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Bladsmutten : Nr. 1/2014
(2014)
Bladsmutten : Nr. 2/2014
(2014)
Welcome to Issue 83 of Australasian
Arachnology. I’d like to begin this editorial by
once again noting the steady stream of new
members who are joining the society, and
observing (as always) the exemplary recent
research outputs in the Australasian region. The
Australasian arachnological community continues
to maintain a strong interest in our
remarkable arachnid fauna, and continues to
promote arachnology throughout the region.
This is by no means a straightforward task,
given the negative public perceptions that often
accompany our eight-legged friends, and given
the sometimes challenging research funding
environment for taxonomic and biodiversity
research. Certainly, having watched the society
grow over the last twenty years, and having
seen perceptions of the Australasian fauna
change during that time, it is both reassuring
and exciting to look ahead. With unparalleled
population growth throughout the region and
the world, and unprecedented pressures on our
natural landscapes, habitats and remaining
natural biomes, it is critical that arachnids (and
indeed all invertebrates) continue to receive the
growing recognition they deserve among
ecologists, conservation biologists, legislators
and the public at large. The 10th Invertebrate
Biodiversity and Conservation Conference in
Melbourne in December 2011 confirmed just
how active research in this field is, and there is
no doubt that Australasian arachnids will
continue to be the focus of much positive
attention over the next few years.
Welcome to Issue 84 of Australasian Arachnology. I’d like to begin this editorial by first making special mention of the late Doug Wallace OAM (1923-2012), who passed away in June this year. Doug was a founding member of the Australasian Arachnological Society, and would be further known to many as the founder and President of the long-running Rockhampton Arachnological Society. Robert Raven and I have written a small notice re. Doug’s passing in the General Announcements section (below), and Robert will contribute a full obituary for Doug in the following issue of the newsletter. Vale Doug – you will be sorely missed.
Welcome to Issue 82 of Australasian
Arachnology. The last six months have been
extremely productive for the Australasian
Arachnological Society, with nine new
members and numerous new papers being
published by existing AAS members. It is
wonderful to see such a dynamic and growing
membership, and to witness the continuing
fascination elicited by our remarkable arachnid
fauna. Indeed, since the beginning of 2011, over
50 new species of arachnids have been
described from Australasia, including pseudoscorpions
and numerous spiders in the families
Selenopidae, Archaeidae, Amaurobiidae, Tetragnathidae
and Araneidae. The sheer diversity
of undescribed arachnid species in Australasia
has always posed a challenge to systematists
and ecologists, but major attempts are being
made to document the fauna. Take, for example,
Pinkfloydia, a new genus of Tetragnathidae
recently described from Western
Australia!
Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einem potenten Werkzeug – auch in der Produktion von Membranproteinen – entwickelt. Da keine lebenden Zellen genutzt werden, kann der Prozess der präparativen Membranproteinproduktion vereinfacht und individuell optimiert werden. Im Gegensatz zu konventionellen zellbasierten Expressionssystemen gewährleistet die zellfreie Proteinsynthese die direkte Zugänglichkeit zum Reaktionsort und damit die Möglichkeit der unmittelbaren Kontrolle. Dies ermöglicht eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen auf das Zielprotein. Die Verbesserung und Entwicklung neuer Modi der zellfreien Membranproteinsynthese war ein Teil der vorliegenden Arbeit. Setzt man dem Zellfrei-System von Außen keine hydrophobe Umgebung zu, so präzipitiert das neu-synthetisierte Membranprotein im Reaktionsmix (P-CF). Interessanter Weise unterscheiden sich diese Präzipitate von den aus der E.coli zellbasierten Proteinproduktion bekannten Einschlußkörperchen, da sie sich teilweise leicht in mildem Detergenz resolubilisieren lassen. Zudem konnte für verschiedene Transportproteine, die aus Präzpitat resolubilisiert und danach in Liposomen rekonstituiert wurden, spezifische Transportaktivität gezeigt werden (z.B. eukaryotische Ionentransporter, Multi-Drug Resistenzproteine von E.coli). Alternativ können die Membranproteine direkt, durch die Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsmix, solubilisiert werden (D-CF). Um die einzelnen Expressionsmodi zu optimieren wurden 24 gebräuchliche Detergenzien auf ihre Eigenschaft hin gestestet, strukturell sehr unterschiedliche Membranproteine