TY  - THES
A1  - Elez, Danka
T1  - Production of recombinant human endothelin B receptor in different hosts and its subsequent solubilization and purification
N2  - The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
N2  - Zellen besitzen die Fähigkeit auf verschiedene Signale aus ihrer Umgebung adäquat zu reagieren und dadurch mit anderen Zellen zu kommunizieren. Die Signale werden durch eine große Anzahl unterschiedlicher Signalstoffe - von Proteinen und kleinen Peptiden über Aminosäuren, Nukleotide, Steroide und Fettsäurederivate bis hinzu gelösten Gasmolekülen wie Stickstoffmonoxid - vermittelt. Einige dieser Moleküle, die klein und hydrophob sind, dringen in die Zielzelle ein, indem sie durch die Lipiddoppelschicht der Zellmembrane diffundieren. Sie aktivieren intrazelluläre Rezeptoren, die dann direkt auf der Ebene der Gentranskription wirken. Die meisten extrazellulären Signalstoffe aber sind hydrophil und folglich nicht in der Lage in die Zelle durch Diffusion einzudringen. Stattdessen binden diese Botenstoffe an der extrazellulären Seite von integralen Membranproteinen, Membranrezeptoren genannt, und lösen eine Signalkaskade im Inneren der Zelle aus. Die größte und pharmakologisch interessanteste Gruppe der Membranrezeptoren ist die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (G-protein coupled receptors (GPCR)). GPCR-kodierende Gene machen zwischen ein und fünf Prozent des Wirbeltiergenoms aus (ca. 1% des menschlichen Genoms). Da G-Protein gekoppelte Rezeptoren der Angriffspunkt vieler Medikamente sind, sind sie von großer Bedeutung für die pharmazeutische Industrie. GPCRs besitzen sieben die Membran durchspannende Helices (sieben transmembrane Helices) und sind für die Übertragung des Signals aus der extrazellulären Umgebung in die Zelle verantwortlich. Die Signalkaskade hat folgenden Ablauf: der Ligand, der auf der extrazellulären Seite bindet, löst eine Konformationänderung des Rezeptors aus. Wenn der Ligand ein Agonist ist, wird diese Konformationsänderung auf die intrazelluläre Seite des Rezeptors übertragen, wodurch hetrotrimere G-Protein an ihn binden. Die Bindung an dem Rezeptor verursacht die Dissoziation des G-Proteinkomplexes in alpha und betagamma Untereinheiten, welche daraufhin verschiedenen Effektorsysteme aktivieren. Um den Mechanismus der Signalübertragung zu verstehen und neue Angriffspunkte für diese medizinisch wichtige Proteinfamilie entwickeln zu können ("structure-based drug design"), ist die dreidimensionale (3D) Strukturaufklärung notwendige Voraussetzung. Bisher ist nur eine hochauflösende Struktur des Rhodopsin aus Rinder-Retina mit einer Auflösung von 2,8 Å gelöst worden. Die Struktur anderen GPCRs wurde daraufhin am Computer simuliert. Der Endothelin-B-Rezeptor (ETB), dessen Überproduktion, Solubilisierung und Reinigung das Thema dieser Arbeit ist, gehört zur Gruppe A ("Rhodopsin ähnlich") der G-Protein gekoppelte Rezeptoren. Der ETB Rezeptor wird vom Peptidligand Endothelin aktiviert, wodurch die Signalkaskade gestartet wird, die letztendlich zur Erweiterung der Blutgefäße führt. Der ETB Rezeptor ist außergewöhnlich, weil er seinen Ligand fast irreversibel bindet. Deswegen und hinsichtlich seines pharmakologischen Wertes ist seine 3D-Struktur äußerst interessant. Die Voraussetzung für die Aufklärung der 3D-Struktur von G-Protein gekoppelten Rezeptoren ist die Verfügbarkeit großer Mengen homogenen Proteins. Die benötigten Proteinmengen könnten nicht aus natürlichen Quellen gewonnen werden, da das Protein nur in geringen Konzentrationen im Gewebe exprimiert wird. Zusätzliche Probleme liefert die Heterogenität der Rezeptoren, da mit Hilfe von molekularbiologischen und pharmakologischen Techniken verschiedene Subtypen im Gewebe identifiziert werden konnten. Sie sind während der Reinigung sehr schwer oder überhaupt nicht voneinander zu trennen. Um ausreichende Mengen