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A widespread application of 3D bioprinting in basic and translational research requires accessibility to affordable printers able to produce physiologically relevant tissue models. To facilitate the use of bioprinting as a standard technique in biology, an open-source device based on a consumer-grade 3D stereolithography apparatus (SLA) printer is developed. This SLA bioprinter can produce complex constructs that preserve cell viability and recapitulate the physiology of tissues. The detailed documentation of the modifications apported to the printer as well as a throughout performance analysis allow for a straightforward adoption of the device in other labs and its customization for specific applications. Given the low cost, several modified bioprinters could be simultaneously operated for a parallelized tissue production. To showcase the capability of the bioprinter, constructs consisting of patient-derived cholangiocarcinoma organoids encapsulated in a gelatin methacrylate (GelMA)/polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) hydrogel are produced. A thorough characterization of different GelMA/PEGDA ratios reveals that the mechanical properties of the bioprinted tumor model can be accurately fine-tuned to mimic a specific tumor micro-environment. Immunofluorescence and gene expression analyses of tumor markers confirm that the bioprinted synthetic hydrogel provides a flexible and adequate replacement of animal-derived reconstituted extracellular matrix.
DNA translocators of natural transformation systems are complex systems critical for the uptake of free DNA and provide a powerful mechanism for adaptation to changing environmental conditions. In natural transformation machineries, outer membrane secretins are suggested to form a multimeric pore for the uptake of external DNA. Recently, we reported on a novel structure of the DNA translocator secretin complex, PilQ, in Thermus thermophilus HB27 comprising a stable cone and cup structure and six ring structures with a large central channel. Here, we report on structural and functional analyses of a set of N-terminal PilQ deletion derivatives in T. thermophilus HB27. We identified 136 N-terminal residues exhibiting an unusual ααβαββα fold as a ring-building domain. Deletion of this domain had a dramatic effect on twitching motility, adhesion, and piliation but did not abolish natural transformation. These findings provide clear evidence that the pilus structures of T. thermophilus are not essential for natural transformation. The truncated complex was not affected in inner and outer membrane association, indicating that the 136 N-terminal residues are not essential for membrane targeting. Analyses of complex formation of the truncated PilQ monomers revealed that the region downstream of residue 136 is required for multimerization, and the region downstream of residue 207 is essential for monomer stability. Possible implications of our findings for the mechanism of DNA uptake are discussed.
A method which serves to isolate the gonads from the sea cucumber (Holothuria polii) is outlined. Criteria that will secure a well determined status of maturity of the sperm are given. From this preparation a deoxyribonucleic acid is made, purified and analysed. It is concluded that the analytical data are in compliance with the theory of Crick and Watson. The ratio of Moles for this DNA while its nitrogen to phosphorus ratio on weight basis is 1,67.
Untersuchungen über die Redox-Eigenschaften der Haut nach Bestrahlung mit ultraviolettem Licht
(1959)
Eingehendere Untersuchungen über die mit Hilfe der Nadi - Reaktion nachweisbaren erhöhten Oxydationswirkungen an uv-bestrahlten Hautstellen führten zur Feststellung, daß eine Erhöhung der Peroxydase-Wirkung in Verbindung mit Vermehrung der peroxydischen Eigenschaften als Ursache anzusprechen ist. Aktivierung der Tyrosinase im bestrahlten Gebiet wurde sowohl an der albinotischen Mäusehaut als auch bei Froschschwimmhäuten nachgewiesen. Wellenlängen-Abhängigkeit und Bedeutung als Primäreffekt der UV-Strahlen werden diskutiert.
Die soziale Arbeitsteilung bei Honigbienen ist ein komplexes selbstorganisatorisches System, welches auf zwei Ebenen der biologischen Organisation zu verorten ist: dem Individuum und der Kolonie. Die Regulation der Bruttemperatur ist ebenfalls diesen Gesetzmäßigkeiten unterworfen. Die Arbeits-bereitschaft einzelner Bienen bildet die Grundlage für die Temperaturregulierung des kolonialen Brutnestes.
