Reggie/Flotillin proteins in epidermal growth factor receptor trafficking and signaling

  • The reggie protein family consists of two homologous members, reggie-1 and reggie-2, also termed flotillin-2 and flotillin-1, respectively, that are ubiquitously expressed and evolutionarily well conserved, suggesting an important but so far ill-defined function. In various cell types, both reggies have been found to be constitutively associated with lipid rafts by means of acylation modifications and oligomerization. Lipid rafts are glycosphingolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains which have been implicated in several cellular processes including membrane transport and signal transduction through growth factor receptors. However, the molecular details of these processes are still poorly understood. With the observation that reggies colocalize with activated glycosylphosphatidylinositolanchored proteins (GPI-APs) and Fyn kinase in rafts, a role for these proteins in signaling events has been suggested. In agreement with that, we have previously shown that reggie-1 becomes multiply tyrosine phosphorylated by Src kinases in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation, pointing to a function for reggie-1 in growth factor signaling. Furthermore, overexpression of reggie-1 enhances spreading on fibronectin substrate in a tyrosine-dependent manner, thus revealing a role for reggie-1 in regulation of actin cytoskeleton through growth factor receptors. Due to the similarity shared by reggie proteins at amino acid level and to their ability to form hetero-oligomeric complexes, the first aim of this study was to analyze the putative tyrosine phosphorylation of reggie-2 in growth factor stimulated cells. Similarly to reggie-1, reggie-2 was found to be multiply tyrosine phosphorylated by Src kinase and to exist in a molecular complex with Src, with the degree of co-immunoprecipitation dependent on the activity of Src. Recent studies from us have also shown that administration of EGF results in the endocytosis of reggie-1 from the plasma membrane into endosomes, which is in line with a proposed role for reggies in membrane trafficking processes. In order to characterize in detail the endocytic mechanism that mediates the uptake of reggie-1, the dependency of reggie-1 endocytosis on clathrin and dynamin was investigated by means of overexpressing a variant form of Eps15 or a dominant negative form of dynamin-2. In either case the translocation of reggie-1 into endosomes in response to EGF was not affected, and this, together with the results that reggie-1 colocalized with cholera toxin (CTX) but not with transferrin receptor (TfnR) during EGF signaling, indicates that reggie-1 is taken up by means of a dynaminindependent, raft-mediated pathway. These findings are very well in line with recent data showing the pathway of entry into cells of reggie-2 as a raft-mediated endocytic pathway. The endocytosis of reggie-2 in response to EGF was also analyzed in this study. Similarly to reggie-1, in growth factor stimulated cells reggie-2 underwent a translocation from the plasma membrane to endosomes where the two reggies were found to colocalize with each other, suggesting that epidermal growth factor signaling might trigger the endocytosis of reggie oligomers. In addition, colocalization with both the late endosomal marker LAMP3/CD63 and epidermal growth factor receptor (EGFR) was detected, again indicating a function for reggies in signal transduction through growth factor receptors. EGFR has been reported to localize in rafts but, although this association is thought to be functional during EGF stimulation, how segregation of EGFR into rafts modulates its endocytosis and signaling is still under debate. Since reggie oligomers have recently been suggested to define a raft subtype, a further aim of this study was to investigate whether the depletion of reggies by means of small interfering RNA could interfere with the signaling and the trafficking through EGFR. Knockdown of reggie-2 resulted in an altered tyrosine phosphorylation of EGFR in response to EGF, while the degree of ubiquitination was not affected. Less efficient phosphorylation of tyrosine residues, especially of those which are docking sites for Grb2 and Shc, led in turn to an impaired activation of p38 and ERK1/2 MAPKs. Depletion of reggie-2 did not affect the early trafficking of activated EGFRs, with receptors being endocytosed and delivered to late endosomes as efficiently as in control cells. This would be in line with the normal degree of ubiquitination observed for EGFR, as ubiquitin moieties have been proposed to represent sorting tags that ensure receptor endocytosis into early endosomes and its proper intracellular trafficking. On the contrary, after prolonged EGF stimulation, depletion of reggie-2 resulted in a decreased downregulation of both receptor-bound ligand and EGFR, and in their accumulation in intracellular vesicles, thus pointing to a role for reggie-2 in the degradative pathway. Taken all together, these data ndicate that the association of EGFR with reggie-microdomains is likely to be important for proper receptor trafficking and signaling.
