TY  - THES
A1  - Pojeti, René
T1  - Die tumorsuppressive MicroRNA-193b in Wirkstoff induzierter Differenzierung und Proliferation in Akuter Myeloischer und Promyeloischer Leukämie
N2  - Die MicroRNA-193b (miR-193b) fungiert in Akuter Myeloischer Leukämie (AML) als Tumorsuppressor und als Biomarker zur Prädiktion der Überlebenswahrscheinlichkeit bei erwachsenen sowie kindlichen AML-Patienten. Die Expression der miR-193b ist in allen AML-Entitäten reduziert, mit Ausnahme der Akuten Promyelozyten Leukämie (APL), bei der das Level an miR-193b erhöht ist. APL ist auch die einzige Form der AML, bei der All-Trans-Retinoinsäure (ATRA) leit-liniengerecht und effektiv zur Therapie angewendet wird.
In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass der antileukämische irreversible Inhibitor der Lysin-spezifischen Histon Demethylase 1 (LSD1) GSK-LSD1 die Expression von miR-193b induziert. Dadurch wird in murinen Homebox protein A9 (Hoxa9)/Meis Homebox Protein 1 (Meis1) AML-Zellen zumindest ein Teil der tumorsuppressiven Wirkung von GSK-LSD1 über die Hochregulation von miR-193b vermittelt. 
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Gültigkeit des potenziellen GSK-LSD1-Wirkmechanismus über die Induktion von miR-193b in humanen Zellen zu untersuchen. Weitere Ziele waren die Erforschung der Rolle der miR-193b bei dem Behandlungseffekt von ATRA in humaner AML und APL sowie die Untersuchung einer potenziell protoonkogenen Eigenschaft der miR-193b in APL. Der methodische Ansatz dieser Arbeit basierte auf einer Senkung bzw. Erhöhung des intrazellulären miR-193b-Levels mittels Locked nucleic acids (LNA) bzw. lentiviraler miR-193b-Überexpression und anschließender Behandlung der Zellen mit den Wirkstoffen. Es wurden Proliferationskurven erstellt und der Differenzierungsgrad durchflusszytometrisch bestimmt. Eine hohe Aufnahmeeffizienz und Effektivität der LNA und des lentiviralen Überexpressionsvektors wurde durchflusszytometrisch und per quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) bestätigt. 
Zur Untersuchung der Rolle der miR-193b bei dem Behandlungseffekt von GSK-LSD1 wurden die AML-Linien ML-2 und MOLM-13 sowie die APL-Zelllinie NB-4 mit LNA transfiziert bzw. mit dem Überexpressionsvektor transduziert und mit GSK-LSD1 behandelt. Die Populationen mit reduziertem miR-193b-Level wiesen nach 96 Stunden eine unverändert reduzierte Proliferation und Differenzierung auf. Hingegen zeigten miR-193b-überexprimierende Zellen nach GSK-LSD1-Behandlung einen signifikant stärkeren antiproliferativen Effekt. ML-2 Zellen wiesen zudem eine signifikant gesteigerte Differenzierung auf, gemessen an der Expression des Differenzierungsmarkers CD11b. 
Die erhöhten miR-193b-Level in APL-Patienten konnten in der APL-Zelllinie NB-4 mittels qPCR bestätigt werden. NB-4 weist eine über 60-fach höhere miR-193b Expression als ML-2 (AML) auf. Zur Überprüfung einer onkogenen Eigenschaft der miR-193b in APL wurde das zelluläre miR-193b-Level in NB-4-Zellen durch LNA reduziert und anschließend die Proliferationskurve über 12 Tage bestimmt und die Differenzierungsmarker CD11b und CD13 gemessen. Proliferation und Differenzierungsgrad blieben nach Reduktion der miR-193b in NB-4-Zellen unverändert. 
Die gleichzeitige Behandlung von NB-4 mit ATRA und miR-193b-LNA zeigte nach 96 Stunden den gleichen antiproliferativen und differenzierungsinduzierenden Effekt wie bei ATRA allein. Auch bei den AML-Zelllinien ML-2 und MOLM-13 wirkte die ATRA-Behandlung bei reduziertem miR-193b-Level unverändert differenzierungsinduzierend und antiproliferativ. Hingegen führte eine ATRA-Behandlung der AML-Zelllinien bei erhöhtem miR-193b-Level zu einer Verstärkung des antiproliferativen Effekts. Bei beiden AML-Zelllinien wurde die Proliferation mehr als doppelt so stark reduziert als bei alleiniger ATRA-Behandlung. 