an dem gewünschten Rezeptor homogen zu produzieren, greift man auf geeignete Expressionssysteme für Heterologen Rezeptorproduktion zurück. Jedoch ist die Wahl eines geeigneten Expressionssystems nicht einfach. Es ist zu bedenken, dass es sich bei G-Protein gekoppelten Rezeptoren um Membran-proteine handelt, deren hydrophobe Domänen in die Membran inseriert und richtig gefaltet werden müssen. Zusätzlich können sie eine Vielzahl von komplizierten post-translationalen Modifikationen tragen. Die Eignung verschiedener Expressionssysteme - Hefe, Insekten- und Säugerzellen - zur funktioneller Überproduktion von ETB Rezeptor wurde in dieser Arbeit getestet und anschließend die entsprechenden Solubilisierungs- und Reinigungsmethoden, die eine homogene Rezeptorpräparation zum Ziele hatte. Hefen sind einzellige Eukaryonten, die den Vorteil eines eukaryontischen Wirtes, der die notwendigen post-translationalen Modifikationen an humanen Proteinen durchführen, mit sich bringt. Zusätzlich stellen sie ein kostengünstiges, leicht skalierbares Expressionssystem für die Produktion großer Proteinmengen dar. In dieser Arbeit wurde Pichia pastoris als Wirt zur Produktion von ETB Rezeptor verwendet. Sie ist eine methylotrophe Hefe, die fähig ist als einzige Kohlenstoffquelle Methanol zu nutzen. Die Hauptvorteile von P. pastoris sind wie folgt: 1) ist es möglich mit dem starken Genpromotor der Alkoholoxidase 1 (AOX1) ein hohes Niveau der heterologen Proteinexpression zu erzielen (30% des gesamten Zellproteins) 2) lässt sie sich gut zu hohen Dichten (bis 500g Feuchtgewicht/L) im Fermenter anziehen 3) wird das geklonte Konstrukt mit dem Rezeptorgen beständig in das Hefegenom integriert. Zusätzlich ist die Selektion von Klonen mit mehrfachen Geninsertionen möglich 4) ist P. pastoris zum Durchführen der post-translationalen Modifikationen fähig (Glykosylierung, Phosphorylierung, Palmitoylierung und Disulfidbindungs-anordnungen). 5) gibt es keine Hyperglykosylierung des produzierten Proteins, wie in dem Fall von S. cerevisiae. Insektenzellen und Säugerzellen bieten die authentische Umgebung für die Expression von G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Diese Expressionssysteme haben den eindeutigen Vorteil, dass die Faltung und alle post-translationalen Modifikationen am produzierten Rezeptor leistungsfähig durchgeführt werden. Eine effektive Methode zur transienten Expression von fremden Proteinen in Insekten- und Säugtierzellen bietet sich durch rekombinanten Viren. Eine hohe Infektionsfähigkeit in einer Vielfalt von Zellen, die infiziert werden können, ist der Hauptvorteil dieses Systems. Im Fall von Insektenzellen werden rekombinante Baculoviren (insekten-pathogene doppelsträngige-DNS Viren) genutzt. Rekombinante Alfaviren (kleine umhüllten Viren mit einem einzelsträngigen RNS-Genom) wie z.B. Semliki-Forest-Virus, werden zur transienten Expression des fremden Proteins in Säugerzellen verwendet. Liljestrom & Garoff entwickelten die SFV-Expressionvektoren mit dem Ziel der Produktion großer Mengen von rekombinantem Protein in Säugerzellen (Liljestrom&Garoff, 1991). Das SFV-Expressionssystem hat sich als besonders geeignet für die GPCR-Expression erwiesen (Lundstrom, 2000). Der Endothelin B Rezeptor wurde während dieser Arbeit in unterschiedlichen Wirten produziert: in der Hefe P. pastoris, in Sf9-Insektenzellen und in CHO-Säugerzellen. Die höchste Ausbeute an aktivem Rezeptor wurde in Hefe erhalten; der Klon FlagHisETBBio mit einer Expressionsrate von 60 pmol/mg, erbrachte 1,2 mg Rezeptor/L Schüttelkultur. Durch Fermentation des gleichen P. pastoris Klons im 10L-Fermenter, war es möglich, 3kg Hefezellen zu erhalten, die 20-39 mg des aktiven Rezeptors enthielten. Die Menge an aktivem ETB-Rezeptor, der in Insektenzellen mit einer maximalen Expression von 30 pmol/mg produziert wurde, war 0,7 mg Rezeptor/L Zellkultur. Die damit