Studies on substrate uptake of the efflux pump AcrB from "Escherichia coli", a multidrug-resistance factor in clinically relevant multiresistant bacterial strains

  • Infections with multidrug resistant bacterial strains like Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa or Acinetobacter baumanii that can accumulate resistance mechanisms against different groups of drugs cause increasing problems for the health care system. Multidrug efflux pumps are able to transport different classes of substances, providing a basic resistance to different antibiotics. Especially when they are overexpressed they can keep bacterial cells alive under antibiotic pressure unless other high level resistance mechanisms like expression of β-lactamases are established. One example for a clinically relevant multidrug efflux pump is the AcrAB/TolC tripartite system of E. coli, that transports a variety of different substrates, including besides antibiotics dyes, detergents, bile salts and organic compounds from the periplasm or the inner membrane out of the cell. AcrB is the inner membrane component of the protein complex that determines not only the substrate specificity of the tripartite system but energises the transport through the whole system process via proton transduction as well. TolC is the outer membrane spanning protein that forms a pore in the outer membrane enabling the system to transport drugs over the latter out of the cell. The periplasmic membrane fusion protein AcrA connects AcrB and TolC in the periplasm completing the channel from the periplasm, respective the inner membrane to the extracellular space. AcrB assembles as trimers, in asymmetric crystal structures each of the protomers adapts a different conformation designated L(oose), T(ight) and O(pen). In the protomers tunnels open up and collaps in different conformations. In the L protomer a periplasmic cleft opens up that can initially bind substrates to the periplasmic part of AcrB. In the T conformation the deep binding pocket opens that is assumed to bind substrates tightly that were bound to the access pocket before. As well in the T conformation a second pathway leading to the deep binding pocket opens that can guide substrates from a groove between transmembrane helices TM7, TM8 and TM9, the TM8 groove, that is connected with socalled tunnel 1 that ends in the deep binding pocket. In the O conformation a new tunnel opens that connects the collapsing deep binding pocket with the periplasmic space, respective the channel through the periplasmic space formed from AcrA and TolC. Substrates were cocrystallised in access and deep binding pocket verifying their role in substrate transport. In the TM8 groove in high resolution crystal structures DDM molecules were cocrystallised in L and T conformation, indicating that the AcrB substrate DDM may utilise this entrance to the deep binding pocket. The asymmetry observed in the AcrB trimers trongly suggests a peristaltic pump mechanism. The functional rotation cycle demands communication between the subunits and tight control of substrate load of protomers during the transport to optimise the ration between protons that are transduced and substrates transported. Indeed it was shown that AcrB transport mechanism is positively cooperative for some β-lactam substrates. For the communication between the subunits it was assumed that ionic interaction between ion pairs established between charged amino acids at the interfaces of protomers in different conformations are of special importance. Thus the amino acids engaged in ionic interactions, respective ion pairs D73-K131, E130-K110, D174-K110, R168, R259-E734 were substituted with non-charged amino acids pairwise and phenotypes were determined in plate dilution assays and MIC experiments. No evidence for a general, substrate independent, reduction of AcrB activity, that would be expected when the ionic residues are of special importance for AcrB function, could be found with the methods applied. Substitutions were not only combined pairwise according to the putative ion pairs but as well in combinations of R168A with D174N, E130Q and K131M. AcrB activity is reduced for the variant R168A_D174N significantly, activity decreases further for quadruple variant E130Q_K131M_ R168A_D174N. Because the reduced activity is only observed in this combination of substitutions the phenotype must result from accumulation of small effects of the single substitutions. R168A may destabilise the protomer interfaces, as its side chain is oriented in direction to the neighbouring protomer at all interfaces, enhancing substratespecific effects of substitutions E130Q, K131M, D174N that are not in all conformations oriented towards the neighbouring protomer but as well along the substrate transport pathway. Further investigations to figure out the details of the effects observed were not conducted because fluctuating expression of the variants hindered experimental procedures. In another approach TM8 was in focus of the interest. As mentioned above it is a possible substrate entrance in the inner membrane. The linker between TM8 and the periplasmic PC2 subdomain undergoes a coil-to-helix transition when AcrB cycles through L, T and O conformations. Linking the transmembrane part of AcrB that provides the energy for the transport process via proton transduction with the periplasmic part harbouring the major part of the substrate pathway assignes TM8 and the periplasmic linker (859-876) an important role in the function of AcrB. Thus it was investigated with an alanine-scan of residues 859 to 884 and G/P respective P/G exchange followed by phenotype characterisation in growth curve and plate dilution assays of selected variants. In the phenotype determinations none of the variants, except G861P that seems to cause massive sterical restriction in an α-helical region, displayed a general, substrate independent decrease of AcrB activity. Thus it is concluded that the individual properties of amino acids in TM8 and the periplasmic linker are not of general importance for the mechanism of AcrB. The substitution of individual amino acids had impact on uptake of different substrates in plate dilution assays in a substrate dependent manner. The uptake of some substrates, like erythromycin or chloramphenicol is more affected than that of others with rhodamine 6G resistance being only reduced for the G861P variant. A relation between the PSA of substrates and reduced activity of AcrB was observed. in Substrates with higher PSA values are more affected by substitutions in TM8 or periplasmic linker, resulting in the conclusion that substrates with higher PSA are more likely to be taken up via the TM8 groove/tunnel 1 pathway than those with lower PSA values.
