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Oral presentation from 4th International Conference of cGMP Generators, Effectors and Therapeutic Implications ; Regensburg, Germany. 19–21 June 2009 Background: An exaggerated pain sensitivity is the dominant feature of inflammatory and neuropathic pain both in the clinical setting and in experimental animal models. It manifests as pain in response to normally innocuous stimuli (allodynia), increased response to noxious stimuli (hyperalgesia) or spontaneous pain, and can persist long after the initial injury is resolved. Research over the last decades has revealed that several signaling pathways in the spinal cord essentially contribute to the pain sensitization. To test the contribution of cGMP produced by NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) to pain sensitization, we investigated the localization of NO-GC in the spinal cord and in dorsal root ganglia, and we characterized the nociceptive behavior of mice deficient in NO-GC (GC-KO mice). Results: We show that NO-GC (β1 subunit) is distinctly expressed in neurons of the mouse spinal cord, while its distribution in dorsal root ganglia is restricted to non-neuronal cells. GC-KO mice exhibited a considerably reduced nociceptive behavior in models of inflammatory or neuropathic pain, but their responses to acute pain were not impaired. Moreover, GC-KO mice failed to develop pain sensitization induced by spinal administration of drugs releasing NO. Surprisingly, during spinal nociceptive processing cGMP produced by NO-GC may activate signaling pathways different from cGMP-dependent protein kinase I (cGKI), while cGKI can be activated by natriuretic peptide receptor-B (NPR-B) dependent cGMP production. Conclusion: Taken together, our results provide evidence that NO-GC has a dominant role in the development of exaggerated pain sensitivity during inflammatory and neuropathic pain. Furthermore, beside the NO-mediated cGMP synthesis, cGMP produced by NPR-B contributes to pain sensitization by activation of cGKI.
Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung der zentralen Lipidhomöostase durch Statine
(2009)
Die adoptive Immuntherapie mit hochaufgereinigten NK-Zellen bei pädiatrischen Patienten mit malignen Erkrankungen nach haploidenter SZT ist eine mögliche Therapieoption, um einen verstärkten GvL/GvT-Effekt zu bewirken und möglicherweise die Immunregeneration zu fördern. Als schwerwiegende Nebenwirkung ist bisher noch nicht eindeutig belegt, ob neben T-Zellen auch NK-Zellen in der Lage sind, eine GvHD auszulösen. In der Frankfurter Universitätskinderklinik wurden 7 Patienten (4xALL, 1xAML, 1xRMS IV und 1xM. Hodgkin) mit hochaufgereinigten unstimulierten NK-Zellen und 3 Patienten (3xNB IV) mit IL-2 stimulierten NK-Zellen nach haploidenter SZT behandelt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in vitro untersucht, ob NK-Zellen durch die Stimulierung mit IL-2 einen gesteigerten GvL/T-Effekt aufweisen. Es wurden NK-Zellen von 5 verschiedenen gesunden Spendern (2 im Rahmen von Validierungsläufen und 3 zur Behandlung der 3 Patienten mit NB) zunächst immunomagnetisch im klinischen Maßstab mittels CD3-Depletion und darauffolgender CD56-Selektion aufgereinigt. Danach erfolgte die Aktivierung mit IL-2 (Proleukin®S) über 14 Tage unter GMP. Während sich die NK-Zellen aller Spender nach Aufreinigung in eine kleine Population CD56+CD16- immunregulatorischer NK-Zellen (2,3 bis 7,1 %) und eine große Population zytotoxischer CD56+CD16+ NK-Zellen (92,9 bis 97,7 %) unterteilen ließen, zeigte sich nach IL-2 Stimulierung ein heterogenes Bild von CD16+ zu CD16- NK-Zellen. Durch die 9-tägige IL-2 Stimulierung vergrößerte sich der Anteil KIRnegativer NK-Zellen. Es konnte auf den NK-Zellen aller Spender gezeigt werden, dass durch die IL-2 Stimulierung wichtige Rezeptoren (NKG2D, NCR), die für ein hohes zytotoxisches Potential stehen, verstärkt auf der NK-Zelloberfläche exprimiert wurden. Die gesteigerte Zytokinproduktion der IL-2 stimulierten NK-Zellen untermauerte die Funktionalität der ex vivo stimulierten NK-Zellen und dies konnte in funktionalen Assays, die die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen belegen, bewiesen werden. Durch die IL-2 Stimulierung der NK-Zellen konnte die Killing Aktivität gleichmäßig auf über 90 % gesteigert werden. Interessanterweise wies Spender A bei den funktionellen und phänotypischen Analysen eine Sonderrolle auf. Die NK-Zellen dieses Spenders zeigten bereits vor IL-2 Stimulierung eine hohe Zytotoxizität gegenüber malignen Zellen, welches auf eine Voraktivierung, gemessen an der Expression von Aktivierungsmarker CD69, schließen lässt. Die in vivo Untersuchungen zeigten, dass bei einer verabreichten