Engineering of yeast for the production of 3-alkylphenols mediated by a polyketide synthase and decarboxylase

  • As fossil resources are diminishing, environmental concerns arise and chemical synthesis often involves expensive catalysts or extensive extraction procedures, the demand for production of industrially relevant compounds from renewable resources increases. In this context, engineering microorganisms for production of specialty chemicals, such as 3-alkylphenols, presents an attractive, environmental-friendly approach. 3-alkylphenols have various applications: due to their antiseptic and stabilizing properties many 3-alkylphenols, including 3-methylphenol (3-MP), are utilized as additives in disinfectant reagents and biological products, while they can be also implemented as platform chemicals for production of lubricating oil additives or flavors. Some 3-akylphenols have potential for transmission control of the disease sleeping sickness that is transmitted by tsetse flies in sub-saharan Africa, since 3-ethylphenol (3-EP) and 3-propylphenol (3-PP) and to a lesser degree 3-MP were found to attract tsetse flies and improved catch rates in impregnated tsetse fly traps. Microbial fermentation of 3-alkylphenols would provide a simple and inexpensive way for local communities in Africa to produce these compounds and prepare their own tsetse fly traps. Some molds synthesize 3-MP as an intermediate during biosynthesis of the mycotoxin patulin. However, the heterologous host Saccharomyces cerevisiae has advantageous traits for industrial application, since it is well characterized, robust, simple to handle and easily genetically accessible. In this thesis, genetical engineering approaches were utilized to establish the yeast S. cerevisiae for biotechnological production of 3-alkylphenols. As a proof of concept, the iterative polyketide synthase from Penicillium patulum, 6-methylsalicylic acid synthase (MSAS), and 6-methylsalicylic acid (6-MSA) decarboxylase PatG from Aspergillus clavatus were heterologously expressed in S. cerevisiae resulting in the first reported de novo biosynthesis of 3-MP via 6-MSA in yeast from sugars (Hitschler & Boles, 2019). It was shown that codon-optimization and genomic integration of heterologous genes, high initial cell densities and a balanced expression of PatG were beneficial for heterologous production of up to 589 mg/L 3-MP in S. cerevisiae. However, toxicity of 3-MP limited higher product accumulation. Different in vivo detoxification strategies were implemented to face this bottleneck. Growth tests revealed that 3-methylanisole (3-MA) is less toxic to the yeast cells than 3-MP. Expression of an orcinol-O-methyltransferase from chinese rose hybrids (OOMT2) was combined with in situ extraction converting the toxic 3-MP product into the volatile 3-MA and accumulating up to 211 mg/L 3-MA in the dodecane phase. Alternatively, up to 533 mg/L 3-MP glucoside were synthesized by expression of a UDP-glycosyltransferase (UGT72B27) from Vitis vinifera in the 3-MP producing strain, revealing saccharose as beneficial carbon source and ethanol growth phase as essential for high 3-MP production, although 3-MP conversions were not yet complete. Both detoxification strategies allowed circumvention of the toxicity imposed limited product accumulation. This was demonstrated when both detoxification strategies were combined with redirection of the carbon flux through deletion of phosphoglucose isomerase gene PGI1 and feeding a mixture of fructose and glucose leading to majorly improved product formation, with up to 899 mg/L 3-MA/3-MP and 873 mg/L 3-MP/3-MP glucoside, compared to less than 313 mg/L product titers in the wild type controls (Hitschler & Boles, 2020). For provision of the tsetse fly attractants 3-EP from propionyl-CoA and 3-PP from butyryl-CoA, the substrate promiscuities of MSAS and PatG were exploited. However, slower formation rates with the alternative substrates propionyl-CoA and butyryl-CoA suggested that competing formation of 6-MSA from the preferred priming unit acetyl-CoA was dominating in vivo. Indeed, 3-EP or 3-PP formation was not observed in 3-MP producing yeast strains. Assuming that intracellular levels of propionyl-CoA and butyryl-CoA were limiting 3-EP and 3-PP formation, different strategies were implemented to raise the supply of these