  • Lipid Rafts Lipid Rafts sind mit Glycosphingolipiden und Cholesterin angereicherte Mikrodomänen in der Zellmembran, die eine Funktion in verschiedenen zellulären Prozessen, wie z.B. Membrantransport und Signaltransduktion erfüllen. Eine Form der Endocytose, die sogenannte „Clathrin-unabhängige“ Endocytose, ist von Bedeutung für die Internalisierung verschiedener Lipide, Rezeptoren, lipidverankerter Proteine, bakterieller Toxine und Viren. Diese Form der Endocytose ist abhängig von Lipid Rafts. Die am besten untersuchte Variante der Clathrin-unabhängigen Endocytose ist die Caveolae/Raft-abhängige Endocytose, die von kleinen Membraneinbuchtungen, genannt Caveolae, und den dort dominierenden Caveolin-Proteinen vermittelt wird. Allerdings kommen Caveolae in manchen Zellen (z.B. Neuronen, Lymphocyten) nicht vor. Zudem weisen Caveolin-1-Knockout-Mäuse keinen offensichtlichen Defekt auf, was darauf hindeutet, dass andere Formen von Lipid Rafts den Mangel an Caveolae kompensieren können. Obwohl alle Varianten der Raftvermittelten Endocytose einige Gemeinsamkeiten, wie z.B. die Sensitivität gegenüber Cholesterin und Sphingolipiden, aufweisen, ist die Regulation dieser Form der Endocytose nur unzureichend geklärt. Viele in Signaltransduktionsprozesse involvierte Moleküle, z.B. heterotrimere G-Proteine, Kinasen, Rezeptoren für Wachstumsfaktoren sowie Glycosylphosphatidylinositol (GPI)- verankerte Proteine, sind in Membranmikrodomänen angereichert oder werden, wie es für einige Rezeptoren der Fall ist, nach Ligandenbindung in derartige Mikrodomänen rekrutiert (Übersicht in [72]). Deshalb werden Lipid Rafts als eine Signalplattform, in der einzelne Komponenten von Signalkaskaden miteinander in Wechselwirkung treten können, angesehen. Die räumliche und zeitliche Spezifität der Signalweiterleitung wird hierbei durch die kontrollierte Ein- bzw. Ausgrenzung bestimmter Signalmoleküle gewährleistet. Zudem wechselwirken Lipid Rafts miteinander und tauschen sogar Komponenten untereinander aus. Hierdurch kann die Signalweiterleitung zusätzlich moduliert werden. Es wurden bereits verschiedene Membranmikrodomän-Typen identifiziert, jedoch sind weitere Untersuchungen nötig, um deren exakte Zusammensetzung und Funktion aufzuklären. Reggie-Proteine Zur Proteinfamilie der Reggies gehören die beiden homologen, ubiquitär exprimierten und evolutionär hoch konservierten Mitglieder Reggie-1 und Reggie-2, deren genaue Funktion jedoch nicht bekannt ist. Ursprünglich wurden die Reggie-Proteine, die auch als Flotilline bezeichnet werden [77], im Goldfisch als sogenannte Regenerationsmoleküle beschrieben, die vermehrt in den sich regenerierenden Axonen des retinalen Ganglions exprimiert werden [76]. In verschiedenen Zelltypen fand man Reggies in Detergenzien-unlöslichen Membran-Rafts [25]. Reggie-1 wird mittels Myristoylierung an Glycin 2 und Palmitoylierung an den Cysteinen 4, 19 und 20 an der Innenseite der Plasmamembran verankert [85]. Diese Lipidmodifikationen, sowie die Ausbildung von Oligomeren, sind Voraussetzung für die Assoziation von Reggie-1 mit Rafts in der Zellmembran. Die Membranbindung von Reggie-2 wird durch eine Palmitoylierung an Cystein 34 und zwei hydrophobe Bereiche vermittelt [88, 89]. Zudem können sich Reggie-1 und Reggie-2 mit Hilfe ihrer