T-Zell-Dosis unter 50 x 103/KG, nur milde GvHDs (Grad I/II) auftraten. Bis zu 60 x 106 NK-Zellen/KG wurden gut toleriert. Nebenwirkungen wie Fieber und Schüttelfrost waren transient und gingen einher mit erhöhten Zytokinspiegeln von inflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-8, IFN-γ) im Serum der Patienten. Ein engmaschiges Monitoring nach der NK-Zell-Applikation der IL-2 stimulierten NK-Zellen zeigte, dass die NK-Zellen in 5/6 Applikationen aus der peripheren Blutbahn abwanderten, einhergehend mit der Migration von Antigen-präsentierenden Zellen. Bei der Untersuchung des langfristigen Einflusses von adoptiver NK-Zell-Immuntherapie auf die Immunrekonstitution bei Patienten nach haploidenter SZT wurde vorausgehend eine Normwertstudie zu verschiedenen Leukozytensubpopulationen von 100 gesunden Kinder und Erwachsenen vorgenommen. Nach der Entwicklung eines stufenlosen, nicht-linearen Regressionsmodells konnte der Einfluss auf die Immunrekonstitution der Patienten nach SZT altersgerecht beurteilt werden. Weiterhin wurden Patientengruppen, die ebenfalls haploident transplantiert wurden, den NK-Zell-Studienpatienten gegenübergestellt. Eine signifikante Verbesserung durch die Gabe von NK-Zellen konnte nicht beobachtet werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass die NK-Zellzahl innerhalb des ersten Monats nach SZT Normwerte erreichte, gefolgt von den zytotoxischen CD3+CD8+ T-Zellen 5-6 Monate nach haploidenter SZT, den THelfer Zellen und den B-Zellen nach über einem Jahr nach haploidenter SZT. Die allogene additive NK-Zell-Immuntherapie ist eine vielversprechende Therapieoption bei Patienten mit malignen Erkrankungen wie bspw. dem NB. Die NK-Zell-Aktivierung mit IL-2 bewies den Erhalt der Immunkompetenz. Dies war erkennbar an der gesteigerten zytotoxischen Funktionalität, der Zytokinproduktion und der Hochregulierung von zytotoxisch aktiven Rezeptoren. Eine verbesserte Immunrekonstitution kann durch das neue altersgerechte Lymphozyten-Norm-Modell besser beurteilt werden. Allerdings ist die Patientenanzahl und die Beobachtungszeit bisher zu gering, um in vivo ein verbessertes Überleben mit additiver NK-Zell-Immuntherapie wirklich abschätzen zu können.
Aufgrund der zunehmenden Marktbedeutung und der Fülle pflanzlicher Präparate in Europa und den USA stellte sich die Frage, ob - im Sinne des Patienten und rationaler Phytotherapie - eine ausreichende Qualität der Produkte deren Einsatz rechtfertigt. Die Qualität pflanzlicher Produkte ist aufgrund der Besonderheit eines Vielstoff-Gemisches mit oftmals unbekannten wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffen schwer zu beurteilen. In Europa sind deshalb schon vor Jahren Bestrebungen angestellt worden, pflanzliche Produkte aufgrund von Monographien (Kommission E) zumindest in ihren Ausgangsdrogen und ihrer Extraktspezifikation zu vereinheitlichen. Normierung und Standardisierung von Extrakten wurden gefordert. Während der Diskussion über die Qualität der Extrakte (Normierung/Standardisierung) ist dabei ein wesentlicher Aspekt hinsichtlich der Vergleichbarkeit von Qualität und Wirksamkeit von Fertigprodukten verloren gegangen: der Einfluß der Arzneistoff-Formulierung auf die in vivo-Situation. Ausmaß und Geschwindigkeit der Resorption des enthaltenen Pharmakons (Bioverfügbarkeit) können sowohl von den physiko-chemischen Wirkstoffeigenschaften, wie Löslichkeit und Permeabilität, als auch von Eigenschaften der Darreichungsform abhängen. Entscheidend ist, welcher Prozeß für die Resorption in den Organismus der geschwindigkeitsbestimmende ist: die Freisetzung des Wirkstoffes aus der Darreichungsform oder der Permeationsprozeß durch die Darmmembran. Ist letzterer der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, so sind gewisse Veränderungen der Wirkstofffreisetzung ohne Belang. Das Vergleichen von Extraktqualitäten (Wirkstoffen), wie es durch die Kommission E-Monographie vorgeschlagen wird, ist folglich nicht ausreichend. Einflüsse der Darreichungsform (biopharmazeutische Eigenschaften) sind zu berücksichtigen. Wie bei chemisch-synthetischen Wirkstoffen sollte therapeutische Vergleichbarkeit über Bioäquivalenz-Studien belegt werden. Als bioäquivalent gelten zwei Produkte, wenn sie pharmazeutisch äquivalent sind und wenn ihre Bioverfügbarkeiten bei Gabe gleicher Dosen so ähnlich sind, daß die erzielten Effekte bezüglich Wirksamkeit und Sicherheit praktisch identisch sind. Das Problem des Belegs der pharmazeutischen Äquivalenz (gleiche Mengen gleicher Wirkstoffe in gleicher oder ähnlicher Darreichungsform) bei pflanzlichen Produkten ergibt sich aus der Tatsache, daß sie sich phytochemisch als Vielkomponenten-Gemische nur schwer charakterisieren lassen. Wirksamkeitsbestimmende Substanzen sind häufig nicht bekannt. Die Kenntnis wirksamkeitsmitbestimmender Komponenten ermöglicht nur einen partiellen Beleg der Äquivalenz, und pharmakologisch irrelevante Leitsubstanzen können höchstens Zwecken der Standardisierung dienen. Vergleichende Bioverfügbarkeitsuntersuchungen im Sinne von Analysen einzelner Bestandteile in Körperflüssigkeiten sind nur möglich, wenn die wirksamkeitsbestimmenden Komponenten des pflanzlichen Produktes bekannt sind. Alternativ werden Bestimmungen der Bioverfügbarkeit im Form pharmakodynamischer Ansätze diskutiert. Durch die Bestimmung pharmakodynamischer Parameter soll dabei die Aufnahme und Ausscheidung des gesamten „wirksamen Prinzips“ des pflanzlichen Produktes in den Organismus verfolgt werden. Voraussetzung ist natürlich, daß der untersuchte Effekt graduell quantifizierbar ist, in seiner Ausprägung eine Beschreibung von Ausmaß und Geschwindigkeit der Resorption erlaubt und vor allem mit der klinischen Wirksamkeit des betreffenden Produktes korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Ginkgo biloba-haltige Fertigprodukte des US-amerikanischen Marktes hinsichtlich ihrer therapeutischen Vergleichbarkeit untersucht. Für Ginkgo biloba-Extrakte sind wirksamkeitsmitbestimmende Komponenten benannt worden: Flavonglykoside und Terpenlaktone. Anhand derer wurden Untersuchungen zur pharmazeutischen Qualität der Ginkgo-Präparate durchgeführt. Hinsichtlich der Gehalte an Flavonglykosiden und Terpenlaktonen ergaben sich beachtliche Unterschiede. Als Maßstab wurde die Spezifikation der Kommission E angelegt; viele der untersuchten Extrakte lagen signifikant außerhalb der vorgegebenen Spannen, andere wiederum erfüllten diese Anforderungen. Auch die Begleitstoffmuster und -gehalte der diversen Extrakte unterschieden sich deutlich voneinander. Als Beispiel seien hier die Ginkgolsäure-Gehalte angeführt, deren Spanne von < 5 ppm bis 90.000 ppm reichte. Die untersuchten Extrakte konnten also schon aufgrund der Gehalte an wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffen in der Mehrzahl nicht als miteinander pharmazeutisch äquivalent angesehen werden. Zusätzlich ergaben Untersuchungen zu biopharmazeutischen Qualitäten (in vitro-Freisetzungsverhalten) einiger Produkte deutliche Unterschiede. Da auch für Ginkgo biloba-Extrakt nicht alle wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe bekannt sind, wäre es wünschenswert gewesen, die Produkte in einem pharmakodynamischen Ansatz hinsichtlich ihrer Bioverfügbarkeiten miteinander vergleichen zu können. Allerdings konnte im Rahmen dieser Arbeit kein in vitro-Modell gefunden werden, welches sich als sensitiv genug und als potentieller Bioassay geeignet erwiesen hätte. Deshalb wurde wenigstens eine vergleichende Bioverfügbarkeitsstudie zweier Präparate – im klassischen Sinne - durch Analyse einiger wirksamkeitsmitbestimmender Substanzen (Ginkgolid A, B und Bilobalid) in Körperflüssigkeiten (Blut) durchgeführt. Zwei Produkte mit stark differierendem Freisetzungsverhalten wurden gegeneinander verglichen. Die Studie ergab einen signifikanten Einfluß der Darreichungsform auf die Bioverfügbarkeit und letztendlich Bioinäquivalenz der untersuchten Produkte. Die vorliegende Arbeit zeigt, wie relevant die pharmazeutische Qualität der Produkte, inklusive ihrer biopharmazeutischen Eigenschaften, für die therapeutische Austauschbarkeit von Produkten sein kann. Auf dem Sektor pflanzlicher Produkte sind bis dato sehr wenige Untersuchungen hinsichtlich des Einflusses der Darreichungsform auf in vivo-Verhältnisse und der Bioverfügbarkeit durchgeführt worden. Des weiteren fehlen Kenntnisse zu wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffen oder alternativ pharmakodynamische Modelle, die eine Bestimmung der Bioverfügbarkeit ohne Kenntnis der pharmakologisch relevanten Inhaltsstoffe ermöglichen.
Untersuchung hochmolekularer Proteinkomplexe in menschlichen Leukämien mittels Proteomics-Werkzeugen
(2009)
Funktionelle Multiproteinkomplexe stellen im Sinne von Proteomics das kleinste isolierbare Proteom dar. Die Untersuchung von Proteinkomplexen gibt uns die Möglichkeit, Funktionen innerhalb der Zelle oder des Zellkompartiments genauer zu verstehen. Erst durch das Verständnis der einzelnen kleinen Zusammenspiele innerhalb einer Zelle, können wir die Auswirkungen auf ein betreffendes Organ und damit auf den Körper betrachten. Wir erhalten dadurch auch Informationen über die Funktion von spezifischen Genen und können so Erklärungsansätze für Gendefekte finden und über mögliche Therapieansätze nachdenken. Neben den Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen und dem Nachweis von Protein-Interaktionen mittels Immunopräzipitationsexperimenten stellt die Massenspektrometrie seit den 