OPUS 4 | Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)

Functional characterization of NOSTRIN in signal transduction and vascular development (2011)

Igor Kovačević

NOSTRIN belongs to the recently defined F-BAR protein family. F-BAR proteins are multi-domain proteins, which serve as adaptors between plasma membrane and cytoskeleton components in processes such as membrane protrusion formation, endocytosis and migration. NOSTRIN encompasses a F-BAR domain at the N-terminus, which mediates membrane association, followed by a HR1 motif and an intermediate domain (ID) domain in the middle, and a SH3 domain at the C-terminus. The domain architecture and ability to form oligomers enable NOSTRIN to coordinate several interaction partners namely dynamin, caveolin, N-WASP and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in the process of eNOS trafficking. In this context NOSTRIN was originally identified and hence termed eNOS traffick inducer. NOSTRIN is expressed in vascularized tissues (e.g. liver and lung) and in primary endothelial cells. Aims of the present work were (1) to investigate if NOSTRIN is involved in other processes besides eNOS trafficking, (2) to analyse the function of NOSTRIN in vivo through knockdown of NOSTRIN in developing zebrafish and (3) to study the consequences of the loss of NOSTRIN on signal transduction in a primary cell culture model derived from NOSTRIN knockout mice. To study the possible involvement of NOSTRIN in other processes besides eNOS trafficking a yeast two-hybrid screen was performed in which fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) was identified as a putative novel interaction partner of NOSTRIN. In a series of yeast two-hybrid, pulldown and co-immunoprecipitation experiments the interaction between NOSTRIN and FGFR1 was confirmed to occur between endogenously expressed proteins and determined to be direct and to depend on the ID domain of NOSTRIN and the 130 C-terminal amino acid residues of FGFR1. FGFR1 is activated by binding of fibroblast growth factors (FGFs) and induces several different signal transduction pathways (e.g. MAPK and Akt pathway). Overexpression of NOSTRIN in HeLa cells specifically enhanced FGF2-dependent MAPK activation. Accordingly, depletion of NOSTRIN attenuated FGF2-dependent MAPK activation and did not affect FGF2-induced Akt activation. In summary, NOSTRIN has been identified as a novel interaction partner of FGFR1 involved in FGF2-dependent signal transduction. The morpholino oligonucleotide-mediated knockdown of NOSTRIN in developing zebrafish caused vascular leakage and irregular vascular patterning e.g. a loss of the proper trajectory of intersegmental vessel and interruptions of the dorsal longitudinal anastomotic vessel. The vascular phenotype was consistent upon use of two different morpholinos and could be rescued in a dose dependent manner by the injection of zebrafish NOSTRIN mRNA. Detailed analysis involving confocal and time lapse microscopy in zebrafish with endothelial specific expression of EGFP revealed that the knockdown of NOSTRIN impacts in vivo on the migration and morphology of endothelial tip cells and leads to a reduction of filopodia number and length. Additionally a NOSTRIN knockout mouse was generated. The analysis of FGFR1 signal transduction in primary mouse lung endothelial cells (MLECs) from NOSTRIN knockout and wild type mice revealed that FGF2-dependent MAPK activation was attenuated in MLECs isolated from NOSTRIN knockout mice when compared to MLECs isolated from wild type mice. The effect of NOSTRIN on FGF2-dependent signal transduction seems to be specific, since VEGF-induced MAPK activation was not affected in NOSTRIN knockout MLECs. The importance of NOSTRIN for FGF2 signal transduction in vivo is demonstrated by the greatly impaired angiogenic response to FGF2 in NOSTRIN knockout mice in matrigel plug assay. In a detailed biochemical analysis it was discovered that NOSTRIN interacts with the activated small GTPase Rac1 and that overexpression of NOSTRIN enhances Rac1 activation. Furthermore, the interactions of NOSTRIN with both Rac1 and its GEF Sos1 are required for NOSTRIN-mediated activation of Rac1. In accordance, activation of Rac1 was not detected upon FGF2 stimulation in NOSTRIN knockout MLECs. In conclusion, the present work describes a novel function of the F-BAR protein NOSTRIN in FGFR1 signal transduction. Data presented in this work demonstrate that NOSTRIN is required for the assembly of a complex consisting of FGFR1, Sos1 and Rac1 and subsequently for the FGF2-dependent activation of Rac1 in endothelial cells.

Die Bedeutung von Zelltod-Prozessen während der Alterung des filamentösen Ascomyzeten Podospora anserina (2011)