erreichte Menge stimmt mit den vorher berichteten Werten überein (Doi et al., 1997). Verglichen mit der ETB Rezeptor-produktion in Hefe, ist die Ausbeute an aktivem Rezeptor in Insektzellen niedriger und die Systembehandlung ist zeitaufwändiger, wird aber durch eine homogene Rezeptorpräparation nach der Reinigung belohnt. Die Expression des aktiven ETB-Rezeptors von 7 pmol/mg in den CHO-Zellen ist niedriger als erwartet, wenn man in Betracht zieht, dass das Vektorkonstrukt pSFV3CAPETBHis, der zur Rezeptorproduktion benutzt wurde, ein Gen für das Capsidprotein enthält. Dieses Gen hat ein "translation-enhancer" Signal auf seinem 5'-Ende, das im Fall anderer GPCRs zu in einer mehrfach höheren Expression im Vergleich zum Konstrukt ohne das Capsidprotein führte (Lundstrom et al., 2001). CHO-Zellen sind zweifellos der finanziell anspruchsvollste Wirt für die Rezeptorproduktion und kann mit einer in dieser Arbeit erzielter Expression von ETB-Rezeptor von 7 pmol/mg nicht für eine Rezeptorproduktion in großen Maßstab empfohlen werden. Es sollte erwähnt werden, dass der am häufigsten genutzte Wirt zur Proteinproduktion, E. coli, als Wirt für die ETB-Produktion in dieser Arbeit nicht ausgewertet wurde. Frühere Versuche in E.coli erbrachten 41 aktiv bindende ETB Rezeptor/Zell (Haendler et al., 1993), die erreichten Expressionsraten sind aber zu niedrig, um E. coli als konkurrenzfähiges System für die heterologe Produktion des ETB-Rezeptors im großen Maßstab betrachten zu können. Für die Überproduktion des ETB-Rezeptors in Hefe und Insektenzellen wurde der Klon FlagHisETBBio ausgesucht, der drei verschiedene Affinitätsanhängseln hat. Aufgrund dieser Affinitätsanhängsel war es möglich, einige Reinigungsstrategien zu testen und effizientestere zu bestimmen. Außerdem haben diese "Tags" den immunologischen Nachweis von produzierten Rezeptorfusionen ermöglicht. Der "Bio-Tag" wird in P. pastoris und in den Insektzellen biotinyliert, was durch Immunoblotanalyse mit Streptavidin bestätigt wurde. Die Präsenz von "Bio-Tag" wurde in dieser Arbeit zur Reinigung der Rezeptorfusion mit Avidin verwendet. Auch wurde in dieser Arbeit der Rezeptor immer als Komplex mit dem Liganden ET-1 gereinigt, der an den Rezeptor fast irreversibel bindet und dadurch den nativen Rezeptor stabilisiert. Jedoch war der Nachteil dieser Reinigungsstrategie, dass die Bestimmung der Rezeptorausbeute mittels Radioligandenbindung während der unterschiedlichen Reinigungsschritte nicht möglich war. Der in Hefe überproduzierte Rezeptor wurde mit dem Detergenz n-Dodecyl-beta-D-Maltozid aus Hefemembranen solubilisiert, da in früheren Solubilisierungsstudien an aus Hefe gewonnenem ETB-Rezeptoren dieses Detergenz die besten Ergebnisse erzielte (Schiller et al., 2001). Als effizienteste Rezeptorreinigung hat sich die zweistufige Affinitätschromatographie mittels Ni-NTA und Avidin-Matrix gezeigt. Der Rezeptor wurde zuerst durch die Ni-NTA-Matrix mittels seines His-Tags gereinigt. Nach diesem Reinigungsschritt waren immer noch Verunreinigungen auf dem Silber-gefärbten Gel des Eluats zu sehen. Die Avidin-Affinitätsmatrix wurde als zweiter Schritt in der Rezeptorreinigung eingesetzt. Dieser Reinigungsschritt erbrachte mehr als 95% reinen Rezeptor (durch Silberfärbung abgeschätzt) und meistens enthielt das Eluat nur eine Verunreinigungsproteinbande. Die Versuche, den Rezeptor über andere Affinitätsmatrizen, wie M1-anti-Flag Antikörper und Streptavidin, zu reinigen, wurden wegen starker Aggregationsbildung aufgegeben. Die Aggregationstendenz des in Hefe produzierten ETB-Rezeptors stellte ein ernstes Hindernis für die Kristallisationsanforderungen dar. Zahlreiche Versuche wurden in dieser Arbeit unternommen, um eine Lösung für dieses Problem zu finden. Es gibt eine Vielzahl von möglichen Ursachen für die Rezeptoraggregation. In dieser Arbeit wurde eine Anzahl von Additiven zur