C-Termini zu Homo- und Heterooligomeren zusammenschließen [21, 85, 93]. Aufgrund der Beobachtung, dass Reggies mit aktivierten GPI-verankerten Proteinen (z.B. Thy-1 und Fyn-Kinase) in Rafts colokalisieren [90], geht man von einer Funktion der Reggies in Signaltransduktionsprozessen aus. Nach Stimulation mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) wird Reggie-1 an mehreren Tyrosinresten von Src-Kinasen phosphoryliert und anschließend mittels einer von Tyrosin 163-abhängigen Endocytose von der Plasmamembran in Endosomen transportiert. Zudem resultierte eine Überexpression von Reggie-1 in einer verstärkten Fibronektin-induzierten Zellausbreitung, welche ebenfalls Tyrosin-abhängig ist und auf eine Funktion von Reggie-1 in Wachstumsfaktor-abhängigen Prozessen der Aktinreorganisation schließen lässt [86]. Dass Reggie-Proteine in Membrantransportprozesse involviert sind, wurde in Versuchen mit Reggie-2 knockdown-Zellen gezeigt, in denen die Clathrin-unabhängige Aufnahme der Untereinheit B des Choleratoxins sowie die Endocytose eines GPI-verankerten Proteins vermindert war [99]. Dies deutet auf eine aktive Funktion von Reggie-2 bei der Raftvermittelten Endocytose in Säugerzellen hin. Außerdem wurde für Reggie-2 eine Beteiligung an der Exocytose in Mastzellen postuliert, da ein knockdown von Reggie-2 in einer verminderten Degranulation und Freisetzung von β- Hexosaminidase resultierte [74]. Des Weiteren reichert sich Reggie-2 in Lipid Rafts von Retikolucyten-Exosomen an. Eine Anreicherung bestimmter Moleküle in Exosomen könnte regulierend auf zelluläre Prozesse wirken und dabei von Reggie-2-enthaltenden Lipid Rafts unterstützt werden [7]. Lipid Rafts bei der Signalweiterleitung und dem Transport des EGFR. Der Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR) gehört zu den Transmembran- Tyrosinkinase-Rezeptoren und wird mit der Regulation verschiedener zellulärer Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration in Verbindung gebracht. Die Bindung eines Liganden an den Rezeptor löst dessen Dimerisierung, Autophosphorylierung und die daran anschließende Rekrutierung von Signalmolekülen an den aktivierten Rezeptor aus. Zusätzlich zu den Phosphorylierungen wird der EGFR in einem von c-Cbl vermittelten Prozess ubiquitiniert. Dies ist die Voraussetzung für die Rekrutierung von Komponenten der endocytotischen Maschinerie, die für die Internalisierung des EGFRs in frühe Endosomen sorgen. Von dort gelangt der Rezeptor in späte Endosomen/MVBs, wo die Sortierung in intraluminale Vesikel stattfindet. Die Fusion von späten Endosomen/MVBs mit Lysosomen führt zur Degradation des EGFRs. Nach derzeitigem Kenntnisstand befindet sich ein Teil des inaktiven EGFR in Lipid Rafts. Die molekulare Identität dieser Mikrodomänen ist nur unzureichend geklärt. Ursprünglich wurde postuliert, dass der inaktive EGFR in Caveolae vorliegt [129], allderings wurde dies durch spätere Arbeiten, in denen gezeigt wurde, dass sich nur eine sehr kleine Menge des EGFR in Caveolae befindet, widerlegt [121, 123, 124]. Es wird davon ausgegangen, dass die Migration des EGFRs aus den Lipid Rafts hinaus an die Internalisierung des Rezeptors via Clathrin-beschichteter Vertiefungen (clathrin coated pits) gekoppelt ist [129, 130]. Jedoch sind auch Clathrin-unabhängige