Diana Brust

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. In-silico Analysen von putativen Apoptose-Faktoren im Genom von P. anserina Es konnten mehrere Gene, die in einer Apoptose-Maschinerie involviert sein könnten, im Genom von P. anserina identifiziert werden. Diese Homologen wurden in zwei Ka-tegorien unterteilt: (i) die nicht-mitochondrialen Proteine PaMCA1, PaMCA2 und PaPARP und (ii) die Homologen des Apoptose-induzierenden Faktors AIF. 2. Einfluss der Metacaspase-Aktivität auf programmierte Zelltodprozesse Mithilfe von Aktivitätsmessungen konnte eine Arginin-spezifische Aktivität der Meta-caspasen nachgewiesen werden. Diese Metacaspase-Aktivität nimmt in seneszenten Kulturen und nach H2O2-Behandlung signifikant zu. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese eines programmierten, ROS-induzierten Zelltods im letzten Entwicklungs-stadium des Alternsmodell P. anserina. 3. Die Rolle von AIF-Homologen in der Entwicklung von P. anserina GFP-Fusionsproteine identifizierten eine mitochondriale Lokalisation der AIF-Homologen PaAIF2, PaAMID2 und PaPRG3. Desweiteren konnte eine altersabhängige PaAIF2-Translokation von den Mitochondrien zum Zellkern gezeigt werden, ähnlich der Apoptose-induzierenden Translokation von humanem AIF. Die Deletion von PaAif2 und PaAmid2 führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber oxidativem Stress und zu einer Verlängerung der Lebensspanne. Diese Befunde weisen auf einen ROS-induzierten, AIF-vermittelten Zelltod hin, der an der Lebensspannen-Kontrolle von P. anserina beteiligt ist. 4. Die Funktion des Proteins PaCYPD bei Seneszenz und programmiertem Zelltod Membranpotential-Messungen konnten einen Rückgang des mitochondrialen Memb-ranpotentials von 21 % bei den PaCYPD-Überexpressionsstämmen nachweisen. Durch die Behandlung mit dem spezifischen PaCYPD-Inhibitor CSA konnte das Membranpo-tential wieder normalisiert werden. Zusammen mit dem detektierten Verlust von 7 Zusammenfassung 125 Cytochrom c in den Mitochondrien der Überexpressionsstämme wird durch diese Studi-en die Vermutung einer PaCYPD-abhängigen Öffnung der mPTP untermauert. Die Pa-PaCypD-Deletion führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber mitochondrial-abhängigem, oxidativem Stress und gegenüber verschiedenen Apoptose-Induktoren. Die Überexpression von PaCypD hingegen führte zu einem beschleunigten Alterungspro-zess (Präseneszenz), einem verschlechterten Resistenzverhalten gegenüber Stress- und Apoptose-Induktoren und zu einer massiven Verkürzung der Lebensspanne. Die Le-bensspanne konnte aber durch die Behandlung mit CSA wieder auf Wildtyp-Niveau verbessert werden. Dies weist auf einen PaCYPD-vermittelte Zelltod hin. Interessan-terweise konnte durch das Wachstum auf CSA-haltigem Medium auch die Lebensspanne des Wildtyps verlängert werden. Um die hier nachgewiesene, lebensver-längernde Wirkung von CSA zu verifizieren, könnte diese Studie leicht auf andere Modellorganismen übertragen werden.

Strukturelle Organisation und Mobilisierung des Primaten-spezifischen Non-LTR-Retrotransposons SVA (2011)

Julija Raiz

SVA-Elemente repraesentieren die juengste Familie der Non-LTR-Retrotransposons, welche das humane Genom fortwaehrend modifizieren. SVA-Elemente zeichnen sich durch ihre Organisation aus zusammengesetzten repetitiven Elementen aus. Um Rueckschluesse auf den Assemblierungsprozess, der zur gegenwaertigen Organisation der SVA-Elemente fuehrte, und ueber transkriptionelle Regulation dieser Elemente zu ziehen, wurden Unterschiede in der Struktur der 116 SVA-Elemente, die auf humanem Chromosom 19 lokalisiert sind, detailliert untersucht. SVA-Elemente konnten in sieben unterschiedliche Strukturvarianten eingeteilt werden, einschliesslich neuer Varianten wie SVA2, 3`-verkuerzte Elemente und Elemente mit 5`- flankierenden Transduktionen. Ich habe auch eine extrem erfolgreiche human-spezifische 5`-Transduktionsgruppe identifiziert, SVA_F1, die trotz ihres jungen evolutionaeren Alters ca. 32% aller Mitglieder der SVA-Subfamilie SVA_F umfasst. Die transkriptionelle Kontrolle einer retrotransponierten und 5`-verkuerzten SVA_F-Kopie durch den Promotor des MAST2-Gens diente als urspruengliches Source-Element dieser umfangreichen 5`- Transduktionsgruppe, die mindestens 84 Elemente einschliesst. Die zusaetzlichen 5`- sowie 3`-Transduktionsereignisse der vollstaendigen Alu-Sequenzen bei Mitgliedern der SVA_F1-Transduktionsgruppe 4 weisen auf ihre wichtige Rolle in der erfolgreichen Expansion im humanen Genom hin. Diese nachtraeglich erworbenen Alu-Sequenzen machen SVA_F1-Familienmitglieder offensichtlich zum besseren Substrat fuer die Trans- Mobilisierung durch die L1-Proteinmaschinerie. Die unterschiedlichen konsekutiven 5`- Tansduktionsereignisse der SVA_F1-Familienmitglieder deuten auf transkriptionelle Kontrolle ihrer Source-Elemente durch eine Vielzahl externer zellulaerer Promotoren hin, die im Laufe der Evolution in Keimzellen aktiv waren. Ausserdem zeigt die Existenz von 5`-Transduktionen, dass SVA-Elemente sich die 5`-flankierenden Sequenzen aneignen koennen. Die Daten zeigen auch, dass SVA-vermittelte 5-Tansduktionsereignisse alternatives RNA-Spleissen an putativen Spleissstellen involvieren. Aus der EST- Datenbankanalyse ist ersichtlich, dass Mitglieder der SVA_F1-Subfamilie auch gegenwaertig transkribiert werden. SVA-Elemente sind hoch aktiv im humanen Genom, aber der Mechanismus ihrer Retrotransposition wurde bislang nicht aufgeklaert. Vorangehende Analysen genomischer SVA-Kopien liessen auf eine L1-vermittelte Mobilisierung schliessen; allerdings wurde der experimentelle Beweis dieser Hypothese bislang nicht geliefert. Mit Hilfe der Zellkultur-basierten Trans-Mobilisierungsassays wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal experimentell bewiesen, dass SVA-Elemente tatsaechlich durch die L1-kodierten Proteine in trans mobilisiert werden. Zu diesem Zweck wurden HeLa-Zellen mit einem vollstaendigen oder mit einem 5`-verkuerzten SVA-Retrotranspositionsreporterkonstrukt sowie mit einem L1-Expressionsplasmid bzw. Leervektor kotransfiziert und dann die jeweiligen Raten der SVA-Retrotransposition anhand Neo-resistenter Kolonien, die mindestens ein de novo-Retrotranspositionsereignis widerspiegeln, bestimmt. Die Experimente zeigen, dass die Entstehung der Neo-resistenten Kolonien von der Koexpression L1-kodierter Proteine abhaengig ist. Ich konnte auch zeigen, dass das vollstaendige SVA-Testkonstrukt - im Gegensatz zum 5`-verkuerzten SVA-Konstrukt - mit einer signifikant hoeheren Retrotranspositionsrate als die Kontrollkonstrukte, die zur Generierung der prozessierten Pseudogenformation eingesetzt wurden, trans-mobilisiert wird. Die Ergebnisse der Trans-Mobilisierungsassays belegen, dass SVA-Elemente ein bevorzugtes Substrat fuer die L1-Proteinmaschinerie darstellen, und ihre 5`-Region einschliesslich der Alu-homologen Sequenz fuer die hohe Retrotranspositionsrate essentiell ist. Die elf analysierten SVA de novo-Integrationsereignisse weisen Merkmale der L1- vermittelten Retrotransposition auf, wie Poly(A)-Enden, L1-EN-spezifische Konsensus- Zielsequenz (NNAUNA), Zielsequenz-Verdoppelungen (TSDs), Mikrohomologien und zusaetzliche Guanosin-Nukleotide am 5`-UEbergang. Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Studien, dass ein signifikanter Teil der Mitglieder der human-spezifischen SVA-Subfamilie aus transkriptioneller Kontrolle ihrer Source-Elemente durch externe Promotoren hervorgeht. Durch die in dieser Arbeit durchgefuehrten in silico-Analysen wurde auch gezeigt, dass SVA-vermittelte 5`- Transduktionsereignisse zur strukturellen Vielfalt der SVA-Elemente fuehren, und eine neue Art von genomischen Umstrukturierungen darstellen, die zur Plastizitaet des humanen Genoms beitragen. Ausserdem bestaetigen die Ergebnisse der Trans- Mobilisierungsassays die Hypothese, dass SVA-Elemente tatsaechlich durch die L1- kodierte Proteinmaschinerie trans-mobilisiert werden. Dabei sind Module am 5`-Ende der SVA-Elemente fuer diesen Prozess hoechst relevant. Die Ergebnisse der Dualen-Luciferase-Reportergen-Assays unterstuetzen die Hypothese, dass innerhalb der SINE-R-Sequenz von SVA H19_27 cis-aktive Elemente vorhanden sind, die auf aehnliche Weise wie die cis-aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von HERV-K reguliert werden. Ausserdem wurde in dieser Arbeit die Existenz interner reguatorischer Sequenzen innerhalb der SVA-Sequenz bestaetigt. Mit Hilfe der Dualen-Luciferase-Reportergen- Assays konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass SVA-Elemente cis-aktive Elemente enthalten, die hauptsaechlich in der SINE-R-Region lokalisiert sind. Diese cis-aktiven Elemente werden auf aehnliche Weise wie die cis-aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von HERV-K reguliert. Die starke transkriptionelle Aktivitaet des vollstaendigen SVA- Testelements und des L1RP-Promotors in den Teratokarzinom-Zelllinien bekraeftigen die Annahme, dass haeufige SVA-Mobilisierung in Keimzellen durch die gleichzeitig hochregulierte SVA- und L1-Transkription bedingt sein koennte. Es konnte gezeigt werden, dass SVA-Elemente cis-aktive Elemente enthalten, die hauptsaechlich in der SINE-R-Region lokalisiert sind, und auf aehnliche Weise wie die cis- aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von HERV-K reguliert werden. Die starke transkriptionelle Aktivitaet des vollstaendigen SVA-Testelements und des L1RP-Promotors in Teratokarzinom-Zelllinien bestaetigen die Annahme, dass haeufige SVA- Retrotransposition in Keimzellen durch die gleichzeitig hochregulierte SVA- und L1- Transkription bedingt sein koennte.

The sponges of the Chinese Yellow Sea (2011)

Daniela Henkel

Sponges are one of the major components of benthic communities and are considered to be a key role organism in marine ecosystems. In addition to their importance in terms of biodiversity, sponges are becoming increasingly attractive to the industry, as they themselves or associated symbionts, produce various kinds of secondary metabolites of pharmaceutical properties. Some of them have already been clinically applied. The taxonomic characters of Porifera are limited to only a few morphological and histological characters. In addition, sponges of the same species often show a wide morphological variability, whereas the latter depends on different ecological parameters such as water depth and current conditions. Thus, the taxonomic classification of sponges often becomes a scientific challenge. The fauna of the Yellow Sea rates among the least studied worldwide. At the same time, according to the UN Atlas of the Ocean, the Yellow Sea is one of the most intensively exploited marine areas in the world. This is not least due to the dense human population living in the entire catchment area of the Yellow Sea region. In order to compile medium- and longterm conclusions about the anthropogenic impact on biota of the Yellow Sea, the knowledge of species and their distribution is of crucial importance, as these data form the baseline for all future conservation efforts. Until now the sponge fauna of the Chinese Yellow Sea is insufficiently investigated. Thus, there is only one publication on sponges from this region that has been released hitherto. This paper is dealing with only a view species. However, there is no reference concerning the present location of the voucher material, on which this publication is based on. Consequently, no scientific collection on Porifera from the Chinese part of the Yellow Sea exists to date. In order to compile a documentation of the recent sponge community of the Chinese Yellow Sea, 12 study sites along the coast of the Liaoning Peninsula, China, Northeast Yellow Sea, were investigated with focus on sponge distribution. The corresponding habitats were characterized in regard to their topographical features, abiotic parameters, and common composition of benthic megafaunal and macroalgal assemblages. Due to the lack of comparable studies, a comprehensive literature research on sponges of the shallow Northwest Pacific Ocean was required. As a result the first compilation of publications is presented, dealing with sponges from shallow depths of the northwestern Pacific Ocean. Abstract 2 In the course of this study, 31 sponge species in total were recorded, which are scientifically processed. With the exception of four all specimens were determined to species- level. Twelve out of the total number of species are new to science and are described and classified according to the recent taxonomic system of the phylum Porifera. The results of this study indicate considerable differences in species composition between investigated sites. It is shown that physical factors (particularly current regime, sedimentation, seasonally related variations in temperatures), as well the availability of suitable substrates are directly related to the diversity and abundance of investigated sponge communities. In this context possible adaptation strategies of the corresponding sponges were discussed in detail. Two sponge species, Clathria (Clathria) asodes and Antho (Acarnia) lithophoenix, formerly known exclusively from the northeastern Pacific Ocean, are now recorded from the Northwest Pacific Ocean for the first time. Furthermore, Penares hongdoensis, Clathria (Clathria) hongdoensis and Celtodoryx girardae were synonymized with Penares cortius, Clathria (Clathria) acanthostyli, and Celtodoryx ciocalyptoides respectively. Moreover, the occurrence of eight sponge species, which were known from previous records from the Yellow Sea, could be confirmed. As a result of this study the Asian origin of a sponge species that is invasive to the French and Dutch coasts of the Northeast Atlantic Ocean since the 1990s could be established. Moreover, it is demonstrated that Celtodoryx girardae from the northeastern Atlantic is in fact conspecific with Cornulum ciocalyptoides described by Burton (1935) from the Posiet Bay, Sea of Japan. Apart from taxonomic remarks, variations between populations from both oceans are examined and discussed thoroughly in regard to possible ecological implications. The community of documented sponges shows overlapping with the one from the Sea of Japan. According to the results it is assumed that the endemic degree of the sponges from the Chinese Yellow Sea is rather low to moderate. The material obtained in the course of this study was integrated in the collection of the Senckenbergischen Naturforschenden Sammlungen. Therefore, it is the first scientific collection of sponges from the Chinese Yellow Sea that can be consulted as a basis for all further studies on sponges of this region. The present study is the only investigation of sponges from Dalian and adjacent waters before the spill occurred in the Dalian harbour in July 2010. Therefore, it provides an essential baseline needed to assess the impact of the oil spill on benthic communities.

Das humane endogene Retrovirus-K: Grundlagenforschung und Nutzen als Tumor-assoziiertes Antigen (2011)

Benjamin Kraus

Fast die Hälfte des humanen Genoms besteht aus Retroelementen, die während der evolutiven Entwicklung des Menschen im Genom fixiert wurden. Im Wesentlichen kann man diese Retroelemente in DNA-Transposons, LINEs, SINEs und humane endogene Retroviren unterteilen, dabei nehmen die humanen endogenen Retroviren (HERV) 8% des humanen Genoms ein. Bei einer Unterfamilie, der HERV-K Familie, sind bis heute alle offenen Leserahmen erhalten geblieben. Nach heutigem Erkenntnisstand wird eine Expression dieser Elemente in somatischen Zellen jedoch strikt unterdrückt, denn eine Expression von Retroelementen könnte zu Insertionsmutagenesen führen und letztlich dem Organismus erheblichen Schaden zufügen. Im Gegensatz dazu wird eine reaktivierte Expression von HERV-K häufig in einigen Tumorarten beobachtet: allen voran Keimzelltumore, Melanome und Brustkrebs. Außerdem können in Patienten, die an solchen Tumoren erkranken, häufig HERV-K spezifische Antikörper und mitunter auch gegen HERV-K-gerichtete T-Zellen nachgewiesen werden. Die strikte Unterdrückung der HERV-K Expression in gesunden, somatischen und eine reaktivierte Expression in entarteten Zellen machen HERV-K Proteine daher zu idealen Tumor-assoziierten Antigenen. Auf Grundlage dieser Untersuchungen wurden, in dieser Arbeit, zwei potentielle Tumorvakzine, basierend auf dem hoch attenuierten Modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) hergestellt. Durch homologe Rekombination wurde ein HERV-K gag-pro-pol transgenes MVAHKcon und ein HERV-K env transgenes MVAHKEnv hergestellt und charakterisiert. Darüber hinaus wurden die rekombinanten Viren in einem neu etablierten, syngenen Maus-Tumor-Modell untersucht. MVAHKcon immunisierte Mäuse zeigten eine starke humorale Immunantwort und waren in der Lage subkutane, HERV-K Gag positive Tumore fast vollständig zu eliminieren. MVAHKEnv immunisierte Mäuse zeigten dagegen eine moderate humorale Immunantwort und eine starke T-Zellantwort. Nach therapeutischer Immunisierung mit MVAHKEnv konnte im Mausmodell eine signifikante Reduktion an HERV-K Env positiven Lungenmetasten beobachtet werden. Außerdem konnte durch eine prophylaktische Immunisierung mit MVAHKEnv ein vollständiger Schutz der Mäuse vor der Ansiedlung HERV-K Env-exprimierender Tumore erreicht werden. Die hier vorgestellten HERV-K rekombinanten MVA könnten daher der erste Schritt zu einer Immuntherapie gegen reaktivierte Retroelemente in malignen Tumoren darstellen. MVAHKcon infizierte Zellen produzieren und sekretieren große Mengen HERV-K Virus-ähnlicher Partikel (VLP) somit konnten auch grundlegende Fragestellungen der HERV-K Biologie geklärt Zusammenfassung 123 werden. Durch die Kombination massenspektrometrischer Analysen und N-terminaler Sequenzierungen konnten, die noch nicht bekannten Schnittstellen der retroviralen Protease im HERV-K Gag Protein identifiziert werden. Zudem wurde eine späte Domäne von HERV-K identifiziert und darüber hinaus Wechselwirkungen von HERV-K VLPs mit zellulären Restriktionsfaktoren wie APOBEC3G und CD317 studiert.

Epigenetic regulation of innate immune responses (2011)

Uwe Schaefer

We found that the HMTase G9a, that catalyzes H3K9me2 in euchromatin, plays a key modulatory role in type I IFN expression. This finding raises the possibility of targeted intervention with type I IFN expression by using small synthetic inhibitors of G9a. Given the overall minimal negative effect of G9a-deficiency on differentiated cells, the short-term suppression of G9a could be used to potentiate type I IFN expression during chronic viral diseases such as hepatitis C. Accordingly, pharmacological enhancement of methylation, for example by inhibition of the H3K9me2 specific demethylases, could be potentially used to attenuate type I IFN expression and help to control chronic inflammatory and autoimmune conditions. The mechanism responsible for canvassing the epigenetic profile of type I IFN expressing cells are not known. It is plausible, that similar to neurons, where G9a is targeted to specific loci with the help of noncoding RNAs, IFN expressing cells possess similar mechanisms to target H3K9me2 demethylating enzymes to type I IFN loci, thus keeping these loci accessible for IFN-inducing transcription factors. Identification of non-coding RNAs that may contribute to the establishment of the epigenetic state of IFN producing cells will provide a further opportunity for targeted manipulation of IFN expression. In my thesis, I describe the collaborative experiments that show the ability of synthetic compounds that interfere with the histone readers to suppress inflammation. Our results present a novel concept for the regulation of inflammatory gene expression. The diversity of histone readers and the combinatorial nature of regulation of gene transcription may provide an opportunity for highly selective interference with disease associated transcriptional programs by interfering with specific readers. In the future we plan to address the therapeutic potential of BET antagonists in autoimmune and chronic inflammatory conditions.In summary, the experiments described in my thesis provide an example of how the understanding of the basic mechanisms of chromatin control of gene expression can facilitate novel therapeutic approaches that target chromatin.

Juvenile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis: toponomics approach to identifying new drug targets / von Anna Pupu Ingeborg Krokfors (2011)

Anna Krokfors

Juvenile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis (JNCL) is a rare inherited childhood neurodegenerative disease that is caused by a mutation in the gene CLN3. The function of the protein produced by the gene has remained elusive, and therefore the disease mechanism of JNCL is as of yet unknown. The disease is fatal, and no cure is currently available. We believe that simvastatin shows promise as a possible treatment. Simvastatin is well tolerated in children, and as currently no other viable, less invasive treatment for JNCL exists, at least pilot-scale clinical trials for this new off-label use of simvastatin are warranted. The protein CLN3 has been indicated to have several different subcellular localizations and functions, but conclusive evidence about its role in cellular metabolism is lacking. It is also unclear why the mutation causes the distinct phenotype of the JNCL disease. In order to bring lucidity to the issue, we set out to identify metabolic pathways related to the phenotype of JNCL by using Multi-Epitope Ligand Cartography (MELC) and the related field of toponomics. Toponomic methods are required to process the massive amount of data generated by the MELC runs in order to extract information from them. Our disease model of choice was the CLN3Δex7/8 knock-in mouse. To separate cause from effect, we compared embryonal wild type and mutant mouse brains to their adult counterparts. The first analyses revealed progressively abnormal Combinatorial Molecular Patterns (CMPs, an unit of toponomic data) related to cholera toxin/ganglioside 1 (Ctx/GM1), which is a membrane microdomain marker. Cholesterol is an essential part of microdomains, so we utilized filipin staining to see if there were actual changes in cholesterol concentration and localization between healthy and diseased animals. After the disturbance in cholesterol metabolism was verified, we investigated the metabolic pathway that synthesizes cholesterol, the mevalonate pathway. Simvastatin is a drug that specifically down-regulates the mevalonate pathway. Fish oil affects lipid homeostasis and has some effects similar to those of simvastatin, and both of these drugs have previously been studied for their effects on neurodegenerative diseases. After treatment of mice with these drugs, highperformance liquid chromatography (HPLC) measurements on the brain homogenate showed a decrease in levels of farnesyl pyrophosphate (FPP) and geranyl-geranyl pyrophosphate (GGPP), products of the mevalonate pathway, confirming the effect of these drugs on the brains of the animals. Analyses of motor function of the mice further supported the notion that simvastatin had a positive effect on the condition of the diseased animals. CMP analyses from the simvastatin treated mice showed a rescue of the Ctx/GM1 CMPs, suggesting at least a partial restoration of membrane microdomain homeostasis. Filipin staining revealed reversion of the apparent cholesterol depletion in the adult mutant mouse hippocampus by simvastatin. Interestingly, an additional effect of the treatment was found: simvastatin also affected glutamate receptor homeostasis, especially as regarding to N-methyl-D-aspartate (NMDA) and alphaamino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate (AMPA) receptors. This finding suggested that excitotoxicity could be a part of the disease process, and pointed towards glutamate receptors as possible therapy targets. This is in line with previous studies that have shown that attenuation of AMPA receptors and L voltage-dependent channels improve the phenotype of a JNCL mouse and cell model, respectively. Simvastatin mediates many of its effects via downregulation of the mevalonate pathway products, such as isoprenoids and cholesterol. However, simvastatin also has multiple pleiotropic effects that include suppression of excitotoxicity and granting neuroprotection. It is apparent that simvastatin treatment has a positive effect on JNCL mice, but if its effects are mediated via cholesterol (and membrane microdomains), isoprenoids (and isoprenylated proteins) or via a fully cholesterol independent mechanism remains to be solved. In this study we have shown that with the MELC method and toponomics it is possible to approach rare diseases with confounded disease mechanisms with a hypothesis-free approach, to identify possible drug targets, and to monitor the effects of the drugs on treated individuals. This should open up a new avenue in the research of the many diseases that so far have avoided all attempts at discerning their nature.

