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Barbara Walczak

• Neuroendocrine neoplasms of the lung account for approximately 20% of all primary lung tumors. The most frequent entity within this group, as well as the most lethal, is small cell lung cancer (SCLC) occurring in around 15% of the cases. For this particular entity, though there have been several breakthroughs in recent years, overall understanding remains insufficient, especially when it comes to new, personalized therapeutic options. The lack of fresh tissue samples is most certainly one of the limiting factors for research. The goal of this study was to utilize archival formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples of SCLC and, more precisely, to establish and implement an efficient technique for single-cell isolation of substantial quantity and quality for translational cancer research. To establish this technique representative artificial samples and real-life samples have been carefully chosen. To generate single-cell suspensions, two different methods were suggested by current literature based on mechanical disruption (incellPREP by CellSee) and a combination of enzymatic and mechanical disruption (Miltenyi). The feasibility of these two methods was pre-evaluated by subsequent analytics such us Cytospin-PAP staining and flow cytometry to refine the protocol and apply a final selection of samples for 3′ MACE (massive analysis of cDNA ends) RNA-sequencing (GenXPro). By this, pre-analytical quality and secondary analytical output could be evaluated and implemented as a first standard guideline within the Dr. Senckenberg Institute of Pathology for ongoing projects when using archival FFPE samples. To summarize, FFPE samples are an underestimated and rarely used material for single-cell sequencing studies. Therefore, their utilization opens a possibility to apply this technique to different tumor types, especially when fresh or fresh frozen tissue samples are not available. Conducting the proper analysis of data could lead to a deeper understanding of cancer biology and to find new therapeutic vulnerabilities.
• Neuroendokrine Neoplasien der Lunge machen etwa 20 % aller primären Lungentumoren aus. Die häufigste und zugleich tödlichste dieser Gruppe ist das kleinzellige Lungenkarzinom (SCLC), das in etwa 15% der Fälle auftritt. Für diese spezifische Entität, obwohl es in den letzten Jahren einige Durchbrüche gegeben hat, bleibt das Gesamtverständnis unzureichend, insbesondere im Hinblick auf neue, personalisierte therapeutische Optionen. Ein Mangel an frischen Gewebeproben ist sicherlich einer der limitierenden Faktoren für die Forschung. Das Ziel dieser Studie ist es, archivierte FFPE-Proben von SCLC zu nutzen und genauer gesagt eine effiziente Technik zur Einzelzellisolierung in ausreichender Menge und Qualität für translationale Forschung zu etablieren und umzusetzen. Um diese Technik zu etablieren, wurden repräsentative künstliche Proben und Proben aus der Praxis sorgfältig ausgewählt. Zur Generierung von Einzelzell-Suspensionen wurden zwei verschiedene Methoden vorgeschlagen, die in der aktuellen Literatur auf mechanischer Zerlegung basieren (incellPREP von CellSee) und eine Kombination aus enzymatischer und mechanischer Prozessierung (Miltenyi). Die Machbarkeit dieser beiden Methoden wurde durch nachfolgende Analysen wie Cytospin-PAP-Färbung und urchflusszytometrie vorbewertet, um das Protokoll zu verfeinern und eine endgültige Auswahl von Proben unter Verwendung verschiedener Zellzahlen für die 3′ MACE RNA-Sequenzierung (Massive Analysis of cDNA Ends) (GenXPro) durchzuführen. Auf diese Weise konnten die präanalytische Qualität und der sekundäre analytische Output bewertet und als erste Standardrichtlinie im Dr. Senckenberg-Institut für Pathologie für laufende Projekte unter Verwendung von archivierten Proben implementiert werden. Zusammenfassend sind FFPE-Proben ein unterschätztes und selten verwendetes Material für Einzelzell-Sequenzierungsstudien. Daher eröffnet ihre Verwendung die Möglichkeit, diese Technik auf verschiedene Tumorarten anzuwenden, insbesondere wenn frische Gewebeproben nicht verfügbar sind. Die ordnungsgemäße Analyse der Daten könnte zu einem tieferen Verständnis der Krebsbiologie und zur Entdeckung neuer therapeutischer Angriffspunkte führen.