found a novel ErbB2-dependent cardiomyocyte maturation process which affects both cardiac chambers. It will be of great interest to further study the nature of the Memo1-GFP cell-cell junctions and other junction proteins in order to unravel the significance of this maturation process for heart development.
Interestingly we found, that memo1bns4 homozygous mutant animals, which we generated with CRISPR/Cas9 technology, develop indistinguishable from siblings, suggesting that zygotic memo1 expression is dispensable for zebrafish development. Future studies will address the question if maternal zygotic memo1bns4 mutants will develop a heart or vascular phenotype as reported form Memo1 knockout mice or as observed in memo1 morphants in this study.
In cultured C2 mouse skeletal muscle cells the Golgi-apparatus relocalizes dependent on centrosomal proteins and independent of microtubules. We describe here that zebrafish cardiomyocytes have a similar Golgi-complex distribution suggesting a similar differentiation-dependent reorganization. This striated muscle specific, fragmented Golgi distribution might be an advantage for these cells in order to shuttle vesicles through the densely packed sarcomere structures. Future studies could address the timing of the Golgi-reorganization in cardiomyocytes during development and possibly use this Golgi-zebrafish line as a tool to study cardiomyocyte maturation in disease models and in heart regeneration.
The peptide loading complex (PLC) is a central machinery in adaptive immunity ensuring antigen presentation by major histocompatibility complex class I (MHC I) molecules to immune cells. If nucleated cells present foreign antigenic peptides from various origins (e.g., viral infected or cancer cells) on their cell surface they are targeted and eliminated by effector cells of the immune system to protect the organism against the hazard. The antigen presentation process starts with proteasomal degradation. Peptide loading and quality control of most, if not all, MHC I is performed by the PLC. Despite the main components, architecture, and general functions of this labile and multi-subunit assembly have been described, knowledge about the inner mechanics of MHC I loading and quality control in the PLC is limited. Detailed structural insights into the interactions and functions of key elements are lacking. In this PhD thesis, structural and functional aspects of the PLC in peptide loading and quality control of MHC I are unraveled, and the PLC was analyzed from an evolutionary perspective.
First, composition and architecture of native PLC isolated from different mammalian species was analyzed. Comparison of detergent-solubilized PLC from cow and sheep spleens with PLC isolated from human source showed a compositional conservation in mammals, with the central components TAP, ERp57, tapasin, calreticulin, and the MHC I heterodimer were conserved in these species. Negative-stain electron microscopy (EM) analyses revealed an identical overall architecture of PLCs from human, sheep, and cow with two major densities at opposing sides of the plane of the detergent micelle corresponding to endoplasmic reticulum (ER) luminal and cytosolic domains. Interestingly, the glucose-regulated protein 78 (GRP78) was associated only with the PLC from sheep and cow as revealed by mass spectrometry. This ER chaperone is involved in initial folding steps of MHC I but was not co-purified with human PLC, rendering it an interesting target for future functional and in-depth structural studies.
The human PLC was stabilized by reconstitution in membrane mimicking systems that replace the detergent, which is necessary to solubilize the complex. This stabilization allowed detailed structural analysis by single-particle cryogenic electron microscopy (cryo-EM). The structure of the MHC I editing module in the PLC, composed of tapasin, ERp57, calreticulin, MHC I, and β-2-microglobulin (β2m), was solved at an overall resolution of 3.7 Å. Within the structure, two important features were visualized: (i) the editing loop of tapasin, which is directly involved in peptide proofreading of MHC I; (ii) the A-branch of the Asn86 tethered N-linked glycan on MHC I. Both features are crucial elements in the quality control and peptide editing process on MHC I. The editing loop interacts with the peptide binding groove in MHC I. It disturbs the interaction between a cargo peptide C terminus and the F-pocket in the binding groove by displacing Tyr84 and the helices α1 and α2. The helix displacement widens the F-pocket which allows a faster peptide exchange on MHC I. The glycan is bound in its monoglucosylated form (Glc1Man9GlcNAc2) by the lectin domain of calreticulin. The A-branch of this glycan is stretched between MHC I Asn86 and the lectin domain, leading to the hypothesis that the glycan will be released from calreticulin once MHC I is loaded with a favored peptide (pMHC I).