In dieser Arbeit wird dieses Zusammenspiel aus individuellen Beteiligungen der Arbeiterinnen sowie der erbrachten Gesamtleistung der Kolonie während des Brutwärmens untersucht. Dazu wird eine kleine Bienengruppe auf einer Brutwabe einer thermischen Belastung ausgesetzt. Ein speziell für diese Untersuchungen entwickelter Versuchsaufbau integriert erstmals die Infrarot-Thermografie mit den Temperaturmessungen einer Brutfläche. Somit ist es möglich, die Thoraxtemperaturen der einzelnen, am Brutwärmen beteiligten Arbeiterinnen störungsfrei zu messen und gleichzeitig das erzeugte räumliche und zeitliche Temperaturmuster der Brutwabe zu ermitteln. Zusätzlich wird der Temperaturverlauf der Außentemperatur sowie der zellumgebenden Luft untersucht.
Es kann gezeigt werden, dass die Lufttemperatur im Innenraum eines Bienenstocks ein wichtiger Faktor in der Temperaturregulierung des Brutnestes ist, da sie die untere Temperaturgrenze im Bienenstock bildet. Weiterhin wird der Einfluss der brutwärmenden Arbeiterinnen auf die Temperaturentwicklung einer Brutfläche sichtbar. Durch das flexible Verhalten der Arbeiterinnen kann einer Brutfläche bei thermischer Belastung durch lokal wechselndes Brutwärmen optimal Wärme zugeführt werden. Es gibt es Hinweise auf eine zyklische Periodizität im zeitlichen Temperaturverlauf der Brutzellen, welche auf einen Brutwärmrhythmus durch die Bienen schließen lässt. Durch den Einsatz zweier Unterarten (Apis mellifera carnica & Apis mellifera mellifera) wird sichtbar, dass es zwischen den Gruppen Unterschiede in der Aufrechterhaltung der Lufttemperatur über der Wabe gibt.
Der Verzehr von radioaktiv belasteten Pilzfruchtkörpern stellt ein Gesundheitsrisiko für den Menschen dar und auch fast 35 Jahre nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986 sind Pilze aus Waldökosystemen zum Teil noch stark durch das ausgetretene radioaktive 137Cs belastet. Die Einschätzung der Belastung und somit des Gesundheitsrisikos ist aufgrund einer Vielzahl von Einflussfaktoren, wie z. B. der Pilzart, der Tiefe des Myzels, der Bodenkontamination und der Feuchtigkeit des Bodens, schwierig. Ziel dieser Arbeit war es die Variabilität, den Einfluss verschiedener Faktoren sowie die effektive Halbwertszeit der 137Cs-Aktivität in Pilzfruchtkörpern zu ermitteln. Des Weiteren wurde überprüft, ob die Bodenkontamination für eine Abschätzung der 137Cs-Aktivität von Pilzfruchtkörpern herangezogen werden kann. Für die Untersuchungen wurden über mehrere Jahre Proben von Maronenröhrlingen (Imleria badia) und Steinpilzen (Boletus edulis) aus vier Waldgebieten in Mittel- und Süddeutschland mit unterschiedlichem Aktivitätseintrag nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986 analysiert. Die Gebiete waren Eichenzell, Wülfersreuth, Oberschönenfeld und der Nationalpark Bayerischer Wald. Als Ergänzung dienten zugesendete Proben derselben Pilzarten von Mitgliedern aus Pilzvereinen aus ganz Deutschland. Zusätzlich zu den Pilzproben wurden Bodenproben gemessen, um zum einen die aktuelle Bodenkontamination zu bestimmen und zum anderen zu überprüfen, ob der Großteil des 137Cs weiterhin im Bereich des Pilzmyzels zu finden ist.
Für die Untersuchung der örtlichen Variabilität der 137Cs-Aktivität wurden Maronenröhrlinge (Imleria badia) aus dem Waldgebiet Eichenzell in den Jahren 2017 bis 2019 analysiert. Innerhalb eines Sammeltages variierten die Messwerte verschiedener Proben innerhalb des Waldgebietes teilweise um den Faktor sechs. Dabei ist die Variabilität innerhalb eines Teilgebietes größer als zwischen beiden Teilgebieten des Waldgebietes Eichenzell. Für ein repräsentatives Ergebnis eines Gebietes ist es aufgrund der Variabilität erforderlich, eine ausreichende Menge an Fruchtkörpern zu analysieren.
Um die effektive Halbwertszeit der 137Cs-Aktivität in Maronenröhrlingen (Imleria badia) zu ermitteln, wurden Proben aus drei Waldgebieten über fünf bis neun Jahre analysiert. Die Wahl der drei Waldgebiete erfolgte anhand des 137Cs-Aktivitätseintrags nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986. Die Bodenkontaminationswerte variieren von 3.000 Bq/m² in Eichenzell über 12.500 Bq/m² in Wülfersreuth bis 35.000 Bq/m² in Oberschönenfeld. Die effektiven Halbwerts-zeiten liegen in einem engen Bereich von 5,2 bis 5,8 Jahre mit einem Mittelwert von 5,4 ± 0,3 Jahren. Damit reduziert sich die radioaktive Belastung der Pilzfruchtkörper in etwa fünfmal schneller als durch die rein physikalische Halbwertszeit des 137Cs von 30,08 Jahren. Durch die Hinzunahme von bereits im Jahr 1990 veröffentlichten Daten ergab sich eine längere effektive Halbwertszeit von 7,7 ± 0,6 Jahren.
Für die Untersuchung der zwei Einflussfaktoren Exposition des Sammelgebiets (Hangausrichtung nach Ost oder West) und Höhenlage wurden sowohl Maronenröhrlinge (Imleria badia) als auch Steinpilze (Boletus edulis) hinsichtlich der 137Cs-Aktivität gemessen, um die Auswirkung auf Pilzarten mit unterschiedlichem Akkumulationsvermögen zu analysieren. Als Untersuchungsgebiet diente der Nationalpark Bayerischer Wald, da dieser ein großes Gebiet umfasst und verschiedene Ausprägungen der beiden Faktoren abbildet. Zudem wurde das Gebiet in Folge der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl stark kontaminiert und der Park ist ein beliebtes Pilzsammelgebiet. Anhand der 137Cs-Aktivität von Bodenproben konnte das Gebiet in zwei Regionen (Cluster) eingeteilt werden: eine Region mit hohem und eine mit niedrigem Aktivitätseintrag. Im Vergleich wiesen Maronenröhrlinge (Imleria badia) durchschnittlich eine um den Faktor fünf höhere 137Cs-Aktivität als Steinpilze (Boletus edulis) auf. Der Faktor Höhenlage zeigte im Gegensatz zur Exposition einen Einfluss auf die Kontamination der Pilzfruchtkörper. In Bezug auf die Höhenlage war der Einfluss nur im Falle eines hohen Aktivitätseintrags signifikant, wobei die Pilzproben aus der niedrigsten Höhenlage am höchsten belastet waren.
Zur Ermittlung der vertikalen Verteilung des 137Cs im Boden wurden in den Waldgebieten Eichenzell und Nationalpark Bayerischer Wald Proben bis zu einer Tiefe von 24 cm entnommen und anschließend in 2 cm Schichten analysiert. Alle Verteilungen konnten mit einem Gauß-Fit oder einem multiplen Gauß-Fit mit 2 bis 3 Maxima abgebildet werden. Das erste Maximum lag in allen Fällen in den organischen Horizonten oder im Übergangsbereich zum Ah-Horizont. Folglich befindet sich der Großteil des 137Cs fast 35 Jahre nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl immer noch im Bereich des Pilzmyzels und kann somit von den Pilzen aufgenommen und in den Fruchtkörpern angereichert werden.