zu solubilisieren. Die Familie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether hat sich dabei als sehr geeignet erwiesen um das prokaryotische α-helikale Multi-Drug Resistenzprotein EmrE, den bakteriellen vornehmlich aus ß-sheets bestehenden Transporter Tsx und den eukaryotischen G-Protein gekoppelten Vasopressin Rezeptor V2R direkt im D-CF Modus zu solubilisieren. Zudem konnte eine Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von Tsx vom verwendeten Expressionsmodus bzw. des verwendeten Detergenz mit Hilfe der Black Lipid Membrane´ Methode gezeigt werden. Die Expression eines repäsentativen Teils von 134 Zielproteinen des inneren Membranproteoms von E.coli wurde in drei verschiedenen Zellfrei-Expressionsmodi getestet. Ein an jedes Zielprotein des Membranroteoms C-terminal fusioniertes GFP diente der Konzentrationsbestimmung im D-CF Expressionsmodus. Die Faltung von GFP ist in Anwesenheit von Detergenz signifikant reduziert. Zunächst wurden alle Zielproteine in einem batch´ System im D-CF Modus im Mikrotiterplatten Maßstab mit Hilfe eines Roboters hergestellt. Die Etablierung einer robotergestützten Plattform, welche das Pipettieren, Inkubieren und Detektieren kombiniert, diente als Grundlage für den Herstellungsprozess des Membranroteoms von E.coli in einem Medium-Durchsatz Verfahren in batch´ Konfiguration. In dieser ersten Stufe des Screens im D-CF Modus konnten 84 Zielproteine (63%) aufgrund der detektierten GFP-Fluoreszens in Mengen von 1 bis 60μg pro mL Reaktion als erfolgreich produziert identifiziert werden. Zudem wurde das Membranproteom in dem effektiveren continous exchange (CE) Verfahren im P-CF, wie auch im D-CF Modus wiederholt exprimiert. Im Vergleich zur batch´ Konfiguration konnten im CE D-CF Modus deutlich mehr Zielproteine (75%) als positiv identifiziert werden. 16 Zielproteine wurden dabei bereits in Expressionsmengen von mehr als 100μg solubilisierte Membranproteinfusion pro mL Reaktionsmix gewonnen. 99 Zielproteine (74%) konnten als positiv identifiziert werden, nachdem die unlösliche Fraktion der CE P-CF Reaktion elektrophoretisch getrennt und angefärbt wurde. Für 66 Kandidaten (49%) stellt das produzierte Protein nach Coomassie-Färbung eine dominante Bande, und damit (semi-)präparative Proteinmengen, dar. Der Erhalt von Detergenz-solubilisierten Membranproteinproben von hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt zur Gewinnung struktureller sowie biochemischer Daten. Das E.coli α-helikale Multi- Drug Resistenz Protein SugE konnte im CE P-CF Verfahren in präparativen Mengen von mehr als 2mg Protein pro mL des Reaktionsansatzes gewonnen werden. Durchgeführte analytische Größenausschlusschromatographie zeigte, dass der Transporter unter optimierten Reaktionsbedingungen in einem homogenen, schlanken Peak eluiert. Mittels elektronenmikroskopischer Gefrierbruchanalysen konnte eine effiziente und homogene Rekonstitution von SugE in E.coli Liposomen gezeigt werden. Bindungsstudien unter der Verwendung fluoreszensbasierter Anisotropie-Messungen haben gezeigt dass Proflavin – im Gegenteil zu Ethidium – ein Substrat von SugE ist. YedZ ist ein 24kDa leucinreiches Membranprotein mit sechs putativen Transmembransegmenten und enthält zwei Kofaktoren, ein Häm b und ein Flavin-mononukleotid (FMN). Im P-CF Modus exprimiertes YedZ kann effizient in den Detergenzien LMPG, LPPG, SDS und DPC resolubilisiert werden. Analytische Größenausschlusschromatographie zeigte einen symmetrischen Elutionspeak der apo-Form. Mittels CD-Spektroskopie des gereinigten apo-YedZ in 0.02% DDM wurde ein α-helikaler Sekundärstrukturanteil von 55% ermittelt. Zur Gewinnung von holo-YedZ wurde anstatt Hämb das chemisch verwandte Hemin eingesetzt. Die aufgenommenen UV/Vis Spektren der zellfrei produzierten holo-YedZ Proteinprobe in ihrer oxydierten und reduzierten Form, zeigen zu einer in vivo exprimierten Vergleichsprobe identische Absorptionsmaxima. Für sechs G-Protein gekoppelten Rezeptoren konnte die zellfreie Expression in präparativen Mengen gezeigt werden. Das Steroid-Derivat Digitonin, sowie einzelne Mitglieder der Detergenzfamilie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether, wurden als am geeignetsten für die lösliche Expression der GPCRs im CE D-CF Verfahren ermittelt. Löslich in Anwesenheit von Brij78 produzierter GPCR Proben, zeigten nach Negativfärbung in elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalysen eine homogene Probenpräparation und geben Hinweis auf eine strukturelle Dimerisierug der Rezeptoren. Detergenzsolubilisierte Rezeptoren konnten in Liposomen, basierend auf E.coli Lipid-Mischungen, rekonstituiert werden. Elektronen-mikroskopische Gefrierbruchanalysen zeigten eine homogene Rekonstitution, welche auf eine funktionelle Faltung der Rezeptoren schließen lässt.