alternative priming units and successfully compete with acetyl-CoA for MSAS priming. Supplementation of propionate increased propionyl-CoA levels by endogenous pathways sufficiently to enable 3-EP formation in yeast mediated by MSAS and PatG. Deletion of the 2-methylcitrate synthases CIT2 and CIT3 revealed that degradation of propionyl-CoA was not limiting 3-EP formation at this stage. In order to raise propionyl-CoA levels further, a heterologous propionyl-CoA synthase (PrpE) was expressed in the 3-MP producing yeast strain leading to up to 12.5 mg/L 3-EP with propionate feeding and blockage of degradation. Moreover, PrpE enabled also 3-EP formation without propionate supplementation suggesting that an endogenous supply of propionate existed that was reactivated by PrpE. As threonine or 2-ketobutyrate feeding increased 3-EP titers in combination with PrpE, this indicated that threonine degradation via 2-ketobutyrate was responsible for the endogenous propionate supply. Moreover, expression of branched-chain ketoacid dehydrogenase complex from Pseudomonas putida combined with PrpE provided propionyl-CoA from endogenous 2-ketobutyrate and raised 3-EP titers up to 5.9 mg/L compared to 2.8 mg/L with only PrpE indicating a potential route for optimization of 3-EP titers independent of propionate or threonine feeding. For 3-PP production from butyryl-CoA, a heterologous ‘reverse ß-oxidation’ pathway was introduced in the 3-MP producing yeast strain providing sufficient butyryl-CoA for biosynthesis of up to 2 mg/L 3-PP. Degradation of the precursor via ß-oxidation was slightly limiting, since deletion of fatty acyl-CoA oxidase POX1 increased 3-PP titers slightly to 2.6 mg/L. As the concentrations of 3-alkylphenols are close to the concentrations implemented in tsetse fly traps, the engineered yeast strains have the potential for simple and inexpensive on-site production of 3-alkylphenols as tsetse fly attractants by local rural communities in Africa. In spite of this success, 3-MP remained the main product in the developed yeast strains. Since 3-EP and 3-PP are more efficient tsetse fly attractants, a shift in substrate specificities of MSAS and PatG is desirable for a more favorable 3-EP/3-MP and 3-PP/3-MP product ratio regarding tsetse fly attraction. During rational engineering of MSAS, the MSASQ625A/I752V mutant showed a beneficial shift of product ratios with up to 11 mg/L 3-EP/63 mg/L 3-MP and 4.5 mg/L 3-PP/116 mg/L 3-MP, compared to a higher proportion of 3-MP with up to 343 mg/L, 11 mg/L 3-EP and 1.5 mg/L 3-PP in the wild type controls. Further engineering of MSAS and PatG might majorly improve production of 3-EP and 3-PP. In summary, this thesis successfully established the yeast S. cerevisiae as cell factory for production of different 3-alkylphenols optimizing expression of the heterologous production pathway, elucidating means to detoxify products and establishing different approaches to increase intracellular levels of acyl-CoA precursors. The engineered yeast strains can be potentially implemented for simple and inexpensive fermentation of tsetse fly attractants in Africa.
  • In dieser Arbeit wurde die Entwicklung von Hefestämmen für die nachhaltige Produktion von 3-Alkylphenolen angestrebt. Neben der Anwendung von 3-Methylphenol (3-MP) als antiseptischen Zusatzstoff und Plattformchemikalie, werden die 3-Alkylphenole 3-Ethylphenol (3-EP) und 3-Propylphenol (3-PP) als Tsetsefliegenlockstoffe zur Eindämmung der von Tsetsefliegen übertragenen Schlafkrankheit eingesetzt. Die mikrobielle Fermentation von 3-Alkylphenolen würde lokalen Gemeinden in Afrika eine einfache und kostengünstige Methode zur eigenen Herstellung von Tsetsefliegenlockstoffen und Installation von Fliegenfallen ermöglichen. Diese Dissertation befasst sich mit der Etablierung und Optimierung der 3-Alkylphenolproduktion in der Bäckerhefe S. cerevisiae mittels gentechnischer Veränderungen. Die heterologe Expression der Phosphopantetheinyltransferase-aktivierten 6-Methylsalicylsäuresynthase (MSAS) und 6-Methylsalicylsäure (6-MSA) –Decarboxylase PatG in Hefe führte zur Umwandlung der Startereinheit Acetyl-CoA über 6-MSA zu 3-MP. Dies war die erste veröffentlichte de-novo-Synthese von 3-MP aus Zuckern in Hefe und es wurden Produktionstiter bis zu 589 mg/L 3-MP erreicht, die allerdings bereits toxisch für Hefezellen waren. Die Produkttoxizität schränkte vermutlich eine höhere Produktansammlung ein. Deshalb wurden als nächstes verschiedene in vivo Entgiftungsstrategien erprobt, um diesen Engpass in der 3-MP-Produktion zu bewältigen. Wachstumstests zeigten, dass die methylierte Form von 3-MP, 3-Methylanisol (3-MA), weniger toxisch für Hefezellen war als 3-MP. Deshalb wurde die Orcinol-O-Methyltransferase (OOMT2) aus chinesischen Rosenhybriden in dem 3-MP-Produktionsstamm exprimiert, um 3-MP in das weniger giftige 3-MA umzuwandeln. Durch zusätzliche in-situ-Extraktion konnten bis zu 211 mg/L des flüchtigen Produkts 3-MA in einer Dodekanphase gesammelt werden. Eine andere Detoxifizierungsstrategie beinhaltete die Glykosylierung von 3-MP durch Expression der UDP-Glykosyltransferase (UGT72B27) von Vitis vinifera im 3-MP-Produzenten. Durch Umlenkung des Kohlenstoffstroms mittels Deletion der Phosphoglukoseisomerase PGI1 und Fütterung einer Glukose/Fruktose-Mischung konnte in Kombination mit der Methylierung und Glykosylierung eine deutliche Produktsteigerung erzielt werden mit 899 mg/L 3-MA/3-MP und 873 mg/L -3-MP/3-MP-Glukosid im Vergleich zu weniger als 313 mg/L Produkttitern in den Wildtypstämmen (Hitschler & Boles, 2020). So konnte im ersten Teil der Arbeit die Produktion des einfachsten 3-Alkylphenols, 3-MP, durch Einbringen eines heterologen Stoffwechselwegs in Hefe etabliert werden und die Produkttiter durch Optimierung der Expression, Fermentationsbedingungen und Detoxifizierung gesteigert werden. Für die mikrobielle Fermentation von Tsetsefliegenlockstoffen in lokalen Gemeinden in Afrika sollte das Produktspektrum der gentechnisch modifizierten Hefestämme um die wirkungsvolleren Tsetsefliegenlockstoffe 3-EP und 3-PP erweitert werden. Hierfür sollte die zuvor berichtete Substratpromiskuität von MSAS und PatG ausgenutzt werden, um die alternativen Startereinheiten Propionyl-CoA und Butyryl-CoA zu nutzen und 3-EP und 3-PP zu produzieren. Die Zugabe von Propionat zu Kulturen mit dem 3-MP-Produktionsstamm ermöglichte die Aktivierung zu Propionyl-CoA durch endogene Stoffwechselwege und steigerte intrazelluläre Propionyl-CoA-Level hinreichend für die Bildung von 3-EP mittels MSAS und PatG. Die Blockierung des Propionyl-CoA-Abbaus hatte keinen Effekt auf die Produkttiter von 3-EP, aber die Expression einer heterologen Propionyl-CoA-Synthetase (PrpE) führte bei Propionat- bzw. Threoninfütterung und optionaler Blockierung des Propionyl-CoA-Abbaus zu 12,5 mg/L bzw. 14.3 mg/L 3-EP in 3-MP-produzierenden Hefestämmen. Die Startereinheit Butyryl-CoA wurde hingegen durch Expression des heterologen „reversen ß-Oxidationswegs“ bereitgestellt für die Biosynthese von 3-PP und die zusätzliche Deletion der Acyl-CoA Oxidase (POX1) erhöhte die Produkttiter leicht von 2 mg/L zu 2,6 mg/L 3-PP. In beiden Fällen blieb 3-MP aber das Hauptprodukt. Eine MSAS-Mutante, MSASQ625A/I752V, bildete nicht nur deutlich weniger 3-MP (weniger als 116 mg/L im Vergleich zu 343 mg/L im Wildtyp) sondern behielt im Propionyl-CoA-optimierten Stammhintergrund und bei Propionatfütterung eine gleich hohe 3-EP-Produktion von 11 mg/L wie der Wildtypstamm bei, während im Butyryl-CoA optimierten Stammhintergrund die 3-PP-Titer zu 4,3 mg/L gesteigert wurden. Dies bedeutete ein deutlich verbessertes Verhältnis der Alkylphenolprodukte im Hinblick auf effizientere Tsetsefliegenlockstoffe. Zusammenfassend konnte in dieser Dissertation die Hefe S. cerevisiae als Produktionsplattform für die Biosynthese von verschiedenen 3-Alkylphenolen etabliert und optimiert werden durch Verbesserung der Expression des heterologen Produktionswegs, Etablierung von Strategien zur Produktdetoxifizierung und durch Bereitstellung verschiedener Wege zur gesteigerten Bildung der verschiedenen Acyl-CoA-Vorläufer.

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Author:Julia HitschlerGND
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Eckhard BolesORCiD, Helge Björn BodeORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Date of Publication (online):2021/02/15
Year of first Publication:2020
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2021/02/05
Release Date:2021/02/15
Tag:3-alkylphenols; 6-methylsalicylic acid synthase; Yeast; polyketide synthase; tsetse fly
Page Number:156
Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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