Der Vergleich der 137Cs-Aktivität der Pilz- und Bodenproben aus dem Nationalpark Bayerischer Wald ergab sowohl für Maronenröhrlinge (Imleria badia) als auch für Steinpilze (Boletus edulis) eine positive Korrelation. Nach Unterteilung der Proben anhand der Höhenlage zeigte sich eine noch stärkere Korrelation. Dies zeigt, dass neben der Bodenkontamination auch die Höhenlage einen Einfluss auf die 137Cs-Aktivität der Fruchtkörper hat.
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1. Das Wachstum und die Fähigkeit zur Butyratproduktion von E. callanderi KIST612 wurde in geschlossenen Batch-Kulturen mit den Substraten Glukose, Methanol, Formiat, H2 + CO2 und CO untersucht. E. callanderi KIST612 zeigte sich nur bei Wachstum auf 20 mM Glukose oder 20 mM Methanol in der Lage, Butyrat in größeren Mengen (3,7 – 4,3 mM) zu produzieren. Das Hauptprodukt bei allen untersuchten Wachstumssubstraten war jedoch Acetat.
2. In bioinformatischen Analysen des Genoms von E. callanderi KIST612 konnte nur eine A1AO-ATP-Synthase gefunden werden, welche eine V-typ c-Untereinheit bestehend aus 4 TMH‘s mit nur einer Na+-Bindestelle aufweist. Diese konnte aus gewaschenen Membranen von E. callanderi durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, Anionenaustausch-Chromatographie (DEAE) sowie einer Größenausschluss-Chromatographie (Superose 6) bis zur apparenten Homogenität gereinigt werden. Nach Produktion einzelner Untereinheiten (A, B, C, D, E, F und H) in E. coli und Generierung von Antikörpern, konnten alle Untereinheiten (A, B, C, D, E, F, H, a sowie c) in der gereinigten Enzympräparation immunologisch oder mittels „Peptide-Mass-Fingerprinting“ nachgewiesen werden. Es konnte somit erstmals eine A1AO-ATP-Synthase aus einem mesophilen Organismus ohne Verlust von Untereinheiten gereinigt werden.
3. Der Gesamtkomplex wies unter nativen Bedingungen eine molekulare Masse von ca. 670 kDa auf. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte sich anhand der hantelförmigen Strukturen, dass die A1AO-ATP-Synthase als intakter Gesamtkomplex gereinigt werden konnte.
4. Die gereinigte A1AO-ATP-Synthase wurde zunächst anhand ihrer ATP-Hydrolyse-Aktivität biochemisch charakterisiert. Die ATP-Hydrolyse-Aktivität hatte ein pH-Optimum von 7 – 7,5 und ein Temperaturoptimum bei 37 °C. Durch Messung der ATPase-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Mengen an Na+ konnte die vorhergesagte Na+-Abhängigkeit des Enzyms nachgewiesen werden. Zudem zeigten Hemmstoffexperimente mit DCCD, dass dieser Inhibitor mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert. Dies bestätigte nochmals, dass das Enzym funktionell gekoppelt gereinigt werden konnte.
5. Zur weiteren Untersuchung der Ionenspezifität wurde der an die ATP-Hydrolyse gekoppelte Ionentransport durch Rekonstitution des Enzyms in Liposomen und anschließender Messung des Na+- oder H+-Transports gemessen. In den Proteoliposomen konnte mit Hilfe von 22Na+ gezeigt werden, dass das Enzym Natriumionen translozieren kann. Während in Anwesenheit des Natriumionophors ETH 2120 kein 22Na+-Transport beobachtet werden konnte, führte die Anwesenheit des Protonophors TCS zu einer geringfügigen Stimulation der 22Na+-Translokation. Insgesamt konnte ein primärer Na+-Transport nachgewiesen werden, welcher von der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi katalysiert wird.