For investigation of the glycan status of MHC I, intact protein liquid chromatography coupled mass spectrometry (LC-MS) was performed under denaturating conditions. An allosteric coupling between peptide loading and removal of the terminal glucose by α-Glucosidase II (GluII) was discovered. In addition, the PLC remained fully intact after peptide loading, which demonstrated GluII action on the PLC once MHC I is loaded.
With establishing GluII as transient interaction partner, this work deepens the knowledge of the molecular sociology of the PLC and how the PLC is involved in the endoplasmic reticulum quality control (ERQC). Further investigation of the ER aminopeptidases ERAP1 and ERAP2 showed that these enzymes neither alone nor together stably interact with the PLC. In contrast, both work independent from the PLC on free peptides in the ER.
LC-MS analysis of the PLC components revealed a very unusual glycosylation pattern of tapasin. Tapasin was observed with N-linked glycans ranging from the full glycan (Man9GlcNAc2) to heavily trimmed glycans, where only a single GlcNAc remained attached to Asn233. In the PLC, tapasin is probably shielded from degradation by ERQC and can remain functional and intact without a full N-linked glycan.
Mechanistic characterization of photoisomerization reactions in organic molecules and photoreceptors
(2023)
In dieser Arbeit wurden verschiedene Einflüsse auf die Dynamik von Photoisomerisierungen in Phytochromen und indigoiden Photoschaltern untersucht. Beide Forschungsgebiete teilen wesentliche Aspekte wie die Kontrolle durch sterische Wechselwirkungen und den starken Einfluss der Polarität oder der ionischen Umgebung.
Auf dem Gebiet der Phytochrome wurde die relative Positionierung der knotenlosen Phytochrome innerhalb der Superfamilie der Phytochrome in Bezug auf ihre Photodynamik und den Effekt von Grundzustandsheterogenität herausgearbeitet. Es wurde anhand von ultraschnellen, zeitaufgelösten Anrege-Abtast-Experimenten der einzelnen GAF-Domäne All2699g1 im Vergleich mit dem vollständigen knotenlosen Phytochrom All2699g1g2 und dem strukturell ähnlichen knotenlosen Phytochrom SynCph2 gezeigt, dass knotenlose Phytochrome in ihrer Vorwärtsdynamik eine komplexe mehrphasige Kinetik mit einem langlebigen angeregten Zustand (~100 ps) aufweisen. Die beobachtete mehrphasige Kinetik konnte einer initialen Chromophordynamik sowie einer nicht exponentiellen Reorganisation der chromophor-umgebenden Proteinmatrix zugeordnet werden. Dies steht im starken Kontrast zur im Gebiet der Phytochrome etablierten Beschreibung derartiger mehrphasiger Kinetiken mittels heterogener Grundzustände. Stattdessen wurde ein konserviertes kinetisches Muster identifiziert, welches die mehrphasige Dynamik beschreibt und in allen in dieser Arbeit untersuchten Phytochrome beobachtet wurde. Zudem konnte dieses Muster in einem Phytochrom der Gruppe I und einem Phytochrom der Gruppe III, die einen ähnlichen Pr Dunkelzustand aufweisen, gezeigt werden, was eine breite Anwendbarkeit des damit verbundenen Mechanismus vermuten lässt. Weiterhin konnte die zentrale Rolle eines konservierten Tyrosins in der Photoisomerisierung anhand von Mutationsstudien in All2699g1 herausgearbeitet werden. Diese konservierte Aminosäure muss im Rahmen der Reorganisation der Proteinmatrix vom Chromophor weggezogen werden, damit die sterische Blockade abgebaut werden kann, die die Isomerisierung des Chromophors zunächst verhindert. Da diese Bewegung von diversen Faktoren in der den Chromophor umgebenden Proteinmatrix abhängt, weist sie eine nicht exponentielle Kinetik auf, die je nach Phytochrom, der spezifischen Flexibilität und dem vorhandenen Raum in der Bindetasche unterschiedliche Lebenszeiten aufweist.
