Open Access

Silvia Isabel Kuntschar

• Inflammation is a regulated reaction of the body to control a threat such as infection or injury. An efficient resolution of inflammation is critical to prevent the development of chronic inflammation and to restore tissue homeostasis. Macrophages (Mf) play a crucial role in the onset, but also in the resolution of inflammation, because they phagocytose and eliminate pathogens and tissue debris. Efficient efferocytosis, i.e. the engulfment of apoptotic cells, represents an important trigger for the onset of the resolution response and contributes to the pro-resolving reprogramming of Mf. Despite the importance of post- transcriptional modes of regulation during the resolution phase and translational control as a key node modulating gene expression in immune cells, relevant translational alterations remain largely elusive. In the present study, I aimed to identify translationally regulated targets in inflammatory primary murine Mf upon resolution-promoting efferocytosis. To this end, I used total RNA-sequencing as well as de novo proteomics analyses to determine global transcriptional and translational changes. Sequencing data confirmed that efferocytosis induced a pro-resolution signature in inflammatory Mf and pointed towards translational regulation because the related integrated stress response was enriched upