TY - THES A1 - Gentile, Alessandra T1 - Understanding cellular and molecular mechanisms of zebrafish cardiomyocyte integrity and valve interstitial cells differentiation N2 - The heart is the first functional organ that develops in the embryo. To become a functional organ, it undergoes several morphogenetic processes. These morphogenetic events involve different cell types, that interact with each other and respond to the surrounding extracellular matrix, as well as intrinsic and extrinsic mechanical forces, assuming different behaviors. Additionally, transcription factor networks, conserved among vertebrates, control the development. To have a better understanding of cell behavior during development, it is necessary to find a model system that allows the investigation in vivo and at single-cell resolution. Thanks to the common evolutionary origin of the different cardiac structures, together with the conserved molecular pathways, the two-chambered zebrafish heart offers many advantages to study cell behavior during cardiac morphogenesis. Here, using the zebrafish heart as a model system, I uncovered the cell behavior behind two of the main cardiac morphogenetic events: cardiac wall maturation and cardiac valve formation. In the first part of this study, I investigated how the cardiac wall is maintained at the molecular level. Using genetic, transcriptomic, and chimeric analyses in zebrafish, we find that Snai1b is required for myocardial wall integrity. Global loss of snai1b leads to the extrusion of CMs away from the cardiac lumen, a process we show is dependent on cardiac contractility. Examining CM junctions in snai1b mutants, we observed that N-cadherin localization was compromised, thereby likely weakening cell-cell adhesion. In addition, extruding CMs exhibit increased actomyosin contractility basally, as revealed by the specific enrichment of canonical markers of actomyosin tension - phosphorylated myosin light chain (active myosin) and the α-catenin epitope α-18. By comparing the transcriptome of wild-type and snai1b mutant hearts at the early stages of CM extrusion, we found the dysregulation of intermediate filament genes in mutants including the upregulation of desmin b. We tested the role of desmin b in myocardial wall integrity and found that CM-specific desmin b overexpression led to CM extrusion, recapitulating the snai1b mutant phenotype. Altogether, these results indicate that Snai1 is a critical regulator of intermediate filament gene expression in CMs and that it maintains the integrity of the myocardial epithelium during embryogenesis, at least in part by repressing desmin b expression. In the second part of this study, I focused on the behavior of valve cells during cardiac development. Using the zebrafish atrioventricular valve, I focus on the valve interstitial cells which confer biomechanical strength to the cardiac valve leaflets. We find that initially AV endocardial cells migrate collectively into the cardiac jelly to form a bilayered structure; subsequently, the cells that led this migration invade the extracellular matrix (ECM) between the two EC monolayers, undergo an endothelial-to-mesenchymal transition as marked by loss of intercellular adhesion, and differentiate into VICs. These cells proliferate and are joined by a few neural crest-derived cells. VIC expansion and a switch from a pro-migratory to an elastic ECM drive valve leaflet elongation. Functional analysis of Nfatc1 reveals its requirement during VIC development. Zebrafish nfatc1 mutants form significantly fewer VICs due to reduced proliferation and impaired recruitment of endocardial and neural crest cells during the early stages of VIC development. Analysis of downstream effectors reveals that Nfatc1 promotes the expression of twist1b, a well-known regulator of epithelial-to-mesenchymal transition. This study shows for the first time that Nfatc1 regulates zebrafish VICs formation regulating valve EMT in part by regulating twist1b expression. Moreover, it proposes the zebrafish valve as an excellent model to study the cellular and molecular process that regulate VIC development and dysfunction. In conclusion, my work: 1) identified an unsuspected role of Snai1 in maintaining the integrity of the myocardial epithelium, opening new avenues in its role in regulating cellular contractility; 2) uncovered the function of Nfatc1 in the establishment of the VIC, establishing a new model to study valve development and function. N2 - Das Herz ist das erste funktionelle Organ, das sich im Embryo entwickelt. Um ein funktionelles Organ zu werden, durchläuft es mehrere morphogenetische Prozesse. An diesen morphogenetischen Vorgängen sind verschiedene Zelltypen beteiligt, die miteinander interagieren und auf die sie umgebende extrazelluläre Matrix sowie auf intrinsische und extrinsische mechanische Kräfte reagieren und dabei unterschiedliche Verhaltensweisen annehmen. Darüber hinaus steuern Transkriptionsfaktornetzwerke, die bei Wirbeltieren konserviert sind, die Entwicklung. Um ein besseres Verständnis des Zellverhaltens während der Entwicklung zu erlangen, muss ein Modellsystem gefunden werden, das die Untersuchung in vivo und mit Einzelzellauflösung ermöglicht. Dank des gemeinsamen evolutionären Ursprungs der verschiedenen Herzstrukturen und der konservierten molekularen Pfade bietet das Zweikammerherz des Zebrafisches viele Vorteile für die Untersuchung des Zellverhaltens während der kardialen Morphogenese. Anhand des Zebrafischherzens als Modellsystem habe ich das Zellverhalten hinter zwei der wichtigsten morphogenetischen Ereignisse des Herzens aufgedeckt: die Reifung der Herzwände und die Bildung der Herzklappen. Im ersten Teil dieser Studie untersuchte ich, wie die Herzwand auf molekularer Ebene erhalten wird. Mit Hilfe von genetischen, transkriptomischen und chimären Analysen in Zebrafischen haben wir herausgefunden, dass Snai1b für die Integrität der Herzwand erforderlich ist. Ein globaler Verlust von Snai1b führt zur Extrusion von CMs aus dem Herzlumen, ein Prozess, der, wie wir zeigen, von der Herzkontraktilität abhängig ist. Bei der Untersuchung der CM-Verbindungen in snai1b-Mutanten haben wir festgestellt, dass die N-Cadherin-Lokalisierung beeinträchtigt ist, was wahrscheinlich die Zell-Zell-Adhäsion schwächt. Darüber hinaus weisen extrudierende CM eine erhöhte basale Aktomyosin-Kontraktilität auf, wie die spezifische Anreicherung von kanonischen Markern der Aktomyosinspannung - phosphorylierte leichte Myosinkette (aktives Myosin) und das α-Catenin-Epitop α-18 - zeigt. Durch den Vergleich des Transkriptoms von Wildtyp- und snai1b-Mutantenherzen in frühen Stadien der CM-Extrusion fanden wir eine Dysregulation von Intermediärfilament-Genen in den Mutanten, einschließlich der Hochregulierung von Desmin b. Wir untersuchten die Rolle von Desmin b für die Integrität der Myokardwand und fanden heraus, dass die CM-spezifische Überexpression von Desmin b zur CM-Extrusion führte, was den Phänotyp der snai1b-Mutanten rekapitulierte. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Snai1 ein entscheidender Regulator der Intermediärfilament-Genexpression in der ZM ist und dass es die Integrität des Myokardepithels während der Embryogenese zumindest teilweise aufrechterhält, indem es die Desmin b-Expression unterdrückt. Im zweiten Teil dieser Studie habe ich mich auf das Verhalten von Herzklappen-Zellen während der Herzentwicklung konzentriert. Anhand der Atrioventrikularklappe des Zebrafisches konzentriere ich mich auf die Klappeninterstitialzellen, die den Herzklappenblättern biomechanische Festigkeit verleihen. Wir stellen fest, dass AV-Endokardzellen zunächst kollektiv in das kardiale Gelee einwandern und eine zweischichtige Struktur bilden; anschließend dringen die Zellen, die diese Migration veranlasst haben, in die extrazelluläre Matrix (ECM) zwischen den beiden EC-Monolayern ein, durchlaufen einen endothelialen bis mesenchymalen Übergang, der durch den Verlust der interzellulären Adhäsion gekennzeichnet ist, und differenzieren sich zu VICs. Diese Zellen proliferieren und werden durch einige von der Neuralleiste stammende Zellen ergänzt. Die Expansion der VICs und der Wechsel von einer pro-migratorischen zu einer elastischen ECM treiben die Dehnung des Klappenblattes voran. Die funktionelle Analyse von Nfatc1 zeigt, dass es während der VIC-Entwicklung benötigt wird. Zebrafisch nfatc1-Mutanten bilden signifikant weniger VICs aufgrund einer verminderten Proliferation und einer gestörten Rekrutierung von Endokard- und Neuralleistenzellen während der frühen Phasen der VIC-Entwicklung. Die Analyse der nachgeschalteten Effektoren zeigt, dass Nfatc1 die Expression von twist1b fördert, einem bekannten Regulator des Übergangs von Epithel zu Mesenchym. Diese Studie zeigt zum ersten Mal, dass Nfatc1 die Bildung von VICs bei Zebrafischen reguliert, indem es die Expression von twist1b reguliert und so die EMT der Klappen steuert. Darüber hinaus stellt die Zebrafischklappe ein hervorragendes Modell dar, um die zellulären und molekularen Prozesse zu untersuchen, die die Entwicklung und Dysfunktion von VICs regulieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Arbeit: 1) eine unerwartete Rolle von Snai1 bei der Aufrechterhaltung der Integrität des Myokardepithels identifiziert und damit neue Wege für seine Rolle bei der Regulierung der zellulären Kontraktilität eröffnet; 2) die Funktion von Nfatc1 bei der Bildung der VIC aufgedeckt und damit ein neues Modell zur Untersuchung der Entwicklung und Funktion der Herzklappe geschaffen. Y1 - 2022 UR - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/70220 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30:3-702201 CY - Frankfurt am Main ER -