Die Rückreaktion knotenloser Phytochrome konnte ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert werden, welche im Pikosekundenbereich abläuft, und damit signifikant schneller ist als die Vorwärtsreaktion. Im Gegensatz zur Vorwärtsreaktion nimmt Grundzustandsheterogenität in der Rückreaktion eine weitaus bedeutendere Rolle ein. Hier weisen die in All2699g1 vorhandenen heterogenen Grundzustandspopulationen jeweils eine eigene Kinetik ihres angeregten Zustands auf, während die homogenen Grundzustände von All2699g1g2 und SynCph2 jeweils nur einen Zerfall des angeregten Zustands zeigen. Der Ursprung dieser Heterogenität konnte im Wasserstoffbrückennetzwerk des Chromophors lokalisiert und mit dem konservierten Tyrosin und einem konservierten Serin in der PHY-Domäne verknüpft werden. Die Anwesenheit der PHY-Domäne sorgt demnach für eine Verringerung der Grundzustandsheterogenität und des vorhandenen Raums in der Bindetasche, wodurch die Effizienz der Photoreaktion optimiert wird.
Zuletzt konnte die Millisekundendynamik knotenloser Phytochrome und der Einfluss der PHY-Domäne auf diese aufgeklärt werden. Die PHY-Domäne sorgt hierbei durch den verringerten Raum in der Bindetasche dafür, dass die zunächst stattfindende thermische Relaxation des Chromophors signifikant verlangsamt wird, während spätere Änderungen im Photozyklus nur wenig beeinflusst werden.
Auf dem Gebiet der indigoiden Photoschalter konnte, anhand eines sterisch überladenen Hemithioindigo Photoschalters, der Photoisomerisierungsmechanismus des Hula-Twists beobachtet und eine starke Lösungsmittelabhängigkeit der entsprechenden Kinetik aufgezeigt werden. Aus den durchgeführten zeitaufgelösten Anrege-Abtast-Experimenten in verschiedenen Lösungsmitteln konnte ein Modell für die Photodynamik des verwendeten Hemithioindigo Photoschalters entwickelt werden. In unpolaren Lösungsmitteln muss eine hohe Barriere zur produktiven konischen Durchschneidung überwunden werden, was zu Lebenszeiten des angeregten Zustands im Nanosekundenbereich führt. Der Weg zur produktiven konischen Durchschneidung folgt dabei dem Hula-Twist Mechanismus. Dieser Pfad ist in polaren Lösungsmitteln unerreichbar, weshalb eine schnelle Relaxation über eine unproduktive konische Durchschneidung stattfindet.
Im zweiten Projekt auf dem Gebiet der indigoiden Photoschalter wurde anhand der neuartigen Klasse der Iminothioindoxyl Photoschalter ein Schwingungsenergiedonor für Schwingungsenergietransferstudien entwickelt. Das daraus entwickelte Modellsystem, bestehend aus einer künstlichen Aminosäure auf Basis des Iminothioindoxyl Photoschalters und einem daran gekoppelten Schwingungsenergiesensor, wurde charakterisiert und die primäre Photoreaktion untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der angeregte Zustand des Modellsystems kurzlebig ist und unter Abgabe von großen Mengen an Schwingungsenergie zerfällt, unabhängig von der Anregungswellenlänge und dem verwendeten Lösungsmittel. Somit zeigt das entwickelte System vorteilhafte Eigenschaften für Schwingungsenergietransferstudien.
Insgesamt konnten somit die Mechanismen der Photoisomerisierungsreaktionen in knotenlosen Phytochromen und indigoiden Photoschaltern aufgeklärt und daraus die Relevanz der Umgebung für derartige Reaktionen herausgearbeitet werden.