90er Jahren ein essentielles Werkzeug der Proteom-Forschung dar. Sie entwickelte sich zu einem etablierten Verfahren für die Charakterisierung von Biomolekülen und ermöglicht die Identifizierung unbekannter Proteine eines Komplexes. Das MLL-Gen auf Chromosom 11 Bande q23 ist in zahlreiche, reziproke chromosomale Translokationen verwickelt, die mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert sind. Chromosomale Translokationen des MLL-Gens werden aufgrund ihrer sehr schlechten Prognose und Therapierbarkeit als Hochrisiko-Leukämien eingestuft. Bis heute konnten 64 Translokations-Partnergene identifiziert werden, wobei das AF4-Gen mit 42% bei allen untersuchten Leukämien und mit ca. 66% bei ALL (akute lymphatische Leukämie) den größten Prozentsatz ausmacht. Bei der Translokation t(4;11) sind das MLL-Gen auf Chromosom 11 und das AF4-Gen auf Chromosom 4 beteiligt. Akute Leukämien mit einer t(4;11)-Translokation treten häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und betreffen vorwiegend den lymphatischen Zweig des blutbildenden Systems. Durch die Translokation entstehen zwei neue Derivatchromosomen – Derivat 11 (MLL•AF4, der11) und Derivat 4 (AF4•MLL, der4). Beide Fusionsgene verfügen über einen intakten Leserahmen und führen zur Expression der zwei Fusionsproteine MLL•AF4 (der11) und AF4•MLL (der4). Der pathomolekulare Mechanismus der t(4;11)-vermittelten ALL ist bis heute noch nicht hinreichend geklärt. Funktionen des der11-Fusionsproteins werden zwar schon intensiv erforscht, aber es gibt noch keine Erkenntnisse über die Funktion des der4-Fusionsproteins. Ähnlich sah die Situation zu Beginn dieser Arbeit für das AF4-Protein aus. Während schon einige Daten zur Funktion des MLL-Multiproteinkomplexes vorlagen, gab es nur wenige Informationen über die Funktion von AF4. Im Zuge dieser Arbeit wurden der AF4- und der der4-Multiproteinkomplex mittels affinitätschromatographischer Methoden aus transient transfizierten 293T-Zellen erfolgreich isoliert. Eine Größenbestimmung der Komplexe über eine Größenausschlusschromatographiesäule ergab für beide Komplexe eine Größe von ca. 2 MDa. Die Charakterisierung der beteiligten Interaktionspartner erfolgte mittels nLC-MALDI-MS/MS, Western Blot Analyse und Immunopräzipitation. Es konnte gezeigt werden, dass AF4 zusammen mit den Proteinen ENL/AF9, CDK9, CCNT1, AF10, DOT1L und der RNA-Polymerase II in einem Komplex vorliegt. Bereits 2007 konnte dieser Komplex in einem Mausmodell isoliert werden. Damit fungiert der AF4-Komplex auch in humanen Zellen als Stimulator der RNA-Polymerase-II-abhängigen transkriptionellen Elongation und vermittelt eine DOT1L-abhängige H3K79-Methylierung, die einen aktiven Transkriptionsstatus aufrechterhält. Zusätzlich konnten 6 neue Interaktionspartner identifiziert werden (AF5q31, BDR4, DDX6, HEXIM1, NFkB1/RELA und NPM1). Die Anwesenheit von BRD4 und HEXIM1 lässt vermuten, dass der AF4-Komplex in einem aktiven und einem inaktiven Zustand vorliegen kann. Außerdem wird der AF4-Komplex möglicherweise über den NFkB-Signalweg reguliert bzw. durch die Anwesenheit von NFkB1 an dessen Zielgene rekrutiert. Die Untersuchung des der4-Komplexes zeigte, dass er sich aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt. So wurden die Proteine P-TEFb, HEXIM1, NFkB1, NPM1, DDX6 und das AF4 selbst aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, DPY-30, CBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex identifiziert. Der der4-Komplex weist somit partielle Eigenschaften des AF4- und MLL-Wildtyp-Proteins auf. Diese Eigenschaften sind ausreichend für eine kompetitive Situation zwischen dem der4-Komplex und den beiden AF4- und MLL-Wildtyp-Komplexen. Die Gleichgewichte dieser Wildtyp-Komplexe werden vermutlich gestört. Für beide Komplexe wurde mit Hilfe eines in vitro Histon-Methyltransferase-Assays eine Histon-Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen. Für den AF4-Komplex muss zusätzlich eine bisher noch unbekannte Methyltransferase-Aktivität angenommen werden, da eine Methylierung des Histons H3 in den ersten 46 Aminosäuren gezeigt werden konnte, die sich nicht auf die Methyltransferase-Aktivität des DOT1L-Proteins im AF4-Komplex zurückführen lässt. Die H3K4-Methyltransferase-Aktivität des der4-Komplexes wird auf die Anwesenheit des SET-Domänen-Komplexes (ASH2L, WDR5, RBBP5 und DPY-30) zurückgeführt. Im Zusammenhang mit dem AF4-Protein wurde auch der ENL-Komplex untersucht. Mittels Western Blot konnten die Interaktionspartner AF4, CDK9, CCNT1, RNA-Polymerase II, NFkB1 und RING1 identifiziert werden. Damit ist auch das ENL mit dem globalen positiven transkriptionellen Elongationsfaktor P-TEFb assoziiert und beeinflusst die RNA-Polymerase-II-abhängige transkriptionelle Elongation.