Essentielle Schritte im Energiestoffwechsel von Archaeen : Heterodisulfid-Reduktase und dissimilatorische Sulfit-Reduktase (2011)

Kristian Kurt Parey

In dieser Arbeit wurden zwei Schlüsselenzyme des Energiestoffwechsels in Archaeen im Hinblick auf ihre funktionellen, spektroskopischen und strukturellen Eigenschaften untersucht. Die Heterodisulfid-Reduktase (Hdr) katalysiert die Reduktion des terminalen Elektronenakzeptors CoM-S-S-CoB zu CoM-SH (Coenzym M) und CoB-SH (Coenzym B) und spielt eine Schlüsselrolle im zentralen Energie-konservierenden Prozess von methanogenen Archaeen. Hdr existiert in Form von zwei unterschiedlichen Enzymen: HdrDE und HdrABC. Beide weisen ein charakteristisches Cystein-reiches Sequenzmotiv (CCG-Domäne) auf, welches als Bindestelle für ein ungewöhliches [4Fe-4S]-Zentrum dient. Frühere Studien zeigten, dass das [4Fe-4S]-Zentrum in der Untereinheit HdrB lokalisiert ist und als zentraler Bestandteil des aktiven Zentrums die Fähigkeit besitzt, ein Thiyl-Radikal zu binden. Darauf aufbauend wurden genetische, spektroskopische und strukturelle Untersuchungen überwiegend am H2:Heterodisulfid-Oxidoreduktase-Komplex (Mvh:Hdr) aus Methanothermobacter marburgensis oder an der heterolog produzierten Untereinheit HdrB durchgeführt. Das Reinigungsprotokoll des Mvh:Hdr-Komplexes wurde für Kristallisationsexperimente und für ENDOR- und Mössbauer-spektroskopische Studien optimiert. Eine Kristallisation des Mvh:Hdr-Komplexes gelang nicht; doch konnten Kristalle der Heterodisulfid-Reduktase-assoziierten Hydrogenase (Mvh) bis zu einer Auflösung von 3.34 Å vermessen und mit Hilfe der anomalen Information der Elektronentransferweg zwischen den [Fe-S]-Clustern definiert werden. Ergänzende elektronenmikroskopische Studien zeigten einen unsymmetrischen Aufbau des Komplexes. DesWeiteren wurde die Untereinheit HdrB aus M. marburgensis in Methanosarcina acetivorans heterolog produziert und seine Funktionalität kinetisch und spektroskopisch nachgewiesen. Ferner wurde HdrB in Escherichia coli heterolog produziert und gereinigt, um Kristallisationsexperimente durchzuführen und es für ENDOR- und Mössbauer-Studien verfügbar zu machen. Um HdrB spektroskopisch zu vergleichen, wurde eine Untereinheit der Succinat:Chinon Oxidoreduktase (SdhE) aus Sulfolobus solfataricus ebenfalls heterolog in E. coli produziert und mittels ENDOR-Spektroskopie charakterisiert. Ein grundlegender Prozess des biogeochemischen Schwefelkreislaufes ist die dissimilatorische Sulfat-Reduktion, in der Sulfat (SO4 2􀀀) zu Schwefelwasserstoff (H2S) umgewandelt wird. Die dissimilatorische Sulfit-Reduktase (dSir), das Schlüsselenzym im Energiestoffwechsel der Sulfat-Reduzierer, besitzt einen einzigartigen Sirohäm-[4Fe-4S]-Cofaktor, der die Reduktion von Sulfit (SO3 2􀀀) zu H2S in einem 6-Elektronen-Schritt katalysiert. Um diesen Mechanismus zu untersuchen, wurden kinetische, spektroskopische und röntxi Zusammenfassung genkristallographische Methoden angewandt. Die Kristallstrukturen von dSir aus Archaeoglobus fulgidus wurden im Komplex mit Sulfit, Sulfid (S2􀀀), Kohlenmonoxid (CO), Cyanid (CN􀀀), Nitrit (NO2􀀀), Nitrat (NO3 􀀀) und Phosphat (PO4 3􀀀) gelöst. Aktivitätstest und analytische Studien zeigten, dass dSir von A. fulgidus neben Sulfit und Nitrit auch Thiosulfat und Trithionat reduziert und Letztere auch als Intermediate entstehen. Auf dieser Basis wurde ein 3-Stufen-Mechanismus postuliert, wobei jede Stufe aus einem 2-Elektronentransfer, einer Aufnahme von zwei Protonen und einer Dehydrationsreaktion besteht. Im Vergleich zur assimilatorischen Sulfit-Reduktase (aSir) aus E. coli zeigt die dSir-Struktur einen veränderten Substratkanal, eine Rotation des Sulfits um 60° und beträchtliche Konformationsänderungen der katalytischen Reste Arga170 und Lysa211. Aufgrund dieser Änderungen kann ausschließlich in dSir ein weiteres Sulfit-Molekül in van-der-Waals-Kontakt zum an das Sirohäm-gebundene Sulfit oder Schwefel-Sauerstoff-Zwischenprodukt platziert werden, das nötig ist, um Thiosulfat und Trithionat zu synthetisieren.

Retargeted natural killer cells for adoptive cancer immunotherapy (2011)