6. Durch Rekonstitution der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi in Liposomen konnte erstmals biochemisch nachgewiesen werden, dass ein solches Enzym trotz seiner V-Typ c-Untereinheit in der Lage ist, ATP zu synthetisieren. Durch die Zugabe von Ionophoren (ETH 2120 und TCS) konnte der elektrochemische Ionengradient aufgehoben werden, wodurch keine ATP-Synthese beobachtet werden konnte. Der erstmalige Nachweis der ATP-Synthese wurde bei einem ΔµNa+ von 270 mV erbracht.
7. Die ATP-Synthese zeigte sich ebenfalls abhängig von der Na+-Konzentration. Der KM-Wert lag bei 1,1 ± 0,4 mM und war vergleichbar mit dem für die ATP-Hydrolyse ermittelten Wert. Ebenso konnte für die ATP-Synthese-Richtung gezeigt werden, dass DCCD mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert.
8. Um den biochemischen Nachweis zu erbringen, dass die A1AO-ATP-Synthase auch unter physiologisch relevanten Potentialen zur ATP-Synthese befähigt ist, wurde der energetische Schwellenwert der ATP-Synthese bestimmt. Dieser betrug 87 mV als Triebkraft für ΔpNa, 94 mV als Triebkraft für Δψ und 90 mV als Triebkraft für ΔµNa+. Erstaunlicherweise konnte die ATP-Synthese der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 sowohl durch Δψ als auch ΔpNa angetrieben werden. Unterschiedliche Kombinationen von Δψ und ΔpNa führten zu dem gleichen energetischen Schwellenwert; Δψ und ΔpNa waren im Enzym aus E. callanderi KIST612 äquivalente Triebkräfte.
9. Der energetische Schwellenwert der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 wurde mit dem der F1FO-ATP-Synthasen aus A. woodii, E. coli und P. modestum verglichen. Dazu wurden die Enzyme im ATP-Synthase-defizienten E. coli-Stamm DK8 produziert und anschließend durch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach Einbau der Enzyme in Liposomen waren alle Enzyme in der Lage, ATP als Reaktion auf ΔµNa+ (A. woodii und P. modestum) oder ΔµH+ (E. coli) zu synthetisieren. Im Vergleich zum Enzym aus E. callanderi zeigten sich zwei auffällige Unterschiede. Erstens war keine der F1FO-ATP-Synthasen in der Lage, ΔpNa/ΔpH als alleinige Triebkraft zu nutzen. Während die ATP-Synthese in den Enzymen aus E. coli und P. modestum nur durch ΔµH+ bzw. ΔµNa+ angetrieben werden konnte, konnte das Enzym aus A. woodii zusätzlich auch durch Δψ als einzige Triebkraft angetrieben werden.
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Der Pilz Podospora anserina ist seit mehr als fünf Jahrzehnten ein wichtiger Modellorganismus für die Alternsforschung. Insbesondere die Mitochondrien, essentielle eukaryotische Zellorganellen – wegen ihrer Funktion im Energiestoffwechsel häufig auch als „zelluläre Kraftwerke“ bezeichnet, sind Schlüsselfaktoren für den Alterungsprozess dieses Organismus.
Im Rahmen einer vorangegangenen Diplomarbeit wurde daher der Einfluss der mitochondrialen CLPXP-Protease, einem bisher noch wenig erforschten Bestandteil der Proteinqualitätskontrolle in Mitochondrien, auf die Alterung von P. anserina untersucht. Mitochondriale CLPXP-Proteasen sind, wie auch ihre bakteriellen Pendants, aus zwei verschiedenen Untereinheiten aufgebaut: der Protease-Komponente CLPP und der Chaperon-Komponente CLPX. Die Deletion des Gens PaClpP, kodierend für CLPP in P. anserina, führte zu einer überraschenden Verlängerung der gesunden Lebensspanne der Mutante. Darüber hinaus war es möglich, den pilzlichen PaClpP-Deletionsstamm durch Einbringen von CLPP des Menschen zu komplementieren. Dies beweist, dass die Proteasen CLPP des Menschen und von P. anserina funktionell homolog sind. Dadurch eröffnete sich die Perspektive, diesen einfachen Modellorganismus für die Gewinnung potenziell auf den Menschen übertragbarer Erkenntnisse einzusetzen. Bedeutenderweise ist die menschliche CLPXP-Protease wahrscheinlich involviert in die Entstehung verschiedener Krankheiten, darunter das Perrault-Syndrom sowie einige Krebsarten. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch weitestgehend unverstanden.