  • Multiresistente Bakterienstämme stellen in ansteigendem Maß ein Problem bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen z. B. mit Klebsiella pneumoniae oder Escherichia coli dar. Ein Faktor bei der Entstehung von klinisch relevanten multiresistenten Bakterienstämmen sind multidrug-Efflux Transporter, wie das tripartite AcrAB/TolC system. Eine besondere Eigenschaft von multidrug-Efflux Transportern ist ihr breites Substratspektrum, das Bakterien ermöglicht, gleichzeitig Resistenzen gegen verschiedene Substratgruppen, z. B. verschiedene Antibiotika-Klassen auszubilden. Im tripartiten AcrAB/TolC System bildet TolC eine Pore durch die äußere Bakterienmembran aus, das periplasmatische Adaptorprotein AcrA verbindet TolC mit dem in der inneren Membran befindlichen multidrug-Efflux Transporter AcrB. Dieser Aufbau ermöglicht den Transport von Substraten aus der inneren Membran oder dem periplasmatischen Raum, die in das System über Substratzugänge von AcrB eintreten durch den periplasmatischen Raum und über die äußere Membran aus der Bakterienzelle zu entfernen. Als Eintrittsstelle für Substrate in den Komplex bestimmt AcrB die Substratspezifität des Systems. Desweiteren stellt es mittels Protonentranslokation die Energie für den Transportprozess bereit. AcrB wurde in asymmetrischen Konformationen kristallisiert, in denen die Protomere unterschiedliche Konformationen einnehmen, die als L(oose), T(ight) und O(pen) bezeichnet werden. Basierend auf der asymmetrischen Organisation der Trimere wird von einem peristaltischen Pumpmechanismus ausgegangen, der eine Regulation des konzertierten Übergangs der Protomere von einer Konformation zur anderen voraussetzt. Um zu klären, ob den Interaktionen zwischen geladene Seitenketten an den Grenzflächen der Protomere eine besonder Bedeutung in der Kommunikation zwischen den Protomeren zukommt, wurden die geladenen Aminosäuren paarweise (D73-K131, K110-E130, K110-D174, R168, R259-E734) durch ungeladene ersetzt. Die Phänotypen, bestimmt mit Plattenverdünnungsassays und Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration, deuten nicht auf eine generelle Bedeutung der Ionenpaare für den peristaltischen Pumpmechanismus hin. Es wurden jedoch für die Varianten R168A_D174N und E130Q_K131M_R168A_D174N drastische Verringerungen der AcrB Aktivität beobachtet, die jedoch nur in diesen Kombinationen und nicht in Einzelsubstitutionen sowie Alanin-Substitutionen auftraten, weshalb von einer Akkumulation sehr kleiner Effekte in den mehrfach substituierten Varianten ausgegangen wird. Aufgrund von starken Schwankungen des Expressionsniveaus der Varianten wurden die beobachteten Effekte nicht weiter untersucht. In einem anderen Ansatz wurde die Rolle einer Furche in der Membranebene von AcrB, der TM8 Furche untersucht. TM8 verbindet die Transmembranbereiche von AcrB mit den periplasmatischen Abschnitten. Der periplasmatische Linker, der TM8 mit der periplasmatischen PC2 Subdomäne verbindet durchläuft während der Übergänge von L zu T zu O einen coil-zu-Helix Übergang, von dem vermutet wurde, dass er für den regelgerechten Ablauf der Veränderungen der einzelnen Subdomänen besondere Bedeutung hat. Für die TM8 Furche wird davon ausgegangen, dass es sich um eine Eintrittsstelle für Substrate handelt, da diese mit einem Tunnel verbunden ist, der in der T Konformation zur deep binding pocket im periplasmatischen Abschnitt des Proteins führt. Mittels eines Alanin-Scans sollten die Rolle des TM 8 Bereichs und des periplasmatischen Linkers für die generelle Aktivität von AcrB sowie für die Aufnahme spezifischer Substrate verifiziert werden. Dabei wurden die Phänotypen mit Wachstumskurven und Plattenverdünnungstests bestimmt. Es konnte keine generelle Einschränkung der Aktivität, außer für die Variante G861P, ermittelt werden, was darauf schließen lässt, dass für die Vermittlerrolle zwischen Transmembranbereich und periplasmatischem Abschnitt die individuellen Eigenschaften einzelner Aminosäuren keine Rolle spielen. Die Beeinträchtigung der Resistenz gegen Substrate waren für einzelne Substitutionen relativ schwach ausgeprägt aber dennoch vorhanden. Dabei zeigte sich, dass ein Zusammenhang zwischen der Polar Surface Area und dem beobachteten Ausmaß der Reduktion der AcrB Aktivität besteht. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass neben der periplasmatischen access binding pocket weitere Eingänge für Substrate in das AcrAB/TolC bestehen, die wahrscheinlich auch von individuellen Substraten alternativ genutzt werden können.

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Author:Nina Uhl
Referee:Klaas Martinus PosORCiD, Clemens Glaubitz
Advisor:Klaas Martinus Pos
Document Type:Doctoral Thesis
Year of Completion:2017
Year of first Publication:2017
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2018/10/11
Release Date:2019/04/16
Page Number:143
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
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