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G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest membrane protein family and play an essential role in signal transduction through the cell membrane. They are currently the targets of approximately 50 % of the pharmaceuticals on the market (Klabunde and Hessler, 2002). However, only one high-resolution GPCR structure has been determined up to now, that of bovine rhodopsin (Palczewski et al., 2000). The GPCR activation and regulation mechanisms are still unknown and other GPCR structures are thus required. MePNet (Membrane Protein Network) was a European consortium dedicated to structural studies of GPCRs. The approach was to produce 100 GPCRs in three expression systems (Escherichia coli, Pichia pastoris and Semliki Forest Virus infected mammalian cells) in order to select at each step of the process (production, solubilization, purification) the constructs that fulfilled quantity and quality (functionality) requirements for crystallization trials. In our team, we screened 38 of the 100 targets in P. pastoris. For each receptor, the clone with the highest production level was identified by dot-blot. The size and homogeneity of each receptor were then analyzed by Western-blot. The human adenosine A2A receptor showed a well-defined and pronounced single band and was thus selected for further characterization. The adenosine A2A receptor is a GPCR mainly localized in the central nervous system and, as it antagonizes dopaminergic activity, it has great potential as a drug target for the treatment of Parkinson’s disease. Functional characterization by binding assays with the specific antagonist [3H]-ZM241385 demonstrated a Bmax of 56 +/- 3 pmol/mg i.e. pmol of binder per milligram of total membrane protein, and a KD of 0.40 +/- 0.02 nM. Receptor production was then improved by lowering the induction temperature, decreasing the induction time and adding DMSO to the medium. For large-scale production, fermention reached around 300 g cells (wet weight)/L culture, which provided 43 mg of functional receptor in membranes per liter of culture. Functional solubilization was achieved with dodecyl-β-D-maltoside and the soluble yield was increased to 70-80 % of the membrane content by addition of cholesteryl hemisuccinate and increasing the ionic strength. The receptor was successfully purified via Ni-NTA and monomeric avidin chromatography in the presence of the antagonist ZM241385. This strategy produced a pure, homogeneous and stable receptor preparation with functionality demonstrated by radioligand binding assays. The total receptor yield after purification was routinely around 20 % of the membrane functional receptor content and 2 g of membranes provided 4 mg of pure receptor for crystallization trials. GPCRs are very difficult targets for crystallization, and co-crystallization with antibody fragments has been shown to be a successful method for crystallization of membrane proteins. In order to develop such a tool for the adenosine A2A receptor, a single-chain Fv (scFv) fragment specific to the purified receptor was selected by phage display. The receptor was functionally immobilized on the surface of streptavidin beads and after two rounds of selection, 6 different phages were identified several times. After production in E. coli and purification via Ni-NTA affinity chromatography, 4 out of the 6 scFv fragments were sufficiently enriched to be tested by ELISA. For the ELISA, the receptor was functionally immobilized via the biotinylation domain of the construct in a 96-well streptavidin-coated plate. The antibody fragments binding to the receptor were identified based on interaction with HRP-conjugated protein L. One scFv fragment gave a positive ELISA signal 10 fold above background and titration of the scFv fragment binding to the receptor was specific and saturable. However no complex of scFv fragment and receptor was observed on gel filtration. In order to have a more sensitive detection method, the scFv fragment was labeled with fluorescein: a complex was then observed up on gel filtration but the binding appeared to be non-specific. A pull-down assay with immobilized non-labeled scFv fragment finally confirmed the specificity of the binding, but also the low affinity of the interaction. Affinity maturation of this specific scFv fragment by a random mutagenesis and selection process should improve this parameter in order to obtain an adapted tool for co-crystallization.