Ziel des in dieser Dissertation beschriebenen Forschungsprojektes war daher die Gewinnung genauerer Einsichten in die molekulare Funktion und die daraus folgende biologische Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease von P. anserina. Der wohl wichtigste Punkt für das detaillierte Verständnis einer Protease ist die Kenntnis ihres Substratspektrums, d. h. der von ihr abgebauten Proteine. Tatsächlich wurde aber bis heute noch in keinem eukaryotischen Organismus eine umfassende Analyse der Substrate einer mitochondrialen CLPXP-Protease vorgenommen. Um diese Wissenslücke zu füllen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine ursprünglich in Bakterien entwickelte Verfahrensweise, der sogenannte CLPP „Substrat-trapping Assay“, in P. anserina implementiert. Dafür mussten zunächst die notwendigen handwerklichen Voraussetzungen für den Assay geschaffen werden, insbesondere die effiziente Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus isolierten Mitochondrien – einer bisher in P. anserina noch nicht angewandten Technik. Unter Verwendung verschiedener neu hergestellter Varianten der menschlichen Protease-Komponente CLPP, darunter einer proteolytisch inaktiven Variante zum „Einfangen“ von Substraten, konnte der CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina erfolgreich durchgeführt werden. Insgesamt wurden, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Julian D. Langer (Max-Planck-Institut für Biophysik; Durchführung von massenspektrometrischen Analysen) nahezu 70 spezifische Proteine erstmalig als potenzielle Substrate oder Interaktionspartner einer mitochondrialen CLPXP-Protease identifiziert. Bei einem Großteil dieser Proteine handelt es sich um Enzyme und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege – vor allem um solche, die eine zentrale Rolle im mitochondrialen Energiestoffwechsel spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen somit folgende Arbeitsthese als Schlussfazit und gleichzeitig Ausganspunkt für zukünftige Untersuchungen nahe:
Die hauptsächliche molekulare Funktion der mitochondrialen CLPXP-Protease in P. anserina ist die Degradation von Stoffwechselenzymen und ihre biologische Rolle demnach die Kontrolle und Aufrechterhaltung des mitochondrialen und zellulären Energiestoffwechsels.
Insgesamt ist die auf Grundlage des CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina anzunehmende Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease als regulatorische Komponente des mitochondrialen Energiestoffwechsels erstaunlich gut mit Beobachtungen in anderen eukaryotischen Organismen, gerade bezüglich der Relevanz der CLPXP-Protease des Menschen für diverse Krankheiten, zu vereinbaren. Somit erscheint es überaus sinnvoll und vielversprechend, dass in dieser Doktorarbeit erstellte und bisher beispiellose Kompendium potenzieller in vivo Substrate und Interaktionspartner dieser Protease auch als Referenz für zukünftige Untersuchungen außerhalb von P. anserina anzuwenden.
Untersuchungen zur Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für die Alterung von Podospora anserina
(2012)
Im Rahmen dieser vorliegenden Doktorarbeit sollte die Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für das Resistenzverhalten und den Alterungsprozess bei P. anserina untersucht werden. Folgende Befunde aus den Analysen konnten erhalten werden:
1. Lokalisationsstudien der drei PaSods: Aus den biochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der drei verschiedenen PaSODs geht hervor, dass PaSOD1, eine Cu/ZnSOD, überwiegend im Cytosol und zu einem geringen Anteil im mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert ist. Eine der beiden MnSODs, PaSOD2, wird vermutlich zur Abwehr von exogenem Superoxid sekretiert. Bei PaSOD3 handelt es sich um eine mitochondriale MnSOD.