The oleochemical and petrochemical industries provide diverse chemicals used in personal care products, food and pharmaceutical industries or as fuels, oils, polymers and others. However, fossil resources are dwindling and concerns about these conventional production methods have risen due to their strong negative impact on the environment and contribution to climate change.
Therefore, alternative, sustainable and environmentally friendly production methods for oleochemical compounds such as fatty acids, fatty alcohols, hydroxy fatty acids and dicarboxylic acids are desired. The biotechnological production by engineered microorganism could fulfill these requirements. The concept of metabolic engineering, which is the modification of metabolic pathways of a host organism for increased production of a target compound, is a widely used strategy in biotechnology to generate cell factories or chassis strains for robust, efficient and high production. In this work, the versatile model and industrial yeast Saccharomyces cerevisiae was manipulated by metabolic engineering strategies for increased production of the medium-chain fatty acid octanoic acid and de novo production the derived 8-hydroxyoctanoic acid.
Octanoic acid production was enabled by the fatty acid biosynthesis pathway by use of a mutated fatty acid synthase (FASRK) in a wild type FAS deficient strain. The yeast fatty acid synthase (FAS) consists of two polypeptides, α and β, which assemble to a α6β6 complex in a co-translational manner by interaction of the subunits. Because this step might be subject to cellular regulation, the α- and β- subunits of fatty acid synthase were fused to form a single-chain construct (fusFASRK), which displayed superior octanoic acid production compared with split FASRK. Thus, FASRK expression was identified as a limiting step of octanoic acid production. But the strains that produce octanoic acid have a severe growth defect that is undesirable for biotechnological applications and could lead to lower production titers. One reason is the strong
inhibitory effect of octanoic acid. Another possibility is that the mutant FAS no longer produces enough essential long-chain fatty acids. To compensate for this, the mutated split and fused FAS variants were co-expressed individually in a strain harboring genomic wild type FAS alleles. In
addition, mutant and wild type variants of fused and split FAS were co-expressed together in a FAS deficient strain. However, both cases resulted in decreased octanoic acid titers potentially by physical and/or metabolic crosstalk of the FAS variants.
The fatty acid biosynthesis relies on cytosolic acetyl-CoA for initiation and derived malonyl-CoA for elongation and requires NADPH for reductive power. To increase production of octanoic acid, engineering strategies for increased acetyl-CoA and NADHP supply were investigated. First, the flux through the native cytosolic acetyl-CoA and NADPH providing pyruvate dehydrogenase bypass was enhanced by overexpression of the target genes ADH2, ALD6 and ACSL461P from Salmonella enterica in combination or individually. Next, the acety-CoA forming heterologous phosphoketolase/phosphotransacetylase pathway was expressed and NADPH formation was increased by redirecting the flux of glucose-6-phosphate into the NADPH producing oxidative branch of the pentose phosphate pathway. In particular, the flux through glycolysis and pyruvate dehydrogenase bypass was reduced by downregulating the expression of the phosphoglucose isomerase PGI1 and deleting the acetaldehyde dehydrogenase ALD6. Glucose-6-phosphate was guided into the pentose phosphate pathway by overexpressing the glucose-6-phosphate dehydrogenase ZWF1. The first approach did not influence octanoic acid production but the latter increased yields in the glucose consumption phase by 65 %. However,
combining the superior fusFASRK with acetyl-CoA and NADPH supply engineering strategies did not result in additive production effects, indicating that other limitations hinder high octanoic acid accumulation. Limitations could be caused in particular by the strong inhibitory effects of octanoic acid or by intrinsic limitations of the FASRK mutant. To enlarge the octanoic acid production platform towards other derived valuable oleochemical compounds the de novo production of 8-hydroxyoctanoic acid was targeted. Since short- and medium-chain fatty acids have a strong inhibitory effect on Saccharomyces cerevisiae, the inhibitory effect of hydroxy fatty acid and dicarboxylic with eight or ten carbon atoms were compared and revealed only little or no growth impairment. Subsequently, the formation of 8-hydroxyoctanoic acid was targeted by a terminal hydroxylation of externally supplied octanoic acid in a bioconversion. For that, three heterologous genes, encoding for cytochromes P450 enzymes and their cognate cytochrome P450 reductases were expressed and 8-hydroxyoctanoic acid production was compared. In addition, the use of different carbon sources was compared.