Mechanistische Untersuchungen zur Modulation der zytosolischen Phospholipase A2 durch Hyperforin
(2009)
Aus der Familie der Phospholipasen A2 nimmt die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) in der Bereitstellung von Arachidonsäure (AA) für die Produktion von entzündungsfördernden Eikosanoiden und Lysophospholipiden eine Schlüsselrolle ein. Inwieweit die Modulation dieses Enzyms zum antientzündlichen Wirkspektrum von Hyperforin beiträgt, war Gegenstand dieser Arbeit. Hyperforin als Bestandteil des Johanniskrauts greift auf vielfältige Art und Weise in Entzündungsprozesse ein und hemmt unter anderem die Aktivität der 5-Lipoxygenase und Cyclooxygenase-1 in mikromolaren Konzentrationen. Zur Erforschung der cPLA2 als weitere potentielle Zielstruktur wurden die Effekte Hyperforins auf frisch isolierte humane polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) und Thrombozyten untersucht. Dabei ergaben sich erstaunlich widersprüchliche Ergebnisse. Während in PMNL die A23187- und Thapsigargin-induzierte AA-Freisetzung potent unterdrückt wurde (IC50 = 1,5 bis 1,9 µM), konnte Hyperforin die cPLA2-Aktivität in Thrombozyten nach A23187-Stimulation nicht und nach Thrombin-Induktion nur leicht beeinträchtigen. Hingegen resultierte aus der Behandlung von Thrombozyten mit 10 µM Hyperforin eine 2,6- bzw. 8,1-fache Steigerung der AA-Freisetzung und 12-Hydro(pero)xyeikosatetraensäure(H(P)ETE)-Produktion, die von einer Translokation der cPLA2 an die Plasmamembran begleitet war. In PMNL wurde eine Aktivierung der cPLA2 nicht beobachtet. Diese widersprüchlichen Befunde führten zu näheren mechanistischen Untersuchungen. Insbesondere der Einstrom von Ca2+, wie auch die Aktivierung von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) tragen in PMNL und Thrombozyten zur cPLA2-Aktivierung bei. Allerdings konnte eine Beeinträchtigung dieser Signaltransduktionswege durch Hyperforin ausgeschlossen werden. In PMNL wird der durch A23187- oder Thapsigargin-induzierte Ca2+-Einstrom nicht inhibiert und die Aktivierung der entsprechenden MAPK konnte durch Hyperforin (bis zu 10 µM) nicht vermindert werden. In Thrombozyten wurde die Translokation der cPLA2 sowie die AA- und 12-H(P)ETE-Produktion durch die Chelatierung von extra- und intrazellulärem Ca2+ nicht gehemmt. Auch die Unterbindung der Phosphorylierung der cPLA2 durch Hemmung der MAPK-Aktivierung konnte die Aktivierung der cPLA2 nicht verhindern. In zellfreien Untersuchungen an aufgereinigtem Enzym zeigte Hyperforin weder hemmende noch aktivierende Effekte, wenn Liposomen aus 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylcholin (PAPC) eingesetzt wurden. Nach Einbau von Dipalmitoylphosphatidylinositol-4,5-diphosphat, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol und Cholesterol in PAPC-Liposomen sowie gegenüber Lipid-Raft-Adaptionen (PAPC/Sphingomyelin/Cholesterol 1:1:1) zeigte Hyperforin allerdings inhibitorisches Potential (IC50 = 13,2 µM, 7,6 µM, 5,5 µM und 4,4 µM). Aktivierende Effekte des Hyperforins konnten in Abwesenheit von Ca2+ beobachtet werden, wenn cholesterolhaltige, Lipid-Raft-artige- oder 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylethanolamin(PAPE)-Vesikel eingesetzt wurden. 10 bis 30 µM Hyperforin erhöhten die AA-Freisetzung 3,3- bis 7,3-fach, wobei die Bindung des Enzyms an Liposomen mit Cholesterol und Lipid-Raft-Strukturen, aber nicht gegenüber dem PAPE-Substrat verstärkt war. Alle Effekte konnten durch die Zerstörung der Membranoberfläche und –struktur nach Zugabe von Triton-X-100 aufgehoben werden, wodurch die Bedeutung der Struktur der Lipidaggregate für die Hyperforinwirkung in den Vordergrund tritt. Darüber hinaus konnte die essentielle Rolle der vinylogen Carbonsäurestruktur des Hyperforins gezeigt werden, da ein O-Methylester des Hyperforins weder die Hemmung der cPLA2 in PMNL noch deren Aktivierung in Thrombozyten reproduzieren konnte und im Liposomenassay nur eine unspezifische Aktivierung der cPLA2 unabhängig von der Membranstruktur bewirkte. Neben der cPLA2-Aktivität wurde auch die Dichte der Liposomen abhängig von der Membranstruktur durch Hyperforin moduliert, allerdings konnten Änderungen der Membrandichte nicht mit Einflüssen auf die Enzymaktivität korreliert werden. Weiterhin wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Prof. Glaubitz, Universität Frankfurt, 1H-MAS-NMR-NOESY-Spektren von Liposomen aus 1-Palmitoyl(D31)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin mit integriertem Hyperforin aufgenommen. Das sich aus der Analyse der Spektren ergebende Modell postuliert die Lokalisation des sauerstoffreichen Bizyklus des Hyperforins im Kopfgruppenbereich der Lipide und eine Penetration der Isoprenylgruppen in die hydrophobe Schicht der Membranen. Die Ergebnisse dieser Arbeit in intakten Zellen und zellfreien Systemen verweisen somit auf komplexe Zusammenhänge, bei denen Interkalationen von Hyperforin mit speziellen Membranstrukturen im Vordergrund stehen. Die unspezifische Einlagerung der lipophilen Substanz Hyperforin in zelluläre Membrankompartimente könnte somit unter Umgehung der regulären Signaltransduktionswege zelltypabhängig die cPLA2-Aktivität modulieren.