Wege denkbar. Die Frage, ob die frühen Ereignisse der EGFR Signaltransduktion in Lipid Rafts stattfinden oder ob ein Verlassen der Lipid Rafts für die Signalweiterleitung notwendig ist, wird kontrovers diskutiert. Es wurde gezeigt, dass die, dem EGFR nachgeschaltete Signalweiterleitung nicht nur in „Nicht-Raft“-Membranen stattfindet. So führte z.B. die Behandlung von Zellen mit EGF zur Rekrutierung von Raf-1 in Lipid Rafts und zu einer erhöhten Aktivität von Raf-1 in Raft-haltigen Fraktionen [130]. Darüber hinaus konnte die gleiche Wachstumsfaktor-abhängige Translokation von Raf-1 in Lipid Rafts auch in Zellen beobachtet werden, die einen mutierten EGFR exprimieren, der die Lipid Rafts nicht verlassen kann. Dies deutet an, dass zumindest ein Teil der MAPK Signalkaskade in Lipid Rafts lokalisiert ist [129]. Ziel der Arbeit Basierend auf der ähnlichen Aminosäuresequenz der Reggie-Proteine und auf deren Fähigkeit, heterooligomere Komplexe auszubilden, sollte zunächst eine mögliche Tyrosinphosphorylierung von Reggie-2, sowie dessen Endocytose nach Behandlung mit Wachstumsfaktoren untersucht werden. In diesem Zusammenhang wurde auch der Mechanismus der Endocytose, als auch das intrazelluläre Kompartiment, zu welchem die Reggies nach deren Endocytose gelangen, näher charakterisiert. Aufgrund ihrer Neigung zur Oligomerbildung (Homo- und Heterooligomere) wird angenommen, dass Reggies einen Subtyp von Raft-Mikrodomänen definieren [21, 85, 92, 93]. Deshalb sollte die molekulare Funktion von sowohl Reggie-1 als auch Reggie-2 in der Signaltransduktion und dem Transport von Wachstumsfaktor-Rezeptoren detailliert untersucht werden. Hierbei standen die Fragen, ob Reggies eine Funktion bei der Endocytose und dem intrazellulären Transport des EGFR, als auch bei der durch den EGFR vermittelten Signalweiterleitung ausüben, im Vordergrund. Ergebnisse und Diskussion Phosphorylierung von Reggie-2 Die Analyse der potentiellen Phosphorylierung von Reggie-2 in HeLa-Zellen nach Behandlung mit Pervanadat ergab, dass Reggie-2 an Tyrosinresten phosphoryliert wird. In weitergehenden Versuchen mit EGFP-gekoppelten Tyrosinmutanten von Reggie-2, in welchen die potentiellen Phosphorylierungsstellen einzeln oder zu zweit zu Phenylalanin mutiert wurden, konnte mit allen untersuchten Fusionsproteinen eine Phosphorylierung festgestellt werden. Demzufolge wird Reggie-2, ähnlich zu Reggie-1, mehrfach tyrosinphosphoryliert. Die Phosphorylierungsintensität einiger Mutanten war im Vergleich zum Wildtyp-Reggie-2 vermindert. Das genaue Phosphorylierungsmuster von Reggie-2 könnte mittels Massenspektrometrie charakterisiert werden. Um der Frage nachzugehen, ob Src ebenfalls in der Lage ist Reggie-2 zu phosphorylieren, wurden kinaseaktive oder -inaktive Formen von Src mit Reggie-2 coexprimiert. Tatsächlich stellte sich heraus, dass die Kinaseaktivität von Src für die Phosphorylierung von Reggie-2 notwendig ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Reggie-2, ähnlich wie Reggie-1 [86, 144], in einem molekularen Komplex mit dieser Tyrosinkinase vorkommt, wobei der Anteil an coimmunpräzipitierten Proteinen von der Src-Aktivität abhängig war. Es ist denkbar, dass Reggie-2, ähnlich wie Reggie-1, welches außerdem von der Fyn-Kinase phosphoryliert werden kann [86], ein