Diese Arbeit konnte zeigen, dass miR-193b kein Protoonkogen in der APL-Zelllinie NB-4 ist. Außerdem weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die Wirkungseffekte von sowohl GSK-LSD1 als auch von ATRA, weder in APL noch in AML, über die Induktion der miR-193b vermittelt werden. Hingegen zeigt sich bei beiden Wirkstoffen in AML-Zellen ein additiver antileukämischer Effekt bei Behandlung mit gleichzeitiger Erhöhung des miR-193b-Levels. Die molekulare Begründung hierfür ist möglicherweise eine gemeinsame Modulation der Mitogen-aktivierten Protein Kinase (MAPK)-Signaltransduktionskaskade und bedarf weiterer Experimente zur Überprüfung dieser Hypothese. Ausblickend stellen die Ergebnisse dieser Arbeit die miR-193b als einen interessanten Kombinationspartner für die Therapie mit GSK-LSD1 oder ATRA, bzw. generell für den MAPK Signalweg beeinflussende Medikamente, dar, sobald eine sichere und effiziente Einschleusung von MicroRNAs in Patienten möglich ist.
N2  - MicroRNA-193b (miR-193b) acts as a tumor suppressor in acute myeloid leuke-mia (AML) and serves as a biomarker to predict the probability of survival in adult and pediatric AML-patients. The expression of miR-193b is reduced in all AML entities, apart from acute promyelocyte leukemia, in which the miR-193b-Level is increased. APL is also the only AML entity in which all-trans retinoic acid (ATRA) is used effectively for therapy in accordance with guidelines.
Previous experiments demonstrated that the antileukemic irreversible inhibitor of the lysine-specific histone demethylase 1A (LSD1) GSK-LSD1 was a potent up-regulator of miR-193b. Therefore, at least part of the tumor suppressive effect of GSK-LSD1 in murine Hoxa9 / Meis1 AML cells is mediated via miR-193b.
The aim of this work was to investigate the potential GSK-LSD1 mode of action by the induction of miR-193b in human cells. Further goals of the work were to investigate the role of miR-193b in the treatment effect of ATRA in human AML and APL as well as the interrogation of a potential proto-oncogenic function of miR-193b in APL. The methodical approach of this work was based on loss and gain of intracellular miR-193b by LNA or lentiviral miR-193b overexpression and subsequent treatment with the compounds. Proliferation curves were generated and the degree of differentiation was determined by flow cytometry.
A high uptake efficiency and effectiveness of the LNA and the lentiviral overex-pression vector were confirmed by flow cytometry and by qPCR.
To investigate the role of miR-193b in the treatment effect of GSK-LSD1, ML-2 and MOLM-13 (AML) as well as NB-4 (APL) were transfected with LNA or trans-duced with the miR-193b overexpression vector and then treated with GSK-LSD1. Cells with a reduced miR-193b level showed the same reduced prolifera-tion and differentiation as the control group after 96 hours of GSK-LSD1 treat-ment. Interestingly, miR-193b overexpressing cells showed a significantly stronger antiproliferative effect after GSK-LSD1 treatment than cells with an en-dogenous miR-193b level. ML-2 cells also showed a significantly increased dif-ferentiation, measured by the expression of the differentiation marker CD11b.
The increased miR-193b level in APL-patients could be confirmed in the APL cell line NB-4 by qPCR. MiR-193b expression in NB-4 is over 60 times higher than in ML-2 (AML). To test for an oncogenic property of miR-193b in APL, the cellular miR-193b level in NB-4 cells was reduced by LNA and then the proliferation curve of the cells was determined over a period of 12 days. Also the two differentiation markers CD11b and CD13 were determined by flow cytometry. The proliferation and the degree of differentiation were unchanged in NB-4 cells upon reduction of miR-193b in comparison to the control.
After 96 hours of simultaneous ATRA and miR-193b LNA treatment, an identical antiproliferative effect and induction of differentiation of CD13 and CD11b was found as with ATRA alone. Likewise, ATRA treatment of the AML cell lines ML-2 and MOLM-13 at a reduced miR-193b level resulted in equally strong differentia-tion-inducing and antiproliferative effect. In contrast, ATRA treatment in AML cell lines with an increased miR-193b level boosted the antiproliferative effect. In both AML cell lines the proliferation was reduced more than two-fold than with ATRA treatment alone.
In conclusion this study showed that miR-193b does not act as a protooncogene in the APL cell line NB-4. In addition, the results of this work indicate that the mode of action of both GSK-LSD1 and ATRA, neither in APL nor in AML, are mediated by miR-193b. Importantly, a synergistic or additive antileukemic effect is shown with both compounds in AML cells when treated with a simultaneous increase of the miR-193b level. The molecular justification for this is possibly a joint modulation of the MAPK signal transduction cascade and requires further experiments to test this hypothesis. Looking ahead, the results of this work pre-sent miR-193b as an interesting combination partner for therapy with GSK-LSD1 or ATRA, or in general for drugs that influence the MAPK signaling pathway, as soon as a safe and efficient delivery of miRs into patients is possible.
Y1  - 2022
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/74400
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30:3-744001
CY  - Frankfurt am Main
ER  -