The Opisthobranchia comprise highly specialized marine gastropods and have therefore been subject to diverse investigations covering various biological disciplines. However, a robust phylogeny of these gastropods is still lacking and several subclades have only been rarely studied. Furthermore, crucial aspects for the evolution of Opisthobranchia have not been comparatively analysed. Therefore, the aim of the present thesis is to gain new insights into the phylogeny of the Opisthobranchia with special focus on certain critical groups (Pleurobranchomorpha, Acteonoidea) and to assess several crucial features of the evolution of the investigated clades. The combination of four different gene markers (18S rDNA, 28S rDNA, 16S rDNA and CO1) and modern molecular systematic analysis tools were used to construct phylogenetic hypotheses focussing on Opisthobranchia as a whole as well as Pleurobranchomorpha and Acteonoidea in more detail. Intriguing new aspects of phylogeny and evolution of Opisthobranchia were revealed. First of all, monophyly of Opisthobranchia is definitely rejected based on the present data, while monophyly of Euthyneura (comprising Opisthobranchia and Pulmonata) is supported. Monophyly of opisthobranch subclades is confirmed for Nudipleura (as well as its constituting groups Nudibranchia and Pleurobranchomorpha), Umbraculida, Pteropoda (as well as subclades Thecosomata and Gymnosomata) and Acochlidiacea, for Cephalaspidea (if Runcinacea is regarded as a separate clade) and for Sacoglossa (if Cylindrobulla is accepted as an Oxynoacea). Aplysiomorpha are rendered paraphyletic due to the position of Akera bullata, but this result needs further investigation and should be considered with caution. The Nudipleura are found as the first single offshoot of the Euthyneura implying an early evolutionary separation of the last common ancestor of this clade. The remaining taxa form two main clades, one comprising the opisthobranch subgroups Umbraculida, Cephalaspidea, Aplysiomorpha and Pteropoda, while the other contains the pulmonate taxa and the opisthobranch Sacoglossa and Acochlidiacea. The interrelationships within these clades remain largely unresolved due to low statistical support values. However, a possible sister group relationship of Acochlidiacea and Eupulmonata receives statistical support. Opisthobranchia display various highly specific adaptations to diverse food sources. However, evolution of these specialized traits has never been assessed at an analytical level. The current thesis reconstructs the evolution of dietary preferences with novel methodologies based on the newly proposed phylogenetic hypothesis. Reconstruction of dietary evolution revealed herbivory as the ancestral condition in Euthyneura implying that carnivory evolved at least five times independently in the diverse lineages. The first comprehensive molecular phylogenetic hypothesis of the Pleurobranchomorpha could not reveal monophyly of the two main subclades Pleurobranchaeidae and Pleurobranchidae. This is due to the position of a single taxon (Euselenops luniceps) which is assigned to the Pleurobranchaeidae based on morphology but clusters within Pleurobranchidae in the current hypothesis. Furthermore, the tribe Berthellini and the genus Berthella are rendered paraphyletic by the current analyses. The results of molecular systematic analyses were used to reconstruct historical biogeography of Pleurobranchomorpha. Four different methodological approaches were applied yielding ambiguous results for Pleurobranchomorpha. However, the Pleurobranchidae comprising about 80% of the extant Pleurobranchomorpha most probably derived from an Antarctic origin. Dating of the phylogenetic tree via molecular clock methods yielded divergence of Pleurobranchidae into the Antarctic Tomthompsonia antarctica and the remaining species in Early Oligocene. Afterwards the latter underwent rapid radiation during Oligocene and Early Miocene. This divergence event coincides with two major geological events in the Antarctic region. On the one hand, the onset of glaciation and on the other hand the opening of the Drake Passage with concurrent formation of an Antarctic circumpolar current (ACC). I suppose that these sudden and dramatic changes in climate and palaeogeography probably accounted for migration of the last common ancestor of Pleurobranchidae (besides Tomthompsonia) into warmer regions via the Drake Passage to the Western Atlantic and Eastern Pacific and via the South Tasman Rise to the Indo-West Pacific. Furthermore, the ACC may have triggered larval dispersal to the Eastern Atlantic. The phylogenetic position of Acteonoidea has been a matter of debate for decades and they have long been considered as basal opisthobranchs. Results of the present thesis rather support placement in “Lower Heterobranchia” as sister group of Rissoelloidea. The current division of Acteonoidea into three families has never been investigated by means of phylogenetic methods. Thus, this thesis provides the first comprehensive investigation of this clade challenging present division into three families. The results rather support division into two main clades with the monogeneric Bullinidae clustering within Aplustridae doubting its separate status. Additionally, Rictaxis punctocaelatus which has been assigned to Acteonidae clusters basal to Aplustridae rendering Acteonidae paraphyletic. Since information on morphology of R. punctocaelatus was lacking until now, I conducted the first detailed investigation on morphology and histology of this species in order to reassess the unexpected molecular systematic placement. Character tracing analyses revealed similarities with both acteonoidean families implying an intermediate position of this species which might be assigned to a separate family in the future. Furthermore, the common features of Acteonidae and Rictaxis (massive shell, small foot, anterior mantle cavity opening, and absence of oral gland) are possibly plesiomorphic for the whole Acteonoidea. In summary, the results of the present thesis provide valuable novel insights into the phylogeny and evolution of the Opisthobranchia by employing state-of-the-art approaches of molecular systematics and evolutionary reconstruction. Thus, diverse hypotheses on opisthobranch phylogeny and evolution were either supported or rejected as well as novel hypotheses proposed which offer the basis for further research on these extraordinary gastropods.
Recently, the first part of the morphological revision of the Southeast Asian water monitor lizards of the Varanus salvator (Laurenti, 1768) species group provided a taxonomic overview over the members of this successful and widespread species complex (Koch et al. 2007). There, the Philippine taxa marmoratus, nuchalis and cumingi were reelevated to species status due to diagnostic morphological characteristics, e.g. significantly enlarged scales on the neck region. In this second part of the ongoing revision, these three species are re-investigated using additional voucher specimens and advanced statistical techniques including canonical variates analysis and principal component analysis. Our new investigations indicate that V. marmoratus represents a composite species, comprising at least three distinct taxa. Hence, the populations of the Sulu Archipelago (Tawi-Tawi Island) and those of the Palawan region are described as new species, viz. Varanus rasmusseni sp. nov. and V. palawanensis sp. nov., respectively. The allopatric island populations of V. cumingi inhabiting Samar, Leyte, and Bohol (the East Visayan subregion) show characteristic and geographically correlated colour patterns distinct from the type locality Mindanao (the second subregion of Greater Mindanao), warranting subspecific partition of this species. The new subspecies is named V. cumingi samarensis ssp. nov. In contrast, the taxonomic status of V. nuchalis remained unchanged, although this species shows some considerable variation in colour pattern. The systematic chapters are supplemented with notes about biology and conservation status. The hitherto underestimated diversity and zoogeography of Philippine water monitors is discussed in the light of Pleistocene sea level fluctuations. Finally, we introduce a scenario for the evolution and spread of Southeast Asian water monitor lizards and provide an identification key for the Philippine members of the V. salvatoI' complex.
Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von
Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur
weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus,
das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen
Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden
Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert:
· Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps
Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten
Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die
erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende
Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen,
dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des
Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus
und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0
und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde
deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in
die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der
temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der
bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine
Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die
beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen
bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem
Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein
entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt
direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen
Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt.
In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten
Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten
oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat
über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur,
was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al.,
Theoretischer Teil
-4-
2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats
konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels
Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase
konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex
vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des
Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats
bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur.
· Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats
Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm:
79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit
um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus
wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des
Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass
der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des
Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der
Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für
die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA
weist eine leicht verringerte Aktivität auf.
Tabelle 2.1: ...
Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung
des Parvulustats
Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen
hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region
gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von
der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b-
Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen.
Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die
energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur
Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine
thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von
Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es
eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund
Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern
in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen.
· Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats
Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats
wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin
zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten
thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A,
P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1).
Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten.
Theoretischer Teil
-6-
Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch
die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die
flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt.
· Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats
Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler
Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter
Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden
Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse
zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in
Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten
wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und
fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des
Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden.
Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende
Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien
Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des
Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische
Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes
70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der
thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung
nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem
strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle
70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche
Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und
C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die
Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert
des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten
Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses
Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente
in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt.
Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu
sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der
Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die
Proteinstabilität zu bekommen.
Theoretischer Teil
-7-
Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich
aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus
(Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions-
Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats
C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante
C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende
Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC
bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses
konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive
Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer
cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für
weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität
und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend
erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.