Christiane Knopp

NK cells are part of the innate immune system, and are important players in the body’s first defence line against virus-infected and malignantly transformed cells. While T cells recognize neoplastic cells in an MHC-restricted fashion, NK cells do not require prior sensitization and education about the target. In leukemia and lymphoma patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation not only T cells but also NK cells have been found to mediate potent graft-versus-tumor effects. Hence, autologous or donor-derived NK cells hold great promise for cancer immunotherapy. Since the generation of highly purified NK cell products for clinical applications is labor-intensive and time consuming, established human NK cell lines such as NK-92 are also being considered for clinical protocols. NK-92 cells display phenotypic and functional characteristics similar to activated primary NK cells. While NK-92 cells are highly cytotoxic towards malignant cells of hematologic origin, they do not affect healthy human tissues. NK-92 cells can be expanded under GMP-compliant conditions, and can therefore be provided in sufficient numbers with defined phenotypic characteristics for clinical applications. Safety of NK-92 cells for adoptive immunotherapy was already shown in two phase I/II clinical trials. In contrast to malignant cells of hematologic origin, most solid tumor cells are not sensitive to unmodified NK-92 cells. Hence, to overcome resistance mechanisms of tumor cells and to broaden the target spectrum of NK-92 cells, gene-modified variants have been generated which express chimeric antigen receptors (CARs) that specifically target tumor surface antigens. The expression of these CARs is sufficient to redirect their cytotoxic activity towards otherwise NK cell-resistant target cells. Extending these earlier approaches, in the framework of this work optimized CAR constructs that target the pancarcinoma antigen epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) were derived and functionally characterized. In collaboration with Heike Daldrup-Link’s laboratory (University of California San Francisco, USA) non-invasive imaging modalities to analyze biodistribution and tumor homing properties of retargeted NK-92 cells were evaluated. To enhance the persistence of adoptively transferred NK-92 cells in vivo, means to overcome NK-92 cells’ dependence on exogenous IL-2 for survival and cytolytic activity were investigated. EpCAM is expressed on a variety of tumors of epithelial origin including ovarian, gastric, colorectal, pancreatic, breast, lung and endometrial cancers. In epithelial cells EpCAM is mainly expressed at basolateral membranes, and EpCAM is involved in calcium-independent homotypic cell-cell adhesions. In tumor cells high and de novo EpCAM expression is not only restricted to basolateral membranes but can also be found on apical membranes. Tumor cells retain EpCAM expression throughout tumorigenesis and metastasis formation. Due to its surface expression and immunogenicity EpCAM has been exploited as target for immunotherapy. In earlier work in our group a prototypic, first generation EpCAM-specific CAR construct (31.z) harboring a murine flexible hinge region and murine CD3 ζ as signaling domain was derived and functionally characterized in NK-92 cells. To reduce the immunogenicity for their potential clinical application, this CAR construct was humanized by exchanging the hinge region and the intracellular signaling domain with corresponding sequences of human origin. In T cells incorporation of additional co-stimulatory domains derived from CD28 and 4-1BB significantly enhanced persistence and anti-tumor effects of adoptively transferred cells. Based on these findings a modified, second generation CAR construct encompassing transmembrane and intracellular regions of CD28 in addition to CD3 ζ intracellular signaling domains was derived (31.28.z). Both CAR constructs were stably expressed in NK-92 cells, and furthermore, expression of both CAR variants promoted antigen-specific lysis of antigen-expressing prostate and breast cancer cell lines. In competition experiments the cytotoxic activity of NK-92/31.z and NK-92/31.28.z cells towards antigen-expressing tumor cells was significantly reduced in the presence of parental MOC31 monoclonal antibody, indicating that binding of the EpCAM-specific CAR to its antigen on tumor cells is necessary to trigger antigen-specific cytotoxicity. At high effector to target ratios NK-92/31.28.z cells displayed slightly higher cytotoxic activity towards EpCAM-expressing target cell lines than NK-92/31.z cells, suggesting that incorporation of co-stimulatory domains had beneficial effects on the cytotoxic activity. For clinical applications the development of non-invasive imaging methods is necessary to follow the biodistribution of adoptively transferred cells and guide the identification of responders and non-responders at an early time point. In collaboration with Heike Daldrup-Link’s laboratory the homing properties of EpCAM-specific NK-92 cells to prostate tumor xenografts in rodent models was analyzed (University of California San Francisco, USA). At that time NK-92 cells expressing the second generation EpCAM-specific CAR 31.28.z were not yet available, and thus homing experiments were performed with NK-92 cells expressing the first generation CAR 31.z. For magnetic resonance imaging studies parental and EpCAM-specific NK-92 cells were labeled with clinical applicable ferumoxide particles. Labeled, gene-modified NK-92 cells displayed reduced CAR expression and reduced cytotoxic activity towards EpCAM-expressing DU145 prostate cancer cells in vitro. Nevertheless, MRI revealed specific accumulation of ferumoxide labeled EpCAM-specific NK-92 cells in DU145 tumor xenografts in athymic rats. In tumor sections of treated animals the presence of EpCAM-specific NK-92 cells was verified by Prussian blue and CD57 staining of tumor sections. In another study homing of DiD-labeled EpCAM-specific NK-92 cells to DU145 tumor xenografts was shown by optical imaging. These findings imply that specific targeting of NK-92 cells is retained in vivo, and that non-invasive imaging strategies can be employed to analyze biodistribution of NK-92 cells. Enhanced persistence of adoptively transferred cytotoxic effector cells has a major impact on the effectiveness of immunotherapy. Primary cytotoxic effector cells as well as NK-92 cells require IL-2 for their proliferation and to gain full activity of their effector functions. To bypass the need of exogenously supplied cytokines, the expression of chimeric cytokine receptors (CCR) harboring IL-2R β and IL-2R γ chains instead of CD3 ζ as signaling domains might initiate cytokine-like signals upon contact with the respective antigen. These interactions might support growth and survival of NK-92 cells in the absence of exogenous IL-2. As a starting point, a codon-optimized ErbB2-specific CAR consisting of the scFv(FRP5) single chain antibody fragment, a human CD8 α hinge region and human CD3 ζ transmembrane and intracellular domains was used. Transmembrane and intracellular domains of IL-2R β and IL-2R γ chains were amplified from NK-92 cell-derived cDNA, and were used to exchange the CD3 ζ domain in the ErbB2-specific construct. In human primary tumors EpCAM and ErbB2 overexpression are frequently found, and often correlate with poor prognosis. Hence, co-expression of ErbB2-specific CCRs with an EpCAM-specific CAR may provide NK cells with antigen-specific killing via EpCAM recognition and with antigen-dependent growth via binding to ErbB2. However, attempts to activate CCRs in NK-92 cells via co-incubation with antigen-expressing cells or cross-linking of the CCRs with recombinant antigen did not result in cytokine-independent but antigen-dependent growth. Likewise, no triggering of signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5) was observed, which is a hallmark of IL-2 mediated signal transduction. The interactions between CCRs and their antigen might not be strong enough to trigger cytokine-like signals supporting the growth of cells in the absence of exogenous cytokines, and furthermore, might not lead to a significant up-regulation of STAT5-mediated signal transduction. An alternative approach to circumvent the need of exogenous cytokines is ectopic expression of homeostatic cytokines IL-2 and IL-15 in lymphocytes. In T cells expression of these cytokines is sufficient to render cells independent from exogenously supplied cytokines. In this work a lentiviral expression vector encoding IL-15 (SIEW-IL15) was generated, and used for transduction of NK-92 cells. This resulted in ectopic expression of IL-15 and cellular proliferation in the absence of exogenously supplied cytokines. Even after prolonged culture without exogenous IL-2, NK-92/IL15 cells retained their cytotoxic activity towards NK-sensitive target cells. Although expression of IL-15 in HC11 and COS-7 cells using the same vector led to secretion of bioactive IL-15 into culture supernatants, neither secreted nor surface-bound IL-15 was detected in NK-92/IL15 cells, implying that IL-15 promotes survival of gene-modified cells in a strictly autocrine fashion. In addition, NK-92 cells that were freshly transduced with SIEW-IL15 could be efficiently enriched by cytokine withdrawal. NK-92/IL15 cells that were co-transduced with an EpCAM-specific CAR retained their ability to grow in the absence of exogenously supplied cytokines and their antigen-specific cytotoxic activity. Based on these results, a bicistronic vector construct was generated allowing the simultaneous expression of a CAR construct and IL-15 as selection marker. EpCAM-specific CAR constructs (31.28.z and 31.TM) were inserted into the bicistronic expression cassette. NK-92 cells were transduced with these bicistronic expression constructs and selected by cytokine withdrawal. After 14 to 21 days of culture in the absence of IL-2 transduced cells grew out from which CAR-expressing NK-92 cells with high and homogenous surface expression were further enriched by FACS sorting. NK-92/31.28.z.IL15 cells displayed high cytotoxic activity towards EpCAM-expressing breast cancer cell lines, while EpCAM-negative melanoma cells were not lysed. The results of this work demonstrate that the expression of first (31.z) and second (31.28.z) generation CARs in NK-92 cells is sufficient to induce antigen-specific cytotoxicity. Furthermore, a specific accumulation of NK-92/31.z cells but not unmodified NK-92 cells was detected in EpCAM-expressing prostate carcinoma xenografts in athymic rats, indicating that specific targeting of these cells is retained in vivo. Ectopic expression of IL-15 renders the cells independent from exogenous cytokines, while they retain their cytotoxic activity even after prolonged culture without IL-2. Furthermore, ectopic expression of IL-15 in NK-92 cells can be used for selective enrichment of gene-modified cells by cytokine withdrawal. Subsequently, bicistronic expression constructs that allow simultaneous expression of a CAR construct and IL-15 as selection marker were generated. Expression of these bicistronic expression vectors in NK-92 cells is feasible, and might facilitate enrichment of gene-modified cells for clinical applications.