2. Generierung von verschiedenen PaSod-Mutanten: Im Rahmen dieser Arbeit wurden von jeder PaSod mindestens drei unabhängige Überexpressionsstämme, ein GFP-Stamm- und ein Deletionsstamm hergestellt. Weiterhin wurden alle möglichen Doppel-Deletionsstämme und die Dreifach-Deletionsmutante erzeugt. Alle Stämme wurden auf DNA-Ebene verifiziert, zusätzlich wurde die Proteinmenge bzw. –Aktivität überprüft.
3. Einfluss der PaSODs auf die ROS-Toleranz: Die Analysen der ROS-Resistenzen haben gezeigt, dass PaSODs eine wichtige Rolle in der Entgiftung von Superoxiden spielt. So ließ sich bei den Deletionsstämmen der PaSods eine gesteigerte Sensitivität gegenüber Paraquat feststellen. Eine Aufsummierung der Sensitivität gegenüber Paraquat ist bei der PaSod-Tripelmutante (ΔPaSod1/2/3) zu erkennen.
Überraschenderweise kann durch die gesteigerten Mengen an aktiver PaSOD in den Überexpressionsstämmen (PaSod1-3_OEx) keine verbesserte Resistenz gegenüber Paraquat erzielt werden. Darüber hinaus führt die Überexpression des Gens für die mitochondriale SOD, PaSOD3, zu massiven negativen Effekten.
4. Einfluss auf die Lebensspanne: Durch eine fehlende Entgiftung von Superoxid in den PaSod-Deletionsmutanten ist eine Verminderung der Lebensspanne nicht festzustellen. Bei PaSod-Mutantenstämme, die eine erhöhte PaSOD-Aktivität und damit eine gesteigerte Abbaurate des Superoxids aufweisen, kann bei den PaSod1- und PaSod2-Überexpressionsstämmen keine verbesserte Lebensspanne unter den gewählten Standardbedingungen erzielt werden. Vielmehr noch ist die Lebensspanne der PaSod3-Überexpressionsstämme stark reduziert.
5. Einfluss der PaSod-Modulation auf andere Komponenten des ROS-Abbausystems: Die PaSOD-Aktivitäten scheinen miteinander co-reguliert zu werden. Des Weiteren scheint es ein Zusammenhang zwischen den beiden sekretierten Enzymen PaSOD2 und PaCATB zu geben. Deutlich wird auch, dass die Modulation der Superoxid-Dismutasen eine weitreichende Auswirkung auf andere Schutzsysteme hat. Beispielweise konnte gezeigt werden, dass Komponenten des mitochondrialen ROS-Schutzsystems und der Protein-Qualitätskontrolle in den PaSod3-Überexpressionsstämmen verändert sind.
Zusammenfassend lassen die Analysen der PaSod-modulierten Stämme den Schluss zu, dass die Superoxid-Dismutase in P. anserina ein wichtiges Enzym zum Abbau des schädlichen Superoxids darstellt, welches aber nur eine untergeordnete Rolle bei der Kontrolle der Lebensspanne unter den gewählten Wachstumsbedingungen im Labor ausübt. Des Weiteren haben die Analysen gezeigt, dass es durch die Modulation der PaSod-Gene zu weitreichenden Änderungen, die das ROS-Schutzsystem (PaSOD, PaCATB und PaPRX1) sowie die Protein-Qualitätskontrolle (PaHSP60, PaLON und PaCLPP) betreffen, kommt. Welche Auswirkung dabei diese Veränderungen in Bezug auf die Lebensspanne hat, kann nur schwer abgeschätzt werden und muss mit weiteren Untersuchungen geklärt werden.