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For thousands of years, S. cerevisiae has been employed by humans in brewing and baking. Nowadays, this budding yeast is more than that: it is a well investigated model organism and an established workhorse in biotechnology. S. cerevisiae serves as a production host for various applications such as i) bioethanol production ii) the biosynthesis of hormones including insulin or iii) cannabinoid biosynthesis. Hereby, the robustness of S. cerevisiae and its high tolerances regarding pH and salt concentrations qualifies it for a wide range of industrial applications. Moreover, products of S. cerevisiae are generally recognised as safe (GRAS), enabling diverse biotechnological applications. Various mechanisms for genetic engineering of S. cerevisiae are applicable and the engineering process itself is straightforward since methods are established and widely known. Due to the wide range of industrial applications of S. cerevisiae, this organism is an ideal candidate for applied research and implementation of the recombinant biosynthesis of tocochromanols in this study.
Tocochromanols encompass tocotrienols and tocopherols, which are lipid-soluble compounds that are commonly associated with vitamin E activity. Hereby, α-tocopherol is the most prevalent form, as it is an essential nutrient in the diet of humans and animals. Naturally, tocochromanols are almost exclusively synthesised by photoautotrophic organisms such as plants or cyanobacteria. They consist of an aromatic head group and a polyprenyl side chain which is saturated in tocopherols and 3-fold unsaturated in tocotrienols. The methylation status of the chromanol ring distinguishes α-, β-, γ- and δ-tocochromanol. All forms of tocochromanols represent a group of powerful antioxidants, scavenging reactive oxygen species (ROS) and preventing the propagation of lipid oxidation in lipophilic environments. Recently, attention has been drawn to tocotrienols, due to their benefits in neuroprotection as well as cholesterol-lowering and anti-cancer properties. Consequently, tocochromanols are valuable additives in the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries.
The metabolic engineering strategy of S. cerevisiae to enable tocochromanol biosynthesis was started in a preceding master thesis with the provision of the aromatic moiety, homogentisic acid (HGA), from the aromatic amino acid biosynthesis. Hereby, the upregulation and redirection of the native pathway was essential. Therefore, a strain with an engineered aromatic amino acid pathway for improved 4 hydroxyphenylpyruvate (HPP) production (MRY33) was utilised from Reifenrath and Boles (2018). Furthermore, a heterologous hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) was required to convert HPP into HGA. Thus, several heterologous HPPDs were expressed and characterised regarding their HGA production within the previous study. The best variant originated from Yarrowia lipolytica, YlHPPD, and was integrated into the genome of MRY33. The resulting strain JBY2, produced 435 mg/L HGA in a shake flask fermentation.
This work was started with the genetically highly modified strain JBY2, whose genome already contained a large number of genes artificially expressed behind strong promoters. For further strain development, it was advantageous to maintain a high degree of sequence variability in order to prevent genomic instabilities due to sequence homologies. Thus, 17 artificial promoters (AP1-AP17) were characterised regarding their strength of expression by the yellow fluorescent protein (YFP). These sequences were also part of a patent that was filed during this work (WO2023094429A1).