Molekulargenetische Analyse trans-aktiver Faktoren der Selenoprotein-Biosynthese in Methanococcus maripaludis (2011)

Tilmann Stock

Da zwischen der bakteriellen und der archaeellen Selenoprotein-Biosynthese deutliche Unterschiede existieren, sollten in dieser Arbeit trans-aktive Faktoren der Selenoprotein-Biosynthese von M. maripaludis molekulargenetisch analysiert werden um weitere Einblicke in die archaeelle Selenocystein-Biosynthesestrategie zu gewinnen. Die folgenden Ergebnisse wurden durch diese Arbeit erhalten: In Archaeen muss der Selen-Donor wie in Bakterien zu Selenophosphat phosphoryliert werden. Ohne die Aktivierung des Selen-Donors sind Archaeen nicht in der Lage Selenoproteine zu synthetisieren. Das für die Phosphorylierung des Selen-Donors verantwortliche Protein stellt in M. maripaludis interessanterweise selbst ein Selenoprotein dar. M. maripaludis ist nicht zwingend auf die Synthese von Selenocystein in einer Zwei-Schritt-Methode ausgehend von Seryl-tRNAsec, durch die Enzyme PSTK und SepSecS, angewiesen. Das Einbringen des bakteriellen Enzyms Selenocystein-Synthase in M. maripaludis, welches die gleiche Reaktion in einem Schritt durchführt, ohne Bildung des Intermediats O-Phosphoseryl-tRNAsec, ermöglicht es dem Organismus ebenfalls Selenoproteine zu bilden. Dies zeigt, dass das Intermediat O-Phosphoseryl-tRNAsec der archaeellen Selenoprotein-Biosynthese-Strategie für M. maripaludis nicht essentiell ist. Durch die Disruption eines notwendigen Faktors in der Selenoprotein-Biosynthese wird in M. maripaludis eine Veränderung der mRNA-Mengen, der für Selenoproteine und deren Cystein-haltigen Isoformen codierenden Gene ausgelöst. Diese Regulation ist unter bestimmten Bedingungen nicht reversibel. Ein Unterschied hinsichtlich der Essentialität des selenierenden Systems konnte zwischen den Stämmen M. maripaludis JJ und M. maripaludis S2 festgestellt werden. In M. maripaludis S2 ist das selenierende System essentiell. M. maripaludis JJ hingegen ist nicht auf Selenoproteine angewiesen. Weder die physiologische noch die molekulare Grundlage konnten im Rahmen dieser Arbeit aufgeklärt werden, allerdings kann das neu identifizierte HesB-ähnliche Selenoprotein als verursachender Faktor ausgeschlossen werden.

Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)

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