In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Allergie gegen Süßkirsche untersucht. Zunächst wurde die Leistungsfähigkeit eines professionellen Tests mit re-kombinanten Allergenen aus Süßkirsche untersucht. Hierzu wurden rPru av 1, 3 und 4 einzeln eingesetzt, um die Sensibilisierungsmuster von Kirschallergikern aus Mitteleuropa und Spanien zu untersuchen. Vor allem die Untersuchung LTP-sensibi-lisierter Patienten aus diesen Regionen in einer Zahl, die einen statistischen Ver-gleich ermöglichte, offenbarte neue Aspekte des Phänomens schwerer Reaktionen bei solchen Patienten. Die drei rekombinanten Kirschallergene wurden auch kombiniert in einem einzigen Test eingesetzt, um schwer standardisierbare Proteinextrakte als Hilfsmittel zur in vitro Diagnose zu ersetzen. Um die Leistungsfähigkeit dieses Tests umfassend beurteilen zu können, wurde sie mit der des SPT in Birkenpollenallergikern mit und ohne Kirschallergie verglichen. Die mögliche Bedeutung unbekannter Allergene oder Isoformen wurde durch die Abschätzung des Beitrags der bekannten Kirschallergene zum IgE-Bindungsanteil von Kirschextrakt untersucht. Mit dem ImmunoCAP konnten die bereits veröffentlichten regional unterschiedlichen Sensibilisierungsmuster bestätigt werden. Die dominierende Rolle des Bet v 1-Homologen Pru av 1 in Patienten aus Mitteleuropa und damit die Bedeutung der Birkenpollenassoziation in dieser Region, konnte ebenso bestätigt werden wie die überragende Relevanz von Pru av 3 für Kirschallergiker aus Spanien. Der Vergleich der größten bisher publizierten und für statistische Untersuchungen ausreichend großen Gruppe LTP-sensibilisierter Patienten aus Mitteleuropa mit solchen Patienten aus Spanien, legte im Gegensatz zu früheren Studien keine ausschließlich auf die molekularen Eigenschaften von Pru av 3 beschränkte Assoziation von sys-temischen Reaktionen und einer Sensibilisierung gegen LTPs nahe. Die Assoziation scheint eher zwischen der Herkunft LTP-sensibilisierter Patienten und systemischen Reaktionen zu bestehen. Diese Schlussfolgerung konnte gezogen werden, da bei keinem der LTP-sensibilisierten Patienten aus Mitteleuropa systemische Reaktionen auftraten. Weder eine Co-Sensibilisierung gegen Pollen noch eine Allergie gegen andere Nahrungsmittel wie zum Beispiel Pfirsich korrelierten mit dem Auftreten sys-temischer Reaktionen. Eine Erklärung für dieses Phänomen konnte aus den vor-liegenden Daten daher nicht abgeleitet werden. Die Leistungsfähigkeit des rMix-ImmunoCAP mit rPru av 1, 3 und 4 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche war exzellent. Weder der kommerziell erhältliche Extrakt-ImmunoCAP noch der ImmunoCAP, der einen optimierten Extrakt an der Festphase trug konnte mit diesem Test konkurrieren. Die klinische Sensitivität des rMix-ImmunoCAP war mit ≥95% hervorragend, und der Test stimmte in 92% der Fälle mit dem SPT überein. Eine Unterscheidung zwischen Birkenpollenallergikern ohne Allergie gegen Süßkirsche und Kirschallergikern war hingegen weder mit dem rMix-ImmunoCAP noch mit dem SPT möglich. Die Spezifität beider Tests war von klinisch insignifikanter IgE-Reaktivität gegen Pru av 1 beeinträchtigt und auch die Konzentration spezifischen IgEs erlaubte keine Unterscheidung zwischen beiden Gruppen auf der Ebene einzelner Patienten. Der rMix-ImmunoCAP ist aber sehr gut geeignet