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Molekulare Werkzeuge können in der Wissenschaft unter anderem dazu verwendet werden, biochemische Prozesse gezielt zu untersuchen, um sie somit besser zu verstehen. Dabei handelt es sich zum Beispiel, um kleine chemische Moleküle, die gezielt für ihr Anwendungsgebiet konzipiert worden sind. Mit Ihnen lassen sich z.B. Interaktionen zwischen (Makro-)Molekülen regulieren, chemische Gleichgewichte lokal verändern oder auch Botenstoffe zielgerichtet freisetzen. Die Effekte dieser temporären Einwirkung auf verschiedenste biologische Systeme können hilfreiche Erkenntnisse struktureller, funktioneller oder systematischer Art für die entsprechenden Forschungsgebiete liefern.
Um die interdisziplinären Problemstellungen zielgerichtet mit den entsprechend zugeschnittenen Werkzeugen zu adressieren, ist es dabei jedoch absolut notwendig, dass ein umfassendes und über die Grenzen der jeweiligen Fachgebiete hinaus gehendes Verständnis der jeweiligen Fragestellungen entwickelt wird.
Viele der bisher bekannten Werkzeuge benötigen für ihren Einsatz bis heute noch relativ harsche Reaktionsbedingungen, haben ein eingeschränktes Anwendungsfeld oder lassen sich nicht ausreichend Zeit- & Ortsaufgelöst „aktivieren“. Die Möglichkeit Licht als externes Trigger-Signal zu verwenden, um die entsprechenden molekularen Werkzeuge zu aktivieren (oder auch zu deaktivieren), überwindet genau diese Defizite und bringt neben der hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung noch viele weitere Vorteile mit sich. Im Rahmen meiner Doktorarbeit ist es mir gelungen gemeinsam mit meinen Kooperationspartnern neue lichtaktivierbare molekulare Werkzeuge von Grund auf zu designen, zu synthetisieren, sie auf ihre photochemischen Eigenschaften zu untersuchen und sie anzuwenden. Durch die interdisziplinäre Zusammenarbeit mit Doktoranden aus der Organischen, Theoretischen und Physikalischen Chemie, konnte ein umfassendes Bild dieser neuen Substanzklassen aufgezeigt werden. Die verschiedenen Arten lichtaktivierbarer Werkzeuge sollen im Verlauf dieser Arbeit genauer herausgearbeitet werden. Generell kann man in drei grundlegenden Klassen von lichtaktivierbaren Werkzeugen unterscheiden: 1. irreversibel photolabile Schutzgruppen, 2. photoaktivierbare Label und 3. reversibel lichtschaltbare Photoschalter.
Auf dem Gebiet der photolabilen Schutzgruppen, auch photoaktivierbare Schutzgruppen oder Photocages genannt, ist es uns gelungen eine neue Spezies von Molekülen zu identifizieren, die dazu in der Lage sind, nach photochemischer Anregung eine spezifische Bindung innerhalb ihres molekularen Gerüsts zu spalten. Möglich gemacht wurde dies, indem wir den sog. „uncaging Prozess ganz neu gedacht“ haben und mit der Unterstützung von Theorie und Spektroskopie unsere Ergebnisse in einer Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studie (SAR) festhalten konnten. Aus einer Substanzbibliothek von diversen theoretisch berechneten Kandidaten, wurden die vielversprechendsten Verbindungen anschließend synthetisiert und photochemisch charakterisiert. Nach initialen Untersuchungen und den daraus hervorgehenden Erkenntnissen, wurden weitere molekulare Struktur auf die Optimierungen der photochemischen Eigenschaften hin theoretisch berechnet und anschließend im Labor realisiert. Daraus resultierend entwickelten wir einen Photocage, der mit einer hohen Quantenausbeute mit Licht von über 450 nm photolysierbar ist und ebenfalls dazu in der Lage ist Neurotransmitter wie z.B. Glutamat zielgerichtet und lichtaktiviert freizusetzen. Eine weitere Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studie wurde im Rahmen dieser Arbeit mit dem Isatin-Gerüst als potentiell neue photolabile Schutzgruppe durchgeführt.
Ebenfalls konnten in einer dritten Studie auf dem Gebiet der photolabilen Schutzgruppen Untersuchungen am Coumarin-Grundgerüst zeigen, dass eine systematische Einschränkung der Relaxationspfade im Molekül eine Verbesserung der photochemischen Eigenschaften mit sich bringen kann.
Photoaktivierbare Label werden in den verschiedensten Bereichen der Wissenschaft angewendet. Meist erlauben jedoch die chemischen Moleküle nur eine begrenzte „Beobachtungszeit“ der biochemischen Prozesse aufgrund der effizienten und damit schnellen Relaxationspfade zurück in den Grundzustand. Zu Beginn der durchgeführten Untersuchungen, bestand unsere Idee darin, die selektive Prä-IR-Anregung mit Hilfe eines UV/vis-Pulses (entsprechend der VIPER-Spektrokopie) in ein langlebiges Triplett-Signal eines geeigneten Chromophors zu überführen, welches anschließend für die Beobachtung vergleichsweise lang-lebiger biochemischer Prozesse verwendet werden könnte. Aus dieser Idee heraus entwickelten wir einen Chromophor, der neben einer Absorption im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums, zusätzlich eine IR-adressierbare funktionelle Gruppe, sowie die Eigenschaft, ein effizientes Inter-System-Crossing (ISC) nach photochemischer Anregung durchzuführen, besaß. Zu unserem Erstaunen zeigte dieses Derivat jedoch nach erfolgreicher Synthese nicht das erwartete Verhalten. Ein weiteres Beispiel für die hochgradige Komplexität der Photochemie.
Mit Hilfe von theoretischen und spektroskopischen Methoden konnten dennoch viele hilfreiche Erkenntnisse aus dieser Studie für zukünftige Untersuchungen aufgedeckt werden.
Ebenso war es während meiner Promotion eines der Ziele, den Schaltprozess des sog. Fulgid-Photoschalters genauer zu untersuchen und somit besser zu verstehen. Hierbei handelt es sich um ein ausgesprochen beständiges, photochemisch reversibel schaltbares Molekül, auch wenn dies vielleicht auf den ersten Blick ein Widerspruch in sich zu sein scheint. Es gelang uns diesen Photoschalter, genauer gesagt seine Photo-Isomere, auf dem Gebiet der chemischen Aktinometrie zu etablieren.
Dafür waren zahlreiche Messungen diverser Reaktivitäten (photochemische Reaktions-Quantenausbeuten) in verschiedenste Wellenlängenbereiche vom Nah-UV-Bereich bis hin zur 700 nm Grenze erforderlich. Außerdem wurden alle Werte mit der Referenzmessung einer Photodiode bzw. je nach Wellenlängenbereich auch mit der klassischen Ferri-Oxalat-Aktinometrie verglichen. Im Anschluss daran fokussierte ich mich weiter auf die einzelnen Photo-Isomere und ihre einzigartige chemische Struktur. Mit Hilfe der chiralen HPLC gelang es uns die einzelnen Photo-Isomere voneinander zu isolieren und diese mit verschiedensten photochemischen und theoretischen Methoden „genauer unter die Lupe“ zu nehmen. Die aus dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse bereiten den Weg für diverse, zukünftige spektroskopische Anwendungen dieses Photoschalters.
Nukleinsäuren und Proteine bilden zusammen mit den Kohlenhydraten und Lipiden die vier großen Gruppen der Biomoleküle. Dabei setzen sich Nukleinsäuren aus einer variierenden Abfolge von Nukleotiden zusammen. Gleiches trifft auf die Proteine zu, wobei deren Bausteine als Aminosäuren bezeichnet werden. Die Reihenfolge der Bausteine bestimmt zusammen mit der Interaktion, die die einzelnen Bestandteile untereinander eingehen, deren Funktion. Um deren Wirkungsweise verstehen und nachverfolgen zu können, wurden unterschiedliche Methoden entwickelt, zu welchen auch die EPR-Spektroskopie gehört.
Durch den Einbau modifizierter Nukleotide oder Aminosäuren lassen sich Spinlabel in die sonst EPR-inaktiven Nukleinsäuren und Proteine einführen. Diese Marker lassen sich grundsätzlich in drei Klassen unterteilen (Metallionen, Nitroxidradikale und TAMs), weisen aber immer mindestens ein ungepaartes Elektronenpaar auf. Die Festphasensynthese ist eine Standardprozedur zur Herstellung von markierten Nukleinsäuren und Proteinen. Allerdings führen die Bedingungen dieser Methode zumindest teilweise zur Zersetzung der Nitroxidradikale, die dieser Arbeit zugrunde liegen, wenn sie direkt während der Synthese eingebaut werden. Der direkte Einbau ist aber in vielen Fällen essenziell, um bestimmte Eigenschaften zu erzielen.
Um den Abbau des Nitroxidradikals während der Festphasensynthese zu verhindern, kann dieses vorübergehend mit einer Schutzgruppe versehen werden, welche sich anschließend wieder abspalten lässt.
Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt hierbei auf der Darstellung neuer photolabil geschützter Spinlabel zur Synthese markierter Proteine und Nukleinsäuren.
Basierend auf den Nukleotiden Uridin und Cytidin konnten zwei für die RNA-Synthese vorgesehene Phosphoramidite synthetisiert werden, welche jeweils an der 5-Position des Pyrimidinrings mit einem photolabil geschützten Spinlabel auf Basis von TPA versehen waren. Durch Einbau des Uridinderivats in das Neomycin-Aptamer konnte zudem der Einfluss der Spinlabel auf die lokale Struktur mit Hilfe von in-line probing gezeigt werden.
Der gleiche TPA-Label konnte ebenfalls mit einem Lysin gekuppelt werden, welches später über ein orthogonales tRNA/Aminoacyl-tRNA Synthetase Paares in eine Polypeptid eingebaut werden sollte. In Kooperation mit dem AK Grininger ist auch ein nicht geschützter Spinlabel zur kupferfreien Markierung der Fettsäuresynthase entstanden. Abschließend war noch die Synthese eines auf Phenylalanin basierenden photolabil geschützten Spinlabel in Arbeit, welcher jedoch nicht beendet werden konnte. Dieser sollte mittels Festphasensynthese einbaubar sein, weswegen er am N-Terminus mit Fmoc geschützt ist.
Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von molekularen Systemen, die aus mehreren Chromophoren bestehen und über einen Zweiphotonen-Prozess aktiviert werden können.
Die Zweiphotonen-Absorption (2PA) beschreibt die nahezu simultane Absorption zweier Photonen, deren Summe die Energie ergibt, die für den entsprechenden elektronischen Übergang nötig ist. Da für die Anregung somit zwei niederenergetische Photonen benötigt werden, kann für die 2PA Nahinfrarot-Licht (NIR-Licht) verwendet werden, welches eine geringe Phototoxizität aufweist und eine tiefe Gewebedurchdringung ermöglicht. Weiterhin wird durch die intrinsische dreidimensionale Auflösung der 2PA eine hohe Ortsauflösung der Photoaktivierung erzielt.
Photolabile Schutzgruppen (PPGs) bzw. Photocages sind chemische Verbindungen, die der vorübergehenden Maskierung der biologischen Funktion eines (Makro-)Moleküls dienen. Sie können durch Licht geeigneter Wellenlängen abgespalten werden (uncaging), wodurch die Aktivität des geschützten Substrats wiederhergestellt wird. Leider weisen viele der etablierten PPGs schlechte Zweiphotonen-Eigenschaften auf. Um die 2P-Aktivität einer PPG zu erhöhen, kann sie kovalent mit einem guten Zweiphotonen-Absorber verknüpft werden, der bei Bestrahlung das Licht über einen Zweiphotonen-Prozess absorbiert und anschließend mittels Energietransfer auf die photolabile Schutzgruppe überträgt. Dies führt schließlich zur Uncaging-Reaktion.
Im Zuge von Projekt I dieser Dissertation wurde eine solche molekulare Dyade für verbessertes Zweiphotonen-Uncaging bestehend aus einem Rhodamin-Fluorophor als Zweiphotonen-Absorber und einem Rotlicht-absorbierenden BODIPY als photolabile Schutzgruppe hergestellt und charakterisiert. Die Zweiphotonen-Aktivität des Fluorophors wurde mittels TPEF-Messungen (two-photon excited fluorescence) untersucht. Anschließend wurde das Rhodamin an einen 3,5-Distyryl-substituierten BODIPY-Photocage gekuppelt. Der Energietransfer innerhalb dieser Dyade wurde mithilfe von transienter Ultrakurzzeit-Spektroskopie und quantenmechanischen Berechnungen untersucht. Die Freisetzung der Abgangsgruppe para-Nitroanilin (PNA) bei Belichtung der Dyade konnte sowohl nach Einphotonen-Anregung des Rhodamins als auch des BODIPYs mithilfe von UV/vis-Absorptionsmessungen qualitativ nachgewiesen werden.
Da die Uncaging-Reaktion allerdings nicht besonders effektiv war, wurde für die Weiterführung des Projekts ein neuer BODIPY Photocage, der eine verbesserte Photolyse-Effizienz und eine höhere Photostabilität aufwies, verwendet und erneut an einen Rhodamin-Fluorophor geknüpft. Anhand dieser optimierten Dyade konnte die Einphotonen-Photolyse quantifiziert, d.h. eine Uncaging-Quantenausbeute für die Freisetzung von PNA bestimmt werden. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Photolyse der Dyade mit einer deutlichen Änderung ihrer Fluoreszenzeigenschaften einherging. Dies ermöglichte einen Nachweis des Zweiphotonen-Uncagings mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops. Die Dyaden-Moleküle wurden zur Immobilisierung in Liposomen eingeschlossen und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop belichtet. Sowohl nach Einphotonen- als auch nach Zweiphotonen-Anregung der Rhodamin-Einheit konnte die gewünschte Fluoreszenzänderung beobachtet und somit das Uncaging bestätigt werden.
In Projekt II der Dissertation wurde ein photoaktivierbarer Fluorophor (PAF) hergestellt. PAFs liegen in ihrer geschützten Form dunkel vor. Durch die Aktivierung mit Licht können sie Fluoreszenzsignale emittieren. Sie liefern somit ein direktes Feedback über die Lichtverteilung und –intensität innerhalb einer Probe und werden somit unter anderem für die Charakterisierung und Optimierung von Belichtungsapparaturen verwendet. Besonders wünschenswert ist hierbei eine Fluoreszenzaktivierung mit sichtbarem Licht bzw. mit NIR-Licht über einen Zweiphotonen-Prozess.
Im Zuge der Arbeit wurde ein Rhodamin-Derivat synthetisiert, das durch die Anbringung eines DEACM450-Photocages in seine nichtemittierende Form gezwungen wurde. Bei Bestrahlung mit 455 nm konnte die Abspaltung der Cumarin-Schutzgruppe und der damit verbundene Anstieg der Rhodamin-Fluoreszenz beobachtet und eine Uncaging-Quantenausbeute bestimmt werden. Für die Untersuchung der Zweiphotonen-Photolyse wurde der geschützte Fluorophor in einem Hydrogel immobilisiert und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Anschließend wurden Fluoreszenzbilder vor und nach Photoanregung von bestimmten Regionen des Hydrogels aufgenommen. Durch das Uncaging der Probe konnten helle, definierte Muster geschrieben und ausgelesen werden. Die Photoaktivierung führte dabei sowohl über die Einphotonen-Anregung mit blauem Licht (488 nm) als auch über die Zweiphotonen-Anregung mit NIR-Licht (920 nm) zur Generierung von stabilen, gleichmäßigen Fluoreszenzmustern mit hohem Kontrast.
Einfache elektrochemische Methode zur Bestimmung von Chlorit in wässrigen und nicht-wässrigen Systemen Stoffe bzw. Verbindungen, welche nachweislich krebserregend oder fruchtbarkeitsschädigend sind, werden seit Jahren, insbesondere durch die WHO, streng reguliert. Zu diesen Stoffen zählt u. a. Chlorit, welches als Abbauprodukt in Desinfektionsmitteln, Poolwassern und im Rahmen von organischen Oxidationsprozessen vorkommt. Im Rahmen des Projektes sollte eine elektrochemische Methode zu Detektion von Chlorit in wässrigen und organischen Proben entwickelt werden, wobei auf eine Glaskohlenstoffelektrode in Kombination mit Li [NTf]2 im Wässrigen und [Bmpyrr][NTf]2/MeOH im Organischen als Elektrolyten zurückgegriffen wurden.
Bei der Methodenentwicklung wurde auf Differentielle-Puls-Voltammetrie zurückgegriffen, da diese im Vergleich zum Cyclovoltammetrie deutlich empfindlicher ist. Die Methodenvalidierung nach ICH-Guidelines konnte erfolgreich durchgeführt werden Dabei konnte im Wässrigen eine Nachweisgrenze von 0.07 mg L-1 (Organisch: 0.20 mg L-1) erhalten werden. Beide lagen deutlich unter den WHO-Grenzwerten von 0.7 mg L-1. Die Selektivität/Interferenz wurde gegenüber den übrigen Chlor-Spezies getestet; für alle Spezies, außer Hypochlorit, konnten für die Wiederfindungsrate von Chlorit Werte nahe 100% erhalten werden. Die entwickelte Methode konnte erfolgreich auf wässrige (Poolproben, Desinfektionsmittel) und organische Proben (aus Pinnick-Synthesen) angewendet werden. Insbesondere durch die Anwendung im Bereich der Pinnick-Oxidation war der Sensor für mögliche In-Line-Analytik geeignet. Bei den organischen Proben konnte zudem die ionische Flüssigkeit zu 92% zurückgewonnen werden, was den Elektrolyten in Hinblick auf Nachhaltigkeit und Wirtschaftlichkeit noch attraktiver macht.
Entwicklung ionenchromatographischer Methoden zur Detektion von Chloroxo-Spezies
Der Bedarf an schnellen, kostengünstigen Analysemethoden, welche den Vorgaben der einzelnen Behörden weltweit entsprechen, ist in den letzten Jahren enorm gestiegen. Im Rahmen des Projektes sollte eine ionenchromatographische Methode (IC) entwickelt werden, welche neben den Chloroxo-Spezies (Chlorid, Hypochlorit, Chlorit, Chlorat und Perchlorat) auch die bekannten Standardionen (Fluorid, Bromid, Nitrat, Phosphat, Sulfat, Iodid) nachweisbar macht. Zunächst gelang es, die Methodenparameter zu optimieren und so die Chloro-Spezies, außer Hypochlorit, von den übrigen Standardanionen innerhalb von 50 Minuten vollständig zu trennen. Die Methode konnte in der weiteren Entwicklung sogar noch um die Detergenzien-Anionen Acetat, Formiat, Oxalat und Tartrat erweitert werden. (ASupp 7, 45 °C, 0.8 mL min-1, 6 mmol L-1 Na2CO3 / 1 mmol L-1 NaHCO3 + 10% Acetonitril). Auch alle notwendigen Validierungsparameter konnten erfolgreich bestimmt werden. Zuletzt war es möglich, erfolgreich unterschiedliche Realproben zu vermessen.
Da ein Nachweis von Hypochlorit mittels IC nicht möglich war, wurden weitere Anstrengung unternommen, dieses Anion mittels IC-PCR (Nachsäulenderivatisierung) nachzuweisen. Als Detektionsprinzip wurde dabei auf eine Bromat-Nachweis-Methode mittels UV/VIS zurückgegriffen, welche im Rahmen des Projektes angepasst wurde. Da davon ausgegangen werden muss, dass das Hypochlorit mit reaktiven Stellen innerhalb des Säulenmaterials reagiert und somit nicht mehr detektiert werden kann, wurden Passivierungsexperimente an der Vorsäule und Säule für 24 h mit einer Hypochlorit-NaOH-Mischung durchgeführt. Nach 60 Stunden Passivierung konnten erstmals reproduzierbare Ergebnisse bei dem Nachweis von OCl- erhalten werden. Zuletzt konnten erfolgreich fünf unterschiedliche Realproben vermessen und der Hypochlorit-Gehalt mit bisher angewandten Methoden verglichen werden, wobei die erhaltenen Werte in der gleichen Größenordnung lagen.
Entwicklung eines Sensors unter Verwendung der Viologen-Grundstruktur auf metallischen Oberflächen
Früher fanden Viologene und deren Derivate Anwendung im Bereich der Schädlingsbekämpfung und wurden hauptsächlich als Kontaktherbizid verwendet. Mittlerweile hat sich das Anwendungsspektrum der Viologene deutlich verändert, u.a. werden die in organischen Redox-Fluss-Batterien als Elektrolyte eingesetzt. Im Rahmen diesen Projekts wurden mehrere bekannte Viologen-Grundkörper (u. A. Methylviologen (MV)) vollständig elektrochemisch charakterisiert Im Anschluss wurde MV mit unterschiedlichen Ankergruppen (Thiol-, Sulfonat, -Phosphonat-, Carboxylanker) modifiziert und auf metallische Oberfläche (u. A. Gold und Kupfer) abgeschieden mit dem Ziel ein neues Sensor-Motiv für die Analytik zu entwickeln. Der Thiolanker konnte erfolgreich auf Gold, der Carboxylanker erfolgreich auf Kupfer abgeschieden werden. Die anschließenden elektrochemischen Untersuchungen der abgeschiedenen Monolagen ergaben jedoch eine geringe Stabilität der Anker in wässriger und organischer Umgebung, sodass in Zukunft weitere Anstrengungen unternommen werden müssen, die Stabilität des Viologensystems auf der Oberfläche zu verbessern.
Der Fokus der Arbeit liegt auf der Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Molekülen in selbst-anordnenden Monolagen (SAMs) auf Goldoberflächen mittels Rastertunnelmikroskopie und komplementären Methoden wie z.B. Infrarot-Reflektions-Absorptions-Spektro-skopie.
In dieser Arbeit wurde das kürzlich etablierte Konzept von eingebetteten Dipolmomenten in aromatischen, SAM-bildenden Molekülen eingehender untersucht. Das Ausmaß des Dipol-moments und die Größe der SAM-bildenden Moleküle wurden synthetisch variiert und der Einfluss auf die Struktur und elektronischen Eigenschaften der SAMs untersucht. Binäre, gemischte Monolagen aus SAM-bildenden Molekülen mit "entgegen gerichteten", Dipolmomenten wurden hergestellt und charakterisiert. Zur Herstellung der binären, gemischten Monolagen wurden zwei Methoden verwendet: die Monolagen wurden a) aus bereits gemischten Lösungen der Moleküle abgeschieden oder b) eine reine SAM in die Lösung des anderen Moleküls eingelegt, so dass ein Austausch stattfand. Der Vergleich der beiden Methoden ermöglicht Rückschlüsse über die Abscheidungsprozesse. Die Charakterisierung der SAMs dieser Mischungsreihen gab Aufschluss über Eigenschaften wie Packungsdichte, Austrittsarbeit, elektronischen Ladungstransport in Monolagen und Orientierung der Moleküle relativ zur Oberfläche und erlaubte Schlussfolgerungen über die Mischbarkeit und das Ausmaß der Dipolwechselwirkungen der Moleküle in der Monolage. In einem ähnlichen Ansatz zu dem oben beschriebenen Vorgehen wurden Quadrupolwechselwirkungen zwischen SAM-bildenen, Benzol-, Naphtalin- und Anthracenderivaten untersucht. In Mischungsreihen wurden SAMs von nicht- und teilweise (hoch)fluorierten, SAM-bildenden Molekülen auf Goldoberflächen charakterisiert. Die Ergebnisse der Untersuchungen können bei der gezielten Einstellung der elektronischen Eigenschaften in elektronischen Bauteilen wie OFETs Anwendung finden.
In einem weiteren Projekt wurde der Einfluss von polaren Endgruppen auf die in situ Abspaltung von Schutzgruppen an Terphenylthiol-Derivaten untersucht, wobei die Ergebnisse zum Aufbau größerer, aus organischer Elektronik bestehender, Netzwerke verwendet werden können.
From the leaf exudate of Aloe lateritia ENGLER the C-glucosyl com pounds homonataloin, aloeresin A and aloesin (synon. aloeresin B) were isolated together with the anthraquinone nataloeem odin-8-methylether and spectroscopically identified. Hom onataloin, widely distributed in Aloe species, was separated into homonataloin A and B by combined TLC and DCCC. In their 1 D and 2D 1H NMR spectra only the shifts of the 2′-hydroxyl protons of both glucosyl residues differ significantly, indicative of 10 S (A) resp. 10 S (B) configurations. In both com pounds the anthrone is in β-position of the D-glucopyranosyl, as determined by the large coupling constants of the anomeric protons. The 13C NMR signals are unambiguously assigned by the use of DEPT, APT and gated-decoupling methods. Only the chemical shifts of C -11 and C -14 show significant differences between both diastereomers due to the adjacent 2′-sugar hydroxyls. The two homonataloins differ mostly in optical rotation and circulardichroism due to different configurations at C - 10 of the anthrone part. The absolute configurations of the diastereomers are determined by correlation of their CD spectra with the CD spectra of the structural analogues 7-hydroxyaloins A and B, which shows that hom onataloin A is the 10 S, 1′S-compound and that homonataloin B has 10 R, 1′S-configuration.
Nukleäre Rezeptoren (NRs) sind ligandengesteuerte Transkriptionsfaktoren, die sich aus einer Superfamilie von 48 humanen Mitgliedern zusammensetzt. Seit vielen Jahrzehnten stellen sie ein attraktives Forschungsgebiet für die Arzneistoffentwicklung dar, da sie eine bedeutende Rolle in zahlreichen Prozessen unseres Körpers spielen. Das Ziel dieser Forschungsarbeit bestand darin, neue innovative Liganden für den Peroxisomen-Proliferator-aktivierter-Rezeptor γ (PPARγ) sowie die Waisenrezeptoren Nervenwachtumsfaktor induzierter Klon B (Nur77) und Neuronen-abgeleiteter Waisenrezeptor (NOR-1) zu identifizieren.
Bei den Rezeptoren Nur77 und NOR-1 handelt es sich um noch unzureichend erforschte NRs der NR4A-Familie. Es fehlt insbesondere an Modulatoren dieser Rezeptoren als Werkzeuge, um ihr zum Teil noch unentdecktes Potential zu erforschen. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein in vitro Screening durchgeführt und eine Arzneistoff-Fragment-Bibliothek mit 480 Fragmenten, die aus bekannten strukturellen Motiven zugelassener Arzneimittel stammen, auf ihre modulatorische Aktivität an Nur77 und NOR-1 gescreent. Durch das Screening und weitere Testungen konnten jeweils für Nur77 und für NOR-1 drei Verbindungen als Liganden identifiziert werden. Bei der weiteren Charakterisierung stellte sich insbesondere 41 als besonders vielversprechenden Ausgangspunkt für die Entwicklung von Liganden für Nur77 und NOR-1 heraus, der ein besseres Verständnis für die invers agonistische Aktivität lieferte und die Möglichkeit für eine agonistische Modulation aufzeigte. Zudem konnte durch ein weiteres Screening mit Computer-gestützten Verfahren auf Nur77 der Chemotyp von 41 noch weiter optimiert werden und führte zur Identifizierung von Verbindung 68 (EC50 = 2 ± 1 μM). Diese zeichnete sich durch eine hohe Potenz aus, die zu einer beachtenswerten Aktivierung von Nur77 (169 ± 18% maximale Aktivierung) führte. Die Untersuchung der strukturellen Erweiterung von 43 (IC50 = 47 ± 8 μM) führte zur Verbindung 75, die eine 3,5-fache Steigerung des inversen Agonismus auf NOR-1 zeigte. Die Erkenntnisse dieser Entdeckung ermöglichte den Rückschluss, dass das Einführen von voluminösen Resten, wie Brom oder Phenyl eine invers agonistische Potenz im unteren mikromolaren Bereich bewirkte. Die Identifizierung der Verbindungen 41 und 68 für Nur77 sowie 43 und 76 für NOR-1 könnten dazu beitragen, ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen hinter der Aktivierung von Nur77 und NOR-1 zu erlangen und einen vielversprechenden chemischen Ausgangspunkt für die Entwicklung von noch wirksameren und selektiveren Liganden bieten.