Substrat für andere Mitglieder der Src-Familie darstellt. Diese Hypothese wird durch den Befund, dass Fyn mit Reggie-Proteinen in Lymphocyten coimmunpräzipitiert [90], gestützt, bedarf aber weiterer Untersuchungen. Im Falle von Reggie-1 ist bekannt, dass die Src-Kinasen dem EGFR nachgeschaltet sind [86], für Reggie-2 hingegen konnte in der vorliegenden Arbeit die Frage nach dem physiologischen Stimulus der Phosphorylierung nicht geklärt werden. Die Endocytose von Reggie-Proteinen Um die endocytotische Maschinerie, mit welcher die Aufnahme von Reggie-1 abläuft, näher zu charakterisieren, wurde die Abhängigkeit der Endocytose des Reggie-1 von Clathrin und Dynamin untersucht. Hierfür wurde entweder eine Variante des Eps15 oder eine dominantnegative Form des Dynamin-2 überexprimiert. In beiden Fällen war nach EGF-Stimulation keine Beeinträchtigung der Translokation von Reggie-1 in die Endosomen feststellbar. Dieses Ergebnis sowie der Befund, dass Reggie-1 während der EGF-vermittelten Signaltransduktion zwar mit Choleratoxin aber nicht mit dem Transferrinrezeptor colokalisiert, weist auf einen Dynamin-unabhängigen, Raft-vermittelten Weg hin. Die hier dargestellten Ergebnisse stimmen mit kürzlich veröffentlichten Daten überein, die den Eintritt von Reggie-2 in die Zelle über einen Raft-vermittelten endocytotischen Weg beschreiben [99]. In der vorliegenden Arbeit wurde auch die Endocytose von Reggie-2 nach EGF-Stimulation näher untersucht. Ähnlich zu Reggie-1, kommt es nach Wachstumsfaktorstimulation auch zu einer Translokation des Reggie-2 von der Plasmamembran zu den Endosomen, wo beide Reggie-Proteine colokalisieren. Dies deutet auf eine EGF-induzierte Endocytose von Reggie- Oligomeren über einen Clathrin- und Caveolin-unabhängigen, Raft-vermittelten Weg hin. Frick et al. stellten kürzlich fest, dass die Coassemblierung von überexprimiertem Reggie-1 und -2 die Bildung von de novo Membranmikrodomänen zur Folge hat und postulierten deshalb, dass sogenannte „Reggie-Rafts“ einen neuen Endocytoseweg darstellen. Das Kompartiment, in welches Reggie-Proteine nach Endocytose gelangen, wurde als spätes Endosom identifiziert. Dort konnte eine Colokalisation von Reggies sowohl mit LAMP3/CD63, einem Marker des späten Endosoms, als auch mit dem EGFR nachgewiesen werden. Dies deutet auf eine Funktion der Reggie-Proteine bei der Signaltransduktion durch Wachstumsfaktor-Rezeptoren hin. Die Beteiligung von Reggie-Proteinen an der Signalweiterleitung und an dem Transport des EGFR Um die molekulare Funktion der Reggies bei der Signalweiterleitung und dem Transport des EGFR näher zu charakterisieren, wurden Untersuchungen mit siRNAs durchgeführt. Ein knockdown von Reggie-2 resultierte in einer veränderten EGF-induzierten Tyrosinphosphorylierung des EGFR, wohingegen dessen Ubiquitinierung unbeeinflusst blieb.Die verminderte Phosphorylierung von derjeniger Tyrosinreste, die die Bindestellen für Grb2 und Shc bilden, ging mit einer veränderten Aktivierung der MAP-Kinasen p38 und ERK1/2 einher. Hinsichtlich des Transportes und der intrazellulären Verteilung der EGFR-positiven Vesikel, konnten keine Unterschiede zwischen Kontrollzellen und Reggie-2 knockdown-Zellen festgestellt werden. Auch der Transport des durch EGF aktivierten Rezeptors in das späte Endosom wurde nicht durch die Depletion des Reggie-2 beeinflusst. Hierfür spricht auch die, in den Reggie-2-depletierten Zellen, unveränderte Ubiquitinierung des EGFR, da davon ausgegangen werden kann, dass die kovalente Bindung von Ubiquitin an EGFR für dessen endocytotische Aufnahme in frühe Endosomen [113, 151] und den intrazellulären Transport in späte Endosomen ausreichend ist. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die beeinträchtigte Aktivierung des EGFR und die sich anschließende Signalweiterleitung in Reggie-2 knockdown-Zellen nicht auf einen Defekt in der Endocytose zurückzuführen ist. Vielmehr kann die Kompartimentalisierung der frühen Ereignisse der EGFR Signaltransduktion in sogenannte „Reggies/Raft“-Mikrodomänen als ausschlaggebend für das Resultat der Signalwirkung angesehen werden. Nach verlängerter EGF-Stimulation kam es in Reggie-2 knockdown-Zellen zu einem verminderten Abbau von sowohl EGFR, als auch von dessen Liganden, was mit deren Akkumulierung in intrazellulären Vesikeln einherging. Dieser Befund deutet auf eine Beteiligung von Reggie-2 an der Sortierung des EGFR in Richtung der Lysosomen hin. Schlussfolgerung und Ausblick Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen auf, dass Reggie-Proteine die Signalweiterleitung des EGFR modulieren können. Allerdings konnte der hierfür verantwortliche molekulare Mechanismus noch nicht vollständig geklärt werden. Es konnte gezeigt werden, dass einige Adapterproteine, die an der Regulation der EGFRSignaltransduktion beteiligt sind, mit Reggie-2 interagieren können (Tomasovic, unveröffentlichte Daten). Um die Funktion dieser Interaktionen näher zu beleuchten, sind weitere Untersuchungen nötig. Zwar scheinen Reggie-Mikrodomänen für die Einschleusung des EGFR in die Zelle nicht von essentieller Bedeutung zu sein, jedoch kann deren Beteiligung an der Raft-vermittelten Endocytose des EGFR derzeit nicht ausgeschlossen werden. Dieser Frage könnte mittels siRNA-induzierter Depletion von Clathrin in Kombination mit Reggie-2 nachgegangen werden. Die in den Reggie-2 knockdown-Zellen nach längerer EGF-Stimulation beobachtete Akkumulation des EGFR in MVBs weist auf eine Funktion von Reggie-2 in Abbauprozessen hin. Um zu prüfen, ob die Akkumulation des EGFR an der Membran der Endosomen/MVBs oder im Inneren von Vesikeln stattfindet, erscheinen elektronenmikroskopische Untersuchungen vielversprechend. Da Reggies bekannt sind für ihre Beteiligung an Signaltransduktionsprozessen durch GPCRs sowie den Insulinrezeptor [104, 109], wäre es interessant, auch weitere Stimuli und den Einfluss von Reggies auf deren Signalwege zu untersuchen. Dies würde zu einem umfassenderen Verständnis der Funktionen von Reggie-Proteinen beitragen.

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Metadaten
Author:Monia Amaddii
URN:urn:nbn:de:hebis:30-71239
Referee:Anna Starzinski-Powitz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2009/09/25
Year of first Publication:2008
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2009/06/16
Release Date:2009/09/25
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:417687168
Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Weitere biologische Literatur (eingeschränkter Zugriff)
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