eine Sensibilisierung bei einem Verdacht einer Allergie gegen Süßkirsche nachzuweisen, ohne auf weitere Allergene wie Pru av 2 oder Isoformen von Pru av 1 zurückgreifen zu müssen. Damit wurde zum ersten Mal ein diagnostischer Test ein-gesetzt, der einen Proteinextrakt aus Früchten vollständig ersetzen kann Die quantitative Abschätzung des Beitrages der bereits bekannten Allergene aus Süßkirsche zur IgE-Bindung mittel EAST-Inhibition hat gezeigt, dass bei einem Großteil der untersuchten Seren erhebliche Anteile des IgEs gegen Süßkirsche nicht erfasst werden. Die Ursache für dieses Phänomen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend aufgeklärt werden, aber es ist als sehr wahrscheinlich anzu-sehen, dass die neu identifizierte Isoform von Pru av 1 zumindest bei einem Teil der Seren hierfür verantwortlich ist. Darüber hinaus waren im Immunoblot bei Seren bei denen die IgE-Bindung nicht vollständig zu inhibieren war IgE-Reaktivität gegen noch unbekannte Strukturen zu erkennen. Neben der Beteiligung glykosilierter Proteine war auch eine Beteiligung von Pru av 2 nicht vollständig auszuschließen, wenngleich im Verlauf dieser Arbeit keine Hinweise auf eine Relevanz dieses Allergens in dem untersuchten Patientenkollektiv gefunden werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Grundlagen gelegt, um die Allergenität von Süßkirsche in einem in vitro Modell zu reduzieren. Es wurden Isoformen von Pru av 1 mit einer Kombination aus molekularbiologischen und proteinchemischen Methoden untersucht. Es wurden hierzu Techniken gewählt, die eine weitgehend um-fassende und zuverlässige Identifizierung von Isoformen ermöglichten. Ferner wurde der Gehalt an Pru av 1 von verschiedenen Kirschsorten verglichen, das Splice-Intron von Pru av 1 sequenziert, um die Herstellung eines spezifischen und wirksamen RNAi-Konstruktes zu ermöglichen, sowie die Eignung in vitro regenerierter Kirschpflanzen als Zielorganismus durch den Nachweis von Pru av 1 in den Blättern solcher Pflanzen geprüft. Die in dieser Arbeit verwendeten Methoden haben sich als geeignet erwiesen zuverlässig Isoformen von Allergenen zu identifizieren. Es konnte mit Hilfe einer syn-ergistischen Kombination aus einer cDNA-Bibliothek, PCR, und 2-D-PAGE / MS mit Pru av 1.02 eine neue Isoform von Pru av 1 identifiziert werden. Die mit den molekularbiologischen Methoden erzielten Ergebnisse stimmten dabei mit den Re-sultaten der proteinchemischen Untersuchungen sehr gut überein. In beiden Fällen wurden zwei Pru av 1 Isoformen nachgewiesen und lediglich die eine Variante von Pru av 1.02 mit sehr hoher Sequenzidentität konnte nicht als Protein nachgewiesen werden. Die auf Protein- und DNA-Ebene übereinstimmenden Ergebnisse bezüglich der beiden IgE-bindenden Isoformen, lassen darüber hinaus auf eine weitgehend vollständige Erfassung der Pru av1 Isoformen schließen. Pru av 1.02 besteht aus drei Varianten und zeigte ein anderes IgE-Bindungs-verhalten als das bereits bekannte Pru av 1.0101. Diese Isoform ist daher sowohl für eine zukünftige gentechnische Reduzierung der Allergenität von Süßkirsche als auch für diagnostische Zwecke bedeutsam. Für eine erfolgreiche Reduzierung der Aller-genität von Süßkirsche muss die Expression aller IgE-reaktiven Isoformen des in Mitteleuropa dominierenden Allergens Pru av 1 unterdrückt werden. Wenngleich Pru av 1.0201 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche nicht not-wendig erscheint, könnte sie jedoch sowohl einen Einfluss auf die Höhe der gemes-senen IgE-Werte und die Ausbildung von Symptomen haben, als auch besser ge-eignet sein zwischen Birkenpollenallergikern mit und ohne Allergie gegen Süßkirsche zu unterscheiden. Abschließend wurden dann die Grundlagen für die gentechnische Redu-zierung der Allergenität von Süßkirsche geschaffen. Der Gehalt an Pru av 1 war in allen elf Kirschsorten sehr ähnlich, und erlaubt daher alle untersuchten Kirschsorten als Ausgangsmaterial einzusetzen. Die Sequenzierung des Splice-Introns aus Pru av 1 ermöglicht es jetzt ein intron-spliced hairpin RNAi-Konstrukt herzustellen. Dieses Konstrukt könnte dann eingesetzt werden, um die Reduktion der Allergenität von Süßkirsche experimentell in einem in vitro Modell zu zeigen. Mit dem Nachweis von Pru av 1 in den Blättern in vitro regenerierter Kirschpflanzen konnte gezeigt werden, dass die Voraussetzungen hierzu gegeben sind.