Beteiligung der Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen
(2009)
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide neben ihrer Funktion als Plasmamembranbestandteile auch als intra- und extrazelluläre Botenstoffe in zelluläre Signalwege eingreifen können. So haben das Lysosphingolipid S1P und sein Vorläufermolekül Ceramid wichtige regulatorische Funktionen in der Regulation von Zelltod- und wachstum. Dabei agiert Ceramid als proapoptotisches und wachstumshemmendes Lipid, während S1P zellprotektive und wachstumfördernde Funktionen in der Zelle hat und dadurch als „Gegenspieler“ von Ceramid wirkt. Durch die zwei Enzymklassen der Ceramidasen und Sphingosinkinasen wird in der Zelle ein sogenanntes „Sphingolipid-Gleichgewicht“ durch die stete Interkonvertierbarkeit der Lipide aufrechterhalten. Das zu einem bestimmten Zeitpunkt in seiner Konzentration dominierende Sphingolipid entscheidet so über das Schicksal der Zelle, ob es zum Zelltod oder zum Wachstum kommt. In dieser Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen untersucht. Dafür wurden aus SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Mäusen Mesangiumzellen isoliert. Obwohl beide Sphingosinkinasen dasselbe Produkt S1P generieren, zeigen die beiden „knock-out“-Zelllinien unterschiedliches Apoptose- und Wachstumsverhalten. In einem ersten Kapitel wurde gezeigt, dass eine Depletion der SK1 in einer Desensitivierung der Mesangiumzellen gegenüber dem apoptotischen Stimulus Staurosporin und in einer drastischen Wachstumsverlangsamung im Vergleich zu den Wt-Zellen resultierte. Im Gegensatz dazu führte eine Depletion der SK2 zu einem Schutz vor Apoptose und zu einer erhöhten Wachstumsrate. In einem zweiten Kapitel wurden mögliche molekulare Mechanismen untersucht, die für diese gegensätzlichen Zellantworten verantwortlich sind. Nachdem eine vermehrte Prozessierung der Caspase 3 in SK1(-/-)-Zellen und eine verminderte Prozessierung in SK2(-/-)- Zellen festgestellt wurde, ergaben weitere Westernblot-Analysen eine Beteiligung der beiden Signalkaskaden PKB/Bad sowie MEK/ERK1/2 im Apoptosemechanismus der Mausmesangiumzellen. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine verminderte Phosphorylierungsrate der involvierten Enzyme PKB, MEK1/2 und ERK1/2, wohingegen die Signalkaskaden von SK2(-/-) durch vermehrte Phosphorylierung dieser Kinasen konstitutiv aktiviert sind. Daneben scheint auch der antiapoptotische Faktor Bcl-xL am Vorgang der mesangialen Apoptose beteiligt. Eine Depletion der SK1 führt zu einer reduzierten Bcl-xL-Proteinexpression, wohingegen SK2(-/-)- Zellen eine drastisch erhöhte Expressionsrate dieses antiapoptotischen Faktors aufweisen. Als zentraler Regulator des Zellwachstums zeigt sich das Retinoblastoma-Protein (Rb) in den SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zellen antagonistisch reguliert. Während keine basale Phosphorylierung des Proteins in SK1(-/-)-Zellen gefunden werden konnte, ist Rb in SK2(-/-)-Zellen hyperphosphoryliert. Anschliessend konnte in SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zelle eine Beteiligung von weiteren zellzyklus-regulierenden Enzymen, die Rb-Protein vorgeschaltet sind, gefunden werden. So ist die cyklinabhängige Kinase CDK6 in hyperproliferierenden SK2(-/-)-Zellen auf Proteinebene vermehrt exprimiert. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine erhöhte Proteinexpression des Zellzyklushemmers p27. In einem dritten Kapitel konnte gezeigt werden, dass eine Depletion der SK2 auch in Mausfibroblasten, die aus der Lunge von SK2(-/-)-Mäusen isoliert worden waren, zu einer vermehrten DNA-Synthese führt; die Funktion des Enzyms scheint also nicht zellspezifisch zu sein. Ein viertes Kapitel machte deutlich, dass Mausmesangiumzellen, die eine humane Variante der SK1 überexprimieren, vor stimulusinduzierter Apoptose geschützt sind. Darüberhinaus ist die DNA-Synthese der hSK1-transgenen Mausmesangiumzellen im Vergleich zu Wt- Zellen erhöht. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Sphingosinkinasen 1 und 2 in den primären Mausmesangiumzellen zelluläres Wachstum und Apoptose in entgegengesetzterweise regulieren: die SK1 wirkt mitogen und zellprotektiv, die SK2 hingegen wachstumshemmend und proapoptotisch
Platelets are anucleate cells that play a major role in hemostasis and thrombosis in the vasculature. During primary hemostasis platelets adhere to sites of vascular damage and the initial platelet coat is reinforced by additional platelets forming a stable aggregate. At the same time platelets secrete their intracellular granules containing substances that further activate platelets in an autocrine and paracrine fashion and affect local coagulation and endothelial smooth muscle cell function. The small guanine nucleotide binding protein Rap1 regulates the activity of the platelet integrin alphaIIbbeta3 and thus platelet aggregation. Rap1 activity is controlled by guanine nucleotide exchange factors and GTPase activating proteins. In platelets, Rap1GAP2 is the only GTPase activating protein of Rap1. In order to identify Rap1GAP2-associated proteins, a genetic two-hybrid screening in yeast was performed and synaptotagmin-like protein 1 (Slp1, also called JFC1) was found as a new putative binding partner of Rap1GAP2. Slp1 is a tandem C2 domain containing protein and is known to bind to Rab27, a small GTPase involved in platelet dense granule secretion. The direct interaction between Rap1GAP2 and Slp1 was confirmed in yeast and in transfected cells. More importantly, Slp1 is expressed in platelets and binding of endogenous Rap1GAP2 and Slp1 was verified in these cells. The Rap1GAP2 and Slp1 interaction sites were mapped by mutational analysis. Rap1GAP2 binds through the -TKXT- motif within its C-terminus to the C2A domain of Slp1. Moreover, the Slp1 binding -TKXT- motif of Rap1GAP2 was confirmed by complementary approaches using short synthetic Rap1GAP2 peptides. The C2A domain of Slp1 is a phospholipid binding domain and thus mediates binding of Slp1 to the plasma membrane. Phospholipid overlay assays revealed that simultaneous binding of Slp1 via its C2A domain to Rap1GAP2 and to phospholipids can occur. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is regulated by cAMP-dependent protein kinase (cAK or PKA), and kinase activation in platelets enhanced binding of endogenous Rap1GAP2 to Slp1. In-vitro phosphorylation assays revealed that Slp1 is a substrate of PKA, and serine 111 was identified as phosphorylation site. Since Slp1 is a Rab27 binding protein, a trimeric complex of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 is conceivable. The association of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 was investigated by immunofluorescence and co-immuno-precipitation experiments in both, transfected cells and platelets. By Slp1 affinity chromatography and subsequent mass spectrometric analysis additional Slp1 binding proteins were identified in platelets, and binding of Slp1 to Rab8 was confirmed in pull-down assays. To investigate the functional significance of the interaction between Rap1GAP2 and Slp1, an assay system was established to determine serotonin secretion of streptolysin-O permeabilized platelets. Addition of recombinant Slp1 protein to permeabilized platelets strongly inhibited platelet dense granule secretion, whereas addition of recombinant Rap1GAP2 protein or synthetic Rap1GAP2 peptide enhanced secretion. Deleting the Slp1 binding -TKXT- motif abolished the stimulatory effect of Rap1GAP2 on secretion. Addition of Rap1 to permeabilized platelets had no effect on secretion. These findings indicate that the Rap1GAP2 effect on platelet secretion does not depend on the GTPase activating function of Rap1GAP2, but is rather dependent on the -TKXT- mediated interaction of Rap1GAP2 with Slp1. In addition, in-vitro GAP assays revealed that Slp1 binding to Rap1GAP2 does not affect the Rap1GAP activity of Rap1GAP2, and adhesion assays excluded a role for the Rap1GAP2/Slp1 interaction in cell adhesion. Altogether, the results of the present study demonstrate that besides its function in platelet aggregation by controlling the activity of the small guanine nucleotide binding protein Rap1, Rap1GAP2 is involved in platelet dense granule secretion by the new -TKXT- mediated interaction with the Rab27 and membrane binding protein Slp1. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is embedded into an elaborate network of protein-protein interactions in platelets which appear to be regulated by phosphorylation. Future studies will in particular aim to dissect the molecular details of Rap1GAP2 and Slp1 action in platelet secretion and investigate the potential biochemical and pharmacological value of the unique protein binding -TKXT- motif of Rap1GAP2.
Die Analyse der Phosphorylierung mittels Massenspektrometrie stellt in vielerlei Hinsicht große Anforderungen an die Analysenmethoden, die eingesetzt werden. Durch die substöchiometrische Modifzierung einer Aminosäure mit einem Phosphatrest ist die grundlegende Herausforderung der Sensitivtät an anzuwendende Analysetechniken gegeben. Die Biomassenspektrometrie hat mit den weichen Ionisierungmethoden ESI und MALDI zwar die Techniken zur Verfügung gestellt, die eine routinemäßige Identifzierung von vorher per MS nicht zugänglichen Proteinen über die Untersuchung der enzymatischen Spaltpeptides ermöglicht, gleichwohl ist der Aufwand, der für die massenspektrometrische Charakterisierung eines bestimmten Proteins besteht, um ein vielfaches höher. Wegen des in vivo variablen und potentiell sehr geringen Phosphorylierungsgrades ist die genaue Identifizierung der Phosphorylierungstelle allein durch das Vermessen der Probe in einem modernen Massenspektrometer nicht zu bewerkstelligen. Die sich in der Probe befindlichen Phosphopeptide stehen nach einem Verdau des entsprechenden Proteins einer mengenmäßig großen Zahl unphosphorylierter Peptide gegenüber. Auch die hohe Sensitivität von modernen Massenspektrometern reicht in der Regel nicht aus, um das entsprechende Phosphopeptid zu analysieren. Soll die exakte Phosphorylierungstelle des untersuchten Phosphopeptids bestimmt werden, so müssen ausreichende Mengen an Analyten für eine MS/MS-Analyse generiert werden. Bei realen Proben kann der Phosphorlyierungsgrad nicht erhöht werden, somit ist auch die Menge an vorhandenen Phosphopeptiden begrenzt. Somit kommt man an eine Anreicherung von Phosphopeptiden bzw. Abreicherung von unmodifzierten Peptiden nicht vorbei. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Anreicherungstechniken für Phosphopeptide hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität untersucht. Hierfür wurden verschiedene Affinitätstechniken (Graphit, IMAC und TiO¬¬2) hinsichtlich Empfindlichkeit und Selektivität untersucht. Von diesen drei Methoden zeigte sich Graphit aufgrund zu geringer Wechselwirkung zwischen Analyt und Medium als ungeeigneteste Methode. IMAC zeigt bei verbesserter Sensitvität eine höhere Spezifität, gleichwohl saure Peptide nicht von Phosphopeptiden zu trennen sind. Von den drei genannten Methoden zeigte TiO¬¬2 die höchste Sensitivität und Selektivität. Da das TiO¬¬2 als Goldstandard in der Anreicherung von Phosphopeptiden angesehen wird, sollte im Rahmen dieser Dissertation eine neuartige Methode entwickelt werden, die dieser Technik sowohl im Hinblick auf Spezifität und Selektivität überlegen sein sollte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden MALDI-Probenteller erstmals mit Hilfe von SAMs (Self Assembled Monolayers) mit Phosphonatgruppen modifiziert, aus denen durch Beladen mit vierwertigem Zirkonium eine neue funktionelle Oberfläche für die Anreicherung von Phoshopeptiden hergestellt werden kann, die der Titandioxid-Methode überlegen ist. Anhand von reproduzierbaren Modellsystemen von bekannten Phosphoproteinverdaus (z.B. Ovalbumin) konnte gezeigt werden, dass diese neue Technik Analyten im niedrigen Femtomol-Bereich auch vor einem großen nicht-phosphorlyierten Hintegrund selektiv anreichern kann. Um zu demonstrieren, dass die Phosphonat-Oberfläche auch bei realen Proben die massenspektrometrische Phosphorylierungsanalyse ermöglicht, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen die Mitogen Activated Protein Kinase 1 (MAPK-1) aus einem in-Lösungs-Verdau und das Heat Shock Protein (HSP), welches aus einem 2-D-Gel stammt, untersucht. Mit der neu etablierten Phosphonat-Oberfäche konnten die Phosphopeptide aus den Proben angereichert und mittels MALDI-MS/MS die Phosphatgruppe eindeutig der modifizierten Aminosäure zugeordnet werden. Neben dem Komplex der Anreicherungstechniken wurden im Rahmen dieser Dissertation noch andere relevante Fragestellungen für die Phosphoproteomanalytik untersucht. So konnte gezeigt werden, dass für phosphorylierte Peptide keine Suppression der Signale im MALDI-Gerät stattfindet, was eine noch weit verbreitete Meinung in vielen Arbeitsgruppen ist. Auch Versuche zur MALDI-Matrix und deren Kombination mit der Säurekomponente wurden durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass es neben DHB in Kombination mit Phosphorsäure momentan keine bessere Matrix-Kombination gibt. Im Hinblick auf die Quantifizierung der Phosphorlyierung eines Proteins konnte exemplarisch am Ovalbumin als Modellsystem eine einfache und valide Quantifizierungsmethode mit Hilfe der Dephosphorylierung entwickelt werden, die nicht die Nachteile von sonst häufig eingesetzten Derivatisierungsreagenzien besitzt.