Untersuchungen zur Bedeutung selektiver Autophagie für Alterungsprozesse von Podospora anserina
(2022)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Funktion und die Rolle von Autophagie-assoziierten Proteinen im Alternsmodell Podospora anserina zu untersuchen und einen Einblick in die nicht-selektive Autophagie, die Mitophagie und die Bildung und den Abbau von Autophagosomen im Zusammenhang zur Alterung von P. anserina zu analysieren. Dabei wurden folgende Erkenntnisse erhalten:
1. Die Untersuchungen zu ΔPaAtg8 bestätigen, dass die PaATG8-abhängige Autophagosomenbildung zur Aufrechterhaltung der Lebensspanne benötigt wird. In ΔPaAtg8 kommt es zu einem Verlust der nicht-selektiven Autophagie. Die Mitophagie hingegen ist auch ohne PaATG8 partiell möglich und es liegt ein PaATG8-unabhängiger Abbau von mitochondrialen Proteinen in P. anserina vor.
2. In P. anserina ist PaATG11 an der nicht-selektiven Autophagie beteiligt und auch die Mitophagie erfolgt in Abhängigkeit dieses Gerüstproteins. Während der PaAtg11-Deletionsstamm unter Normalbedingungen keinen zum Wildtyp veränderten Phänotyp zeigt, führt eine Kultivierung auf M2-Medium mit Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle zu einer starken Verkürzung der Lebensspanne. Eine mikroskopische Untersuchung der Mitochondrien zeigte, dass im juvenilen Altersstadium von ΔPaAtg11 stark fragmentierte Mitochondrien vorliegen. Während der Alterung normalisiert sich die Mitochondrienmorphologie wieder. Der mitochondriale Funktionsverlust wird möglicherweise von den fragmentierten Mitochondrien ausgelöst, denn eine Kultivierung von älteren ΔPaAtg11-Stämmen auf M2-Medium mit Glycerin führt zu einer Normalisierung der Lebensspanne.
3. Die initialen Untersuchungen zur ΔPaAtg11/ΔPaAtg24-Doppelmutante zeigen, dass es bei der Kultivierung unter Normalbedingungen zu einem additiven Effekt der beiden Genverluste kommt. Bei der Anzucht auf M2-Medium mit Glycerin hingegen kann eine im Vergleich zum ΔPaAtg11-Stamm längere Lebensspanne festgestellt werden. Die Mikroskopie der Mitochondrien in ΔPaAtg11/ΔPaAtg24 zeigt, dass im juvenilen Alter zum Wildtyp vergleichbare filamentöse Mitochondrien vorhanden sind.
4. In P. anserina ist PaATG24 kein Mitophagierezeptorprotein, da im PaAtg24-Deletionsstamm eine Beeinträchtigung der nicht-selektiven Autophagie vorliegt. Auch die Mitophagie ist in diesem Stamm geschädigt. Die mikroskopische Betrachtung der Mitochondrien zeigt keinen Unterschied zum Wildtyp. Bei der Untersuchung zur Mitochondrienfunktion durch M2-Medium mit Glycerin ist wie unter Normalbedingungen eine verkürzte Lebensspanne feststellbar.
5. Der Abbau von GFP::PaATG8 ist in der PaAtg24-Deletionsmutante signifikant verringert und es kommt zu einer Akkumulation von Autophagosomen, somit liegt in diesem Stamm eine Beeinträchtigung des autophagosomalen Flusses vor. Bei der mikroskopischen Untersuchung von PaATG24 zeigt sich, dass dieses Protein in P. anserina im Bereich der Vakuolen lokalisiert ist. Die Analyse der Vakuole-Autophagosomen-Fusion zeigt jedoch, dass dieser Mechanismus unabhängig von PaATG24 ist. Die Vakuolenmorphologie und Vakuolengröße ist in ΔPaAtg24 beeinträchtigt und dadurch kommt es zu dem beobachteten Defekt der nicht-selektiven und selektiven Autophagie.