Vermeidung dieses Verhaltens ausprobiert. Darunter waren kurzkettige Lipide (1,2-Dicaproyl-n-Glycero-3-Phosphocholine, 0,2%), physikalische Chaperone wie Ectoine und Hydroxyectoine (je 1%), Cholesterin-hemisuccinate (0,5%) und DMSO (2%). Keins dieser Additive konnte die monomere Form des Rezeptors stabilisieren und Bildung von Rezeptoraggregaten völlig verhindern. Nach der Rezeptorproduktion in Baculovirus infizierten Insektenzellen wurde ein geeignetes Detergenz für die Solubilisierung ausgesucht. Die Rezeptoraffinitäts-messungen mittels radioaktivem [I125] ET-1-Liganden zeigten, dass n-Dodecyl-beta-D-Maltosid (LM), Lauryl-Saccharose (LS) und Digitonin/Cholat (D/C) die größte Menge aktiven Rezeptor brachten. LM wurde für die weitere Arbeit verwendet. Das Konstrukt FlagHisETBBio aus Insektenzellenmembranen wurde mit LM solubilisiert und in zwei Schritten mittels über Ni-NTA- und Avidin-Chromatographie analog zur Hefe-Prozedur gereinigt. In diesem Fall gelang es eine homogene Form des ETB-Rezeptors zu erhalten, wie die Gelfiltrationsanalyse (Superose 6) zeigte. Angeregt durch kürzlich erschienene Daten bezüglich der Homo- und Hetero-oligomerisierung von GPCRs, wurde der Oligomerisationszustand des ETB-Rezeptors durch "native blue" Elektrophorese untersucht. Eine deutliche Bande mit einem Molekulargewicht des Rezeptordimers konnte nachgewiesen werden. Jedoch sind weitere Experimente erforderlich, um zu einen definitiven Beweis für die Rezeptordimerisierung zu gelangen, da die native Elektrophorese Artefakten in manchen Fällen produzieren kann. Die Hefe P. pastoris konnte als zuverlässiges Produktionssystem für den ETB-Rezeptor mit hohen Ausbeuten an aktivem Protein etabliert werden. Milligrammmengen des gereinigten Rezeptors wurden nach der Affinitätsreinigung erhalten, die die Ni-NTA und Avidin-Matrizen kombinierte. Jedoch konnte das Problem der Rezeptoraggregation in diesem Fall nur teilweise gelöst werden. Weitere Bemühungen sind erforderlich. Die Rezeptorproduktion in den Insektzellen ergab weniger Rezeptor im Vergleich zu P. pastoris, ist jedoch vielversprechender, da in diesem Fall der Rezeptor in der homogenen monomeren Form nach der Reinigung erhalten wurde. Die in Hefe und Insektenzellen produzierten Mengen des Rezeptors und seine Aktivität stellen eine gute Grundlage für den Beginn der 3D- und zur Fortsetzung von 2D-Kristallisationsversuchen dar. Obwohl die Expression des ETB-Rezeptors in Säugerzellen mittels Semliki-Forest-Virus optimiert werden muss, bietet diese Art transienter Expression interessante Möglichkeiten für Funktionsstudien, da sich der Rezeptor hier in seiner natürlichen Umgebung befindet. Es wäre interessant, die Frage der Rezeptor-Oligomerisierung mittels FRET (Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung) oder BRET (Bio-lumineszenzresonanz-Energieübertragung) zu untersuchen. Diese Methoden waren sehr informativ im Fall von anderen G-Protein gekoppelten Rezeptoren (Bouvier, 2002) und konnten interessante Einblicke über die endogene, aktive Form und die in vivo Dimerisierung des ETB-Rezeptors geben. Bisher gibt es kein Testsystem für in vivo G-Proteinkopplung von G-Protein gekoppelte Rezeptoren, die in P. pastoris produziert wurden. Diese Hefe hat sehr niedrige Menge an endogen exprimierten G-Proteinen und eine sehr begrenzte Zahl unterschiedlicher G-Proteine. Eine Möglichkeit wäre einen P. pastoris Stamm genetisch so zu verändern, dass er entweder das Protein G16 oder Gq und Gi, die Hauptpartner für die Kopplung mit dem ETB, zusammen mit den Untereinheiten betagamma produziert. Bei einem solchen Stamm wäre es möglich, die Rezeptorsaktivität im Hefesphäroplasten nach Ligandenzugabe direkt durch die Ca2+-Konzentrationsänderungen zu messen.
Y1  - 2003
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/5224
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30-0000003840
ER  -