The key point of this study was the development of a metabolic engineering strategy for the strain JBY2. First, the sufficient supply of the second precursor, the polyprenyl side chain, was investigated. Natively, S. cerevisiae produces the precursor, geranylgeranyl diphosphate (GGPP), from the isopentenyl diphosphate pathway. However, without further engineering, GGPP was barely detectable in JBY2 (< 0.1 mg/L). Thus, engineering of the isopentenyl diphosphate biosynthesis was necessary. The limiting enzyme of the mevalonate pathway was the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR), which is encoded by HMG1. Therefore, a truncation for feedback-resistance and its overexpression by a promoter exchange was performed. Furthermore, the promoter of the gene for the squalene synthase (pERG9) was exchanged by the ergosterol sensitive promoter pERG1 to limit the metabolic flux of the mevalonate pathway into the ergosterol pathway. The native GGPP synthase (BTS1) was another limitation that was observed throughout this study. To overcome this bottleneck, plasmid-based and integrative overexpression of the native BTS1 and a codon optimised BTS1 were investigated. Other strategies to improve GGPP production were the deletion of the gene for the diacylglycerol pyrophosphate phosphatase (DPP1) to prevent excessive dephosphorylation of GGPP to geranylgeraniol (GGOH), and the overexpression of the farnesyl pyrophosphate synthetase, encoded by ERG20. However, the best improvements of the GGPP biosynthesis, inferred through GGOH measurements, were achieved from the screening of several heterologous GGPP synthases in S. cerevisiae. The best performing strain was JBY61 (JBY2, hmg1Δ::pTDH3-HMG1tr[1573–3165], pERG9Δ::pERG1, ChrIV-49293-49345Δ::pTDH3-XdcrtE-tSSA1_LEU2), bearing the heterologous GGPP synthase crtE of Xanthophyllomyces dendrorhous and produced 64.23 mg/L GGOH. Consequently, this engineering strategy improved the GGOH production by a factor of 642 compared to the parent strain JBY2.
In Europe, the sugar refinery is largely based on sugar beets. This route for obtaining household sugar results in a large amount of biomass waste, consisting mainly of the insoluble beet resi-dues, e.g., cell wall fragments. To a vast moiety this debris consists of the polymer pectin (up to 20% in the dry total solids). The structure of pectin is based on a backbone of D-galacturonic acid units (GalA), but also contains various other sugar monomers, predominantly L-arabinose, D-galactose, L-rhamnose and D-xylose. The amount of GalA adds up to a moiety of up to 70% with-in this sugar cocktail. So far, this debris is only fed to cattle or simply burnt. In nature, pectin is a common substrate for various organisms. The degradation of pectin-rich biomass is often per-formed by filamentous fungi like Hypocrea jecorina (also known as Trichoderma reesei) and As-pergillus niger, which evolved pectinases to degrade the pectin backbone and pathways to con-sume the monomer GalA as a sole carbon source. The fungal catabolism of pectin residues starts with the reduction of GalA to L-galactonate (GalOA) by a GalA-reductase. Even though filamen-tous fungi are native hosts of the GalA-catabolism and certain engineering approaches have al-ready been demonstrated, this class of organisms remains challenging with regard to bioreactor cultivation and tedious genetic accessibility. In contrast, the yeast S. cerevisiae is well known in fermentation processes and easily modified by a versatile set of genetic tools. So far, first ap-proaches have already been conducted to transfer the GalA utilization pathways into S. cerevisiae, but these approaches indicated limitations regarding GalA-uptake and redox cofac-tor replenishment due to the relatively high oxidative state of GalA compared to other sugars like glucose and galactose. Furthermore, the generally strongly increased demand for redox co-factors must be met by GalA reduction by finding new cofactor sources or redirecting reactions of the core metabolism.
This work aimed at the production of GalOA, which is the first intermediate of the fungal GalA catabolism. This compound shows an interesting range of potential applications, for instance as a food and cosmetic additive. To overcome the oxidized character of GalA, the presence of a more reduced co-substrate as a redox donor and as a carbon and energy source was required. To further enhance the reduction of GalA, modulation of the redox-cofactor supply and enzyme engineering were performed.