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Anti-PGE2-Antikörperfragment exprimiert werden, mit dem über NMR-Spektroskopie genauere Strukturdaten der Antikörperbindungsdomäne zu erhalten wären. Da Fab-, Fv- und scFv-Fragmente die Antigenbindungsstelle besitzen und sich gegenüber einem vollständigem IgG zusätzlich durch ihre geringere Größe auszeichnen, wurden die korrespondierenden Antikörperfragmente für diese Arbeiten gewählt. Ausgehend von einer etablierten Hybridom-Zelllinie konnten über cDNA-Synthese und Assembly-PCR die Gene für die Antikörperfragmente bereitgestellt werden. Zum Verifizieren von DNA-Sequenz und Bindungseigenschaften stand ein Anti-PGE2-Fab-Fragment früherer Arbeiten von Frau Dr. Ilse Zündorf zur Verfügung. Für Strukturuntersuchungen müssen relativ große Proteinmengen bereit gestellt werden, daher ist es notwendig, hohe Ausbeuteverluste durch Präzipitation, Degradierung, Aufreinigungsverluste u.a. zu vermeiden. Um zunächst eine möglichst gute Proteinexpression zu erhalten, wurde der Bakterienstamm Escherichia coli BL21DE3 und das pET-Expressionssystem gewählt. In diesem System war zu erwarten, dass die überexprimierten Antikörperfragmente unter den gewählten Bedingungen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter inclusion bodies, in den Zellen vorliegen werden. Die der Klonierung der VH-, Vk- und scFv-Gene folgende Expression der Proteine zeigte, dass es tatsächlich zur Bildung von inclusion bodies kommt. Die Vorteile dieser Aggregatbildung, wie hohe Proteinmenge, Proteaseunempfindlichkeit aufgrund der hohen Dichte sowie die hohe Homogenität, sollten für die Gewinnung nativer Antikörperfragmente genutzt werden. Hierfür konnte ein System etabliert werden, das im wesentlichen auf der Solubilisierung der Aggregate und der Reduktion falscher Disulfidbrücken mit anschließender Rückfaltung und Rekonstituierung der Disulfidbrücken beruht. Kritische Parameter, die den Rückfaltungsprozess beeinflussen, wurden untersucht. Hierunter fallen insbesondere die Zusammensetzung des Renaturierungssystems wie Pufferbedingungen, das Verhältnis von oxidierten zu reduzierten Glutathion und der Zusatz von sogenannten Faltungsenhancern, die Additiva. Für fast alle wesentlichen Punkte konnten Systemkomponenten etabliert werden, die für das scFv-Fragment eine nahezu vollständige Überführung der inclusion bodies in die lösliche Form erlauben. Auch eine Bindung an das Antigen Prostaglandin E2 konnte unter Anwendung von Radioimmunoassays gezeigt werden. Problematisch ist die Aufkonzentrierung der in niedriger Konzentration vorliegenden renaturierten scFv-Fragmente. Je stärker aufkonzentriert wird, desto stärker präzipitieren die scFv-Moleküle in der Ultrafiltrations- bzw. Zentrifugationsfiltereinheit. Antikörper und Antikörperframente sind ohne Frage eine sehr wichtige Molekülgruppe von molekularbiologischen und biochemischen Interesse, nicht nur in dieser Arbeitsgruppe. Im Rahmen einer möglichen Weiterführung dieser Arbeit müsste geklärt werden, ob das Präzipitationsverhalten der scFv-Fragmente eine inhärente Eigenschaft des Anti-PGE2 scFv ist, oder ob hier doch eine zumindest teilweise inkorrekte Faltung der Proteinkette vorliegt. Mögliche weitere Experimente könnten in der Variation des Linkers liegen oder das etablierte Verfahren an einem weiteren scFv-Fragment zu testen. Da die genannten Probleme bei der Aufkonzentrierung der Proteinlösung auftreten, sollten statt der angewandten Techniken alternative Methoden geprüft werden. Auch wäre es interessant zu sehen, ob sich ein z.B. kommerziell verfügbares scFv-Fragment, dessen Bindungseigenschaften bekannt sind, nach Denaturierung wieder in die native Form überführen lässt. Abschließend lässt sich sagen, dass die Herstellung von nativen Protein aus inclusion bodies viele Vorteile bietet, die für die Präparation größerer Proteinmengen nicht ungenutzt bleiben sollten.
Retrovirale Gen-Therapie-Vektoren haben die ethisch problematische Eigenschaft, ungerichtet in das Genom der therapierten Zellen zu integrieren und somit die Zelle gegebenenfalls durch Insertions-Mutagenese zu schädigen. Diese Problematik könnte gelöst werden, indem das zugrunde liegende Prinzip spezifisch integrierender, mobiler genetischer Elemente (Transposons) aufgeklärt und in die Retrovirus-basierten Gen-Therapie-Vektoren mit einbezogen werden könnte. Das Genom des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum enthält eine Reihe von Non-LTR-Retrotransposons, die ausnahmslos Positions- und Orientierungs-spezifisch in die genetisch unproblematischen Regionen vor oder hinter tRNAGene integrieren (tRNA-Gen-assoziierte Retroelemente oder kurz TRE). Zur Untersuchung des Mechanismusses der Positions- und Orientierungs-spezifischen Integration von TRE-Retrotransposons wurde in D. discoideum ein in vivo Retrotranspositions-Testsystem etabliert, mit welchem de novo auftretende Retrotranspositions-Ereignisse endogener TRE-Retrotransposons auf methodisch einfache Weise festgestellt und analysiert werden konnten. Das in vivo Testsystem beruht auf der positiven Selektion derjenigen Zellen eines D. discoideum-Reporterstammes, in denen eines der selten auftretenden Retrotranspositions-Ereignisse stattgefunden hat. Die Herstellung des D. discoideum- Reporterstammes erfolgte durch die Veränderung des UMP-Synthase-Gens (pyr5-6), in welches artifiziell ein Intron (cbfAint) inklusive eines „Köder“-tRNA-Gens (valUAC) integriert wurde. Aufgrund der Integration eines TRE-Retrotransposons in die Nähe des „Köder“-tRNA-Gens kann das Intron nicht mehr korrekt aus der UMP-Synthase-Vorläufer-mRNA gespleißt werden, die Zellen konvertieren dadurch bedingt vom ura+- zum ura--Phänotyp und können deshalb mit dem für ura+-Zellen toxischen Zytostatikum 5-Fluoro-orotat (5-FO) positiv selektiert werden. Durch die detaillierte Analyse zahlreicher 5-FO-resistenter Klone konnte gezeigt werden, daß in modernen D. discoideum-Stämmen ausschließlich die oberhalb von tRNA-Genen integrierenden TRE5-Retrotransposons vom Subtyp A.1 und A.2 gleichermaßen aktiv sind und daß ein beliebiges „Köder“-tRNA-Gen in einer artifiziellen genomischen Umgebung als Integrations-Ziel für TRE5-A-Retrotransposons dienen kann. Die TRE5-A-Retrotransposons zeigten entsprechend den genomischen Kopien eine Positions-Spezifität von ca. 48 (±3) bp oberhalb des tRNA-Gens und Ziel-Sequenz-Verdopplungen von 12 – 15 bp. Alle de novo integrierten TRE5- A.1-Retrotransposons waren 5’-verkürzt, während 64% der TRE5-A.2-Retrotransposons ein intaktes 5’-Ende aufwiesen. Das nukleäre D. discoideum-Protein CMBF (C-Modul-bindender Faktor) bindet Sequenzspezifisch an das C-Modul von TRE5-A-Retrotransposons und könnte deshalb an der Regulation der Transkription und/oder Mobilisierung der TRE5-A-Retrotransposons beteiligt sein. Zur Untersuchung des Einflusses von CMBF auf die TRE5-A-Retrotranspositions-Frequenz wurde das in vivo Retrotranspositions-Testsystem im D. discoideum-Stamm JH.D2 etabliert, welcher mit ca. 5% des Wildtyp-Niveaus CMBF stark unterexprimiert. Die Herstellung von JH.D2 erfolgte durch Einführung eines amber-Translationsstop-Codons in das cbfA-Gen des Wildtyp-Stamms AX2 sowie Expression einer amber-Suppressor-tRNA. Durch die Herstellung eines murinen monoklonalen Anti-CMBF-Antikörpers konnte bewiesen werden, daß die CMBF-Unterexpression auf eine partielle Suppression des cbfA(amber)-Stop-Codons zurückzuführen ist. Die Unterexpression von CMBF führte zu einer Erniedrigung der zellulären Menge an Sense- und Antisense-Transkripten der TRE5-A-Retrotransposons und im in vivo Testsystem zu einer maßgeblichen Reduktion der Retrotranspositions-Frequenz. Das Protein CMBF zeigt in der JumonjiC-Domäne (JmjC) Homologie zu einer Vielzahl von Proteinen prokaryontischer und eukaryontischer Organismen und könnte daher neben der Regulation der TRE5-A-Retrotransposition noch weitere biologische Funktionen in D. discoideum erfüllen. Die eingehende Untersuchung des Phänotyps der CMBFunterexprimierenden Mutante JH.D2 zeigte ein verlangsamtes Wachstum sowie einen um ca. 24 Stunden verzögerter Beginn der Entwicklung aufgrund der Inhibition des cAMP-Signalsystems. Durch die homologe Expression von CMBF und N-terminal verkürzter CMBF-Derivate konnte der Entwicklungs-Phänotyp von JH.D2 revertiert und somit der zelluläre CMBF-Mangel als alleinige Ursache für die phänotypische Veränderung von JH.D2 verantwortlich gemacht werden. Aufgrund von Zweifeln an der Richtigkeit des bislang angenommenen CMBF-kodierenden Gens (cbfA-Gen) wurde der Transkriptionsstart des cbfA-Locus mittels der 5’-RACE-Methode bestimmt und somit der Beginn des cbfA-Gens korrekt definiert. Das cbfA-Gen umfaßt demnach 3412 bp inklusive eines Introns von 409 bp und kodiert somit für ein 1000 Aminosäuren langes Protein mit einem rechnerischen Molekulargewicht von 114 198 kDa. Durch die Etablierung des in vivo Retrotranspositions-Testsystems in Dictyostelium discoideum sind die Voraussetzung für eine detaillierte Untersuchung der spezifischen Retrotransposition der TRE5-Retrotransposons gegeben. Die Herstellung der CMBF-unterexprimierenden D. discoideum-Mutante JH.D2 bietet die Möglichkeit einer eingehenden Funktions-Analyse der charakteristischen Domänen von CMBF.
Der Nucleus suprachiasmaticus (SCN) ist der übergeordnete circadiane Schrittmacher (die “Tageszeitenuhr“) der Säugetiere. Er generiert den circadianen Rhythmus und synchronisiert diesen mit den diurnalen Signalen (Zeitgebern) aus der physikalischen Umwelt. Die Generierung der circadianen Rhythmik findet innerhalb einzelner SCN-Neurone (“clock cells“), die einen Multi-Oszillatoren-Veband bilden, statt. Die asynchronen Individualrhythmen der “clock cells“ werden zu einem gemeinsamen Haupt-Rhythmus, den circadianen Rhythmus, synchronisiert. Die entscheidende Rolle bei der Synchronisation der Individual-Rhythmen wird dem inhibitorischen – in fast allen SCN-Neuronen vorkommenden – Neurotransmitter Gamma- Amino-Buttersäure (GABA) zugeschrieben. Der gemeinsame Haupt-Rhythmus wird weiterhin durch exogene Zeitgeber auf die 24-stündige Periodik der Umweltsignale getriggert. Der dafür wichtigste Zeitgeber ist das Licht. Die Licht-Informationen werden retinal perzipiert und chemisch durch den Neurotransmitter Glutamat an den SCN übermittelt. Der Schlaf – als prominente Komponente circadianer Rhythmen – scheint ebenso vom GABAergen System des SCN gesteuert zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das GABAerge System von Goldhamstern einschließlich seines glutamatergen Eingangssystems und der GABAergen Efferenzen analysiert. Diurnale Fluktuationen der untersuchten Komponenten des GABAergen Netzwerkes wurden auf ihre Beteiligung an Synchronisationsvorgängen im SCN beleuchtet. Die semiquantitative Analyse mit Hilfe von HPLC, Immuncytochemie und Immunoblot- Verfahren erbrachte eindeutige diurnale Fluktuationen aller untersuchten Komponenten des GABAergen Systems im Goldhamster-SCN. Während der Dunkelphase wurde das GABAerge-System aktiviert: die GABA-Synthese (GAD56/67), der Gesamt-GABA-Gehalt und die GABA-Wiederaufnahme (Entsorgung) aus dem synaptischen Spalt durch GABA-Transporter (GAT-1) zeigten eine nächtliche Reaktivitätssteigerung. Dies wurde durch die Erhöhung der nächtlichen GABA-Freisetzung aus SCN-Gewebekulturen (slice-Kulturen) ergänzt. In einer weiteren Untersuchung wurde die Zusammensetzung des GABAA-Rezeptors, der an den Synchronisationsvorgängen im SCN beteiligt ist, näher charakterisiert. Im SCN von Goldhamstern wurden die GABAA-Rezeptor- Untereinheiten alpha 2, alpha 3, beta 1 und beta 2/3 (schwach vertreten) nachgewiesen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das GABAerge System an der Schlafregulation beteiligt ist. Die Komponenten des GABAergen Systems (Gesamt-GABA, GAD56/67, GAT-1) im SCN von Goldhamstern wiesen während des Schlafs im Vergleich zum wachen Tier identischer photoperiodischer Phasenlage erhöhte Reaktivität auf. Die Komponenten des glutamatergen Systems, welchem die Lichtinformationsübermittlung an das GABAerge System im SCN obliegt, zeigten ebenfalls eine diurnale Fluktuation. Die Maxima der Immunreaktivität für die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten (GluR1, GluR2/3) am Tage deuten auf eine optimale Beteiligung dieser Komponenten an der Lichtvermittlung und auf einen Triggereffekt von Glutamat hin. Der Gesamt-Glutamat-Gehalt im SCN wies zwar erhöhte Werte während der Nacht auf, jedoch konnte keine Aussage über die Menge des funktionellen Neurotransmitters gemacht werden, da nur ein Bruchteil der Gesamt-Glutamat- Menge als Neurotransmitter wirkt. Die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten zeigten eine – im Vergleich zu wachen Tieren derselben photischen Phasenlage – erhöhte Reaktivität bei schlafenden Goldhamstern. Die Hochregulation der GABAergen Systems während der Nacht unterstützt die Hypothese, dass GABA-Pulse – verabreicht zu einem bestimmten Tageszeit – Rhythmen individueller SCN-Neurone (“clock cells“) synchronisieren können. Die Synchronisation der GABAAusschüttung zu bestimmten Tageszeiten aus allen SCN-Neuronen wird durch das glutamaterge System getrieben. Alle untersuchten Komponenten zeigten dabei konsensuelle Reaktivitätsmuster, die als erhebliche Kontrastverstärkung der Hell- und Dunkelphase gewertet werden müssen. Die Unterschiede in der Reaktivität des GABAergen und glutamatergen Systems zwischen schlafenden und phasengleich untersuchten wachen Tieren stellen deren große Bedeutung für die Schlafregulation heraus.
Einfluß von Rho-GTPasen und Aktin auf den cortikalen Membrantransport in Xenopus laevis-Oozyten
(2002)
Rho-Isoform-spezifische Änderungen der Zelloberfläche. Durch Bestimmung der Anzahl plasmamembranständiger Na,K-Pumpen bzw. der elektrischen Membrankapazität als Maße für die Zelloberfläche wurde der Einfluss verschiedener rekombinanter Rho-GTPasen auf den kortikalen Membranfluss an Xenopus-Oozyten untersucht. RhoA, RhoB, RhoC, RhoD und Cdc42 führten zu einer Abnahme der Zelloberfläche, wohingegen RhoE, RhoG und Rac1 eine Vergrößerung hervorriefen. Die Rho-GTPase TC10 hatte keinen Einfluss auf die Zelloberfläche. Die Veränderung der Zelloberfläche wurde durch elektronenmikroskopische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen verifiziert: Oozyten zeigten nach Überexprimierung von RhoA eine deutliche Reduktion der Mikrovilli, wohingegen die dominant-aktive Form von RhoG (V12-RhoG) zu einer Verlängerung der Mikrovilli führte. Für die Wirkstärke der Rho-GTPasen, die die Oberfläche in ihrer Wild-Typ Form reduzierten, konnte folgende Rangfolge ermittelt werden: RhoB > RhoA > RhoD > RhoC > Cdc42. In der Gruppe der Rho-Proteine, die eine Vergrößerung der Zelloberfläche bewirken, zeigte RhoE den größten Effekt, gefolgt von Xenopus-RhoG, humanem RhoG und Rac1. Aus den Untersuchungen ging ferner hervor, dass dominantaktive Formen der Rho-GTPasen nicht unbedingt stärker wirken als die Wildtypform. Auch einige dominant-negative Formen führten trotz des inhibierten GDP/GTP-Austausches zu unerwarteten Veränderungen der Zelloberfläche. GTPasen anderer Familien wie Arf1, Arf6 oder Rab5a, für die eine Rolle beim vesikulären Transport gut dokumentiert ist, hatten keinen Einfluss auf die Zelloberfläche. Für