Die vorliegende, in kumulativer Schreibweise verfasste Arbeit erläutert die Entwicklung, Charakterisierung und Optimierung zweier unterschiedlicher Leitstrukturen, die als Agonisten von Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) und gleichsam als duale Inhibitoren der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO) wirken. Chemisch betrachtet sind dies zum ersten die Gruppe der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate und zum zweiten die Gruppe der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate. Die Publikation zur Synthese und in vitro-pharmakologischen Charakterisierung der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate an PPAR (Zettl et al., QSAR & Combinatorial Science, 28:576–586, 2009) enthält einerseits die strukturelle Optimierung durch Variation der Aryl-Substitution des zentralen Pyrimidinringes der Leitstruktur und andererseits die durch Docking-Verfahren gestützte Untersuchung des Einflusses der Stereochemie auf die PPAR-Aktivierung. Letztlich konnte durch die Einführung von Biphenyl-Substituenten eine Verbesserung insbesondere der PPARalpha-Aktivität gegenüber der als strukturellen Referenz dienenden alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäure (Rau et al., Archiv der Pharmazie, 341:191–195, 2008) erreicht werden. Mit Hilfe von präparativer enantioselektiver HPLC wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre beiden Enantiomere getrennt. Deren in vitro-pharmakologische Charakterisierung ergab, dass das (R)-Enantiomer insbesondere bei PPARalpha als Eutomer fungiert. Dieses Ergebnis konnte mit Hilfe von Docking-Studien weiter untermauert werden. Hierbei wurde deutlich, dass die Besetzung der linken proximalen Bindetasche der PPARalpha-Liganden-Bindungs-Domäne durch den alpha-n-Hexyl-Rest lediglich im Fall einer (R)-Konfiguration optimal erfolgen kann. Die Synthese und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung der Substanzklasse der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate an PPAR sind in Zettl et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19: 4421-4426, 2009 zusammengefasst. Bei der Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen erwies sich die Leitstruktur als hochaktiv und sehr robust. Je nach Substitutionsmuster des lipophilen Molekülteils wurden potente selektive PPARalpha-Agonisten wie auch PPARalpha-präferenzielle duale PPARalpha/gamma-Agonisten dargestellt. Durch die Synthese von Kohlenstoff-Analoga und alpha-unsubstituierten Verbindungen wurde des Weiteren der Einfluss des Schwefelatoms und des n-Butylrestes in alpha-Position zur Carbonsäure auf die PPAR-Aktivität untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass beide Strukturelemente einen großen Beitrag zur hohen PPARalpha-Aktivität der Leitstruktur leisten. Wie auch bei den alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivaten wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre Enantiomere getrennt und der Einfluss des Stereozentrums in alpha-Position zur Carbonsäure untersucht. Das Ergebnis bestätigte die Resultate der vorangegangenen Studie: Das (R)-Enantiomer wirkte als Eutomer, wobei der stereochemische Einfluss bei PPARalpha besonders deutlich war. Ausgewählte Synthesen und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung von Pirinixinsäurederivaten an mPGES-1, 5-LO sowie der Cyclooxygenase (COX) sind in Koeberle und Zettl et al., Journal of Medicinal Chemistry, 51:8068–8076, 2009 publiziert. Die Arbeit beinhaltet eine umfassende Reihe an Pirinixinsäurederivaten mit Strukturvariationen in alpha-Position zur Carbonsäure und im Aryl-Substitutionsmuster des Pyrimidinringes. Hinsichtlich der alpha-Substitution zeigte sich, dass für Alkylreste eine Kettenlänge von mindestens 6 Kohlenstoffatomen für einen dualen Wirkmechanismus erforderlich ist. Als Leitstruktur für duale mPGES-1/5-LO-Inhibitoren ergab sich somit alpha-n-Hexyl-substituierte Pirinixinsäure, deren Aryl-Substitutionsmuster am zentralen Pyrimidin weiter optimiert wurde. Als vorteilhaft erwies sich die Substitution mit Biphenylresten, wodurch die Darstellung von niedrig mikromolar aktiven dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren gelang. Bei der Analyse der Strukur-Wirkungs-Beziehungen von unterschiedlichen Biphenylresten zeigte sich eine hohe strukturelle Toleranz hinsichtlich der dualen inhibitorischen Aktivität an der mPGES-1 und der 5-LO. Somit stellen die alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate die ersten publizierten dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren dar.