Xylose, an abundant sugar fraction of lignocellulosic biomass, is a five-carbon skeleton molecule. Since decades, utilization of this sugar has gained much attention and has been in particular focus as a substrate for production of biofuels like ethanol by microbial hosts, including Saccharomyces cerevisiae. In this yeast, xylose is naturally not used as a carbon source, but its utilization could be achieved by metabolic engineering either via the oxidoreductive route or through the isomerase pathway. Both pathways share xylulose as a common intermediate that must be phosphorylated before entering the endogenous metabolism via the non-oxidative pentose phosphate pathway (noxPPP). Besides this, in some bacteria a non-phosphorylating oxidative pathway for xylose degradation exists, known as Weimberg pathway, where a molecule of xylose is converted by a series of enzymes - xylose dehydrogenase (XylB), xylonate dehydratase (XylD), 3-keto-2-deoxy-xylonate dehydratase (XylX) and α-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase (KsaD) - to form α-ketoglutarate (AKG). Besides having several useful properties as a product, AKG could also be used for cell growth as an intermediate of the tricarboxylic acid (TCA) cycle. One target of the present study is to establish a functional Weimberg pathway in S. cerevisiae. Previous studies have shown that this task is not trivial, for instance due to the toxicity of xylonate (the first metabolite of the pathway) and the involvement of an iron-sulfur cluster dependent enzyme, the D-xylonate dehydratase. The assembly of iron-sulfur clusters on a heterologous protein in yeast is known to be challenging.
To establish the Weimberg pathway in yeast, the genes xylB, xylD, and xylX were obtained from Caulobacter cresentus and ksaD was from Corynebacterium glutamicum. In a variant, the dehydratase xylD was replaced with orf41 from Arthrobacter nicotinovorans, which is believed to be independent of iron-sulfur clusters. Growth of yeast cells on xylose as a sole carbon source was expected as an indicator of a functional Weimberg pathway. However, the heterologous expression of the codon optimized genes was not sufficient to reach this goal. Due to the complexity of the interactions of the heterologous pathway with the endogenous cellular processes, it was assumed that potential limitations could be overcome by adaptive laboratory evolution, using xylose as a sole source of carbon. Increasing selection pressure was applied on a strain with Weimberg pathway genes integrated into the genome over several generations. As a variant of the evolutionary engineering approach, mutator strains were generated. For this, RAD27 and MSH2 genes were deleted, which are involved in nucleotide excision and mismatch repair mechanisms, respectively. Some of the resulting strains PRY24, PRY25, PRY27 and PRY28 were able grow in xylose as a sole carbon source after evolutionary engineering. As a control, a non-mutator strain PRY19 was also included. Strikingly, only the mutator strains were able to consume xylose as a sole carbon source, which shows the feasibility of the approach.
In addition to the mutator strain strategy, a further approach employed in the present study was the simultaneous expression of the Weimberg pathway in the cytosol and mitochondria. This was based on the reasoning that the iron-sulfur cluster biogenesis on XylD may be improved in the organelle and that the AKG is an intermediate of the TCA cycle. In the strain AHY02, all enzymes of the pathway were tagged with mitochondrial targeting signals in addition to a full cytosolically localized pathway. The localization of the mitochondrial variants was confirmed by fluorescence microscopy. Together with AHY02, CEN.PK2-1C wild type strain was also included as a control for evolution. When a selection pressure on xylose was applied, both strains - AHY02 and CEN.PK2-1C - were able to grow in the course of evolution. Deletion of the xylulokinase (XKS1) gene was found to be detrimental for both evolved strains in xylose-containing media. This suggests that the evolution of the endogenous oxidoreductive and noxPPP genes is responsible for growth of the evolved cells. For the evolved strain AHY02, it could also be possible that the Weimberg pathway genes supported to growth in addition to the oxidoreductive route. To elucidate the underlying molecular mechanisms, genome sequencing and reverse engineering approaches would be necessary in future.
In addition to screening for growth on xylose as a sole carbon source, a less stringent screening system was created to examine even a minor flux of xylose towards AKG. For this, all genes necessary for conversion of isocitrate to AKG where deleted, yielding a glutamate auxotrophic strain. In this system, the cells can grow on other carbon sources, whereas xylose is only provided as a source of AKG for the synthesis of glutamate...