die Änderung der Zelloberfläche erwies sich das Vorhandensein eines Cterminalen Lipidankers als essentiell, da Rho-GTPase-Mutanten, die infolge des Fehlens eines kritischen Cysteinrestes nicht mehr isoprenyliert werden können, keine Änderung der Zelloberfläche bewirkten. Die Analyse von RhoB-RhoG-Chimären brachte keine eindeutigen Hinweise auf das Vorhandensein einer für die Zelloberflächenregulation entscheidenden weiterer Region. Sowohl N-terminal- als auch C-terminal-gelegene Sequenzabschnitte waren zur Ausbildung des vollen Effektes notwendig. Identifizierung möglicher RhoA-Effektoren. Die Untersuchung von RhoAEffektormutanten, bei denen die Interaktion mit spezifischen Effektormolekülen durch Mutation in der Effektorregion inhibiert war, ergab, dass die Abnahme der Zelloberfläche weder durch Rhophilin, mDia, Kinectin, Citronkinase oder ROK vermittelt wird. Auch der ROK-Inhibitors Y-27632 konnte den RhoA-Effekt nicht blockieren. Nach diesem Ausschlußverfahren konnte die Proteinkinase N (PKN, PRK) als einziger möglicher Effektor für den durch RhoA ausgelösten Internalisierungsprozeß ermittelt werden. Wechselwirkung zwischen Rho und Aktin. Rho-Proteine gelten als endscheidene Regulatorproteine des Aktinzytoskeletts. Als Reaktion auf bestimmte extrazelluläre Signale kontrollieren diese Proteine Aufbau und Zerfall des Aktins. Untersucht wurde hier der Einfluß der Aktinumstrukturierung auf den Rho-vermittelten Membrantransport. Die das Aktin-Zytoskelett gegensätzlich beeinflussenden Substanzen Cytochalasin B, Cytochalasin D und Phalloidin hatten keinen bzw. nur einen schwachen Effekt auf die Oozyten-Oberfläche. Die Rho-vermittelte Zelloberflächenänderungen wurden von diesen Substanzen nicht blockiert. Dagegen bewirkten die das Aktin-Zytoskelett depolymerisierenden Substanzen Latrunculin A und C2-Toxin eine starke Reduzierung der Zelloberfläche. Die Reduzierung unter Latrunculin A kam auch dann zustande, wenn zuvor RhoE überexprimiert wurde, welches selbst die Zelloberfläche stark vergrößert. Wurde zunächst C2-Toxin in Oozyten injiziert und anschließend RhoE überexprimiert, ergab sich keine Veränderung der Membrankapazität im Vergleich zu einer nicht injizierten Kontrolloozyte. Der Effekt von Latrunculin A wurde blockiert, wenn Rho-GTPasen durch Vorbehandlung der Oozyten mit Rho-spezifischen Toxinen (ToxB und C3- Toxin) inaktiviert wurden. Daraus folgt, dass der Effekt von Latrunculin A und C2-Toxin davon abhängt, dass aktivierbares Rho zur Verfügung steht. Jasplakinolid, eine Aktin stabilisierende Substanz, führt ebenfalls zu einer starken Verringerung der Zelloberfläche, die jedoch durch Toxin-Vorhandlung nicht blockierbar und damit RhoA-unabhängig war. Auswirkung der GAP-Wirkung von ExoS auf die Rho-Aktivität. Die Injektion von ExoS, einem Toxin, das gegenüber Rho GAP-Aktivität aufweist, führt zu einer Vergrößerung der Zelloberfläche. Die GAP-Wirkung von ExoS konnte durch das CNFToxin, daß aufgrund einer Aktivierung von Rho zu einer Verminderung der Zelloberfläche führt, nicht aufgehoben werden. Auch die dominant-aktiven Formen von RhoA (V14-RhoA, Q61-RhoA) konnten die GAP-Wirkung von ExoS nicht blockieren. ExoS kann im Gegensatz zu anderen GTPase-aktivierenden Proteinen eine Interaktion mit der deamidierten Form von Rho eingehen und somit den Aktivitätszustand durch GTPHydrolyse beenden. Wechselwirkung zwischen Bordetella Dermonekrose-Toxin (DNT) und Rho. Die biologische Wirkung von DNT resultiert aus einer Deamidierung und Transglutaminierung von Rho-GDP nach Freisetzung von GDI. Aufgrund dieser Modifikationen kommt es zum Verlust der GTP-Hydrolyse-Aktivität und somit zur Bildung einer konstitutiv-aktiven Form von Rho. In Zusammenarbeit mit Prof. Aktories (Pharmakologisches Institut, Freiburg), gelang es, die Aminosäure Lysin als ein weiteres Substrat neben Spermidin und Putrescin für den Transglutaminierunsprozeß des Toxins DNT zu identifizieren.