Im anderen Teil dieser Forschungsarbeit stand die Synthese eines selektiven allosterischen PPARγ-Liganden im Fokus, um mit diesem die allosterische Modulation von PPARγ zu charakterisieren. Den Ursprung der Idee lieferte Garcinolsäure, dass in der Lage ist, PPARγ orthosterisch und allosterisch zu binden. Aufgrund der komplexen biologischen Effekte und der geringen synthetischen Zugänglichkeit konnte 37 nicht als Ausgangspunkt für dieses Vorhaben dienen. Auf der Suche nach einer geeigneten Ausgangsverbindung wurde durch ein in vitro Screening mit einer hauseigenen Sammlung von synthetischen PPARγ-Modulatoren, bei dem die orthosterische Bindungsstelle von PPARγ durch den irreversiblen Antagonisten GW9662 blockiert wurde, Verbindung 39 identifiziert. Diese ist wie 37 in der Lage PPARγ ortho- und allosterisch zu binden, weist aber eine bessere synthetische Zugänglichkeit auf. Die Co-Kristallisation von 39 mit der PPARγ-Ligandenbindungsdomäne zeigte, dass die orthosterische Bindungstasche (BT) keinen Platz für eine Verlängerung des Moleküls bietet, die allosterische BT ist dagegen Lösungsmittel exponiert, wodurch eine Verlängerung möglich schien. Daraufhin wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Verlängerung von 39 eine orthosterische Bindung verhinderte und dadurch eine selektive allosterische Bindung ermöglichen könnte. Aus diesem Grund wurde eine modifizierte Struktur von 39 verwendet, um eine einfache Einbringung eines Linkers in das Molekül zu ermöglichen. Durch verschiedenste Modifikationen und Anpassungen wurde 104 als potenzieller selektiver allosterischer Ligand synthetisiert. Die Testung von 104 im Reportergenassay zeigte eine schwache Aktivierung von PPARγ allein, jedoch offenbarte sich bei der Kombination mit dem orthosterischen Agonisten Pioglitazon eine dosisabhängige Steigerung der Aktivität von PPARγ. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass trotz der Bindung von 104 eine Bindung von 33 in die orthosterische BT immer noch möglich war. Diese Annahme konnte anschließend auch durch zellfreie Experimente (Isotherme Titrationskalorimetrie, MS-basierte-PPARγ-Ligandenbindungs-Assay) bestätigt werden. Der eindeutige Beweis für die selektive allosterische Bindung von 104 lieferte die Co-Kristallisation von 104 mit der PPARγ-LBD. Zusätzlich offenbarte sich, durch den strukturellen Vergleich der Bindungsmodi von anderen PPARγ-Liganden, der außergewöhnliche Bindungsmodus von 104, da 104 im Vergleich zu anderen Liganden selektiv die allosterische BT, ohne Überlappung in die orthosterische BT, besetzte. Weitere Untersuchungen, wie der Einfluss von 104 auf die Rekrutierung von Co-Regulatoren, die Differenzierung von adipozytären Stammzellen und die Genexpression zeigten eine bisher einmalige Modulation von PPARγ, die auf die selektive allosterische Modulation zurückzuführen war. Mit 104 wurde ein innovatives und vielfältig einsetzbares Werkzeug zur Erforschung der allosterischen Modulation von PPARγ entdeckt, dessen Geschichte an diesem Punkt noch nicht zu Ende ist.
The absolute configurations of the diastereomeric 10-hydroxyaloins, which may be regarded as parent structures for other naturally occurring oxanthrone-C-glucosyls, have been established as 10R, 16 R (A) and 10 S, 16 R (B) by an X-ray structure analysis of the A-octaacetyl derivative (C 16 is the anomeric glucosyl carbon atom). The determination was confirmed by CD spectroscopic comparison with the structural analogues aloins A and B, which should prove useful for making future configurational assignments within this class of compounds. A conformational analysis by the use of a molecular modeling method based on force-field calculations reveals the presence of an extra- and an intra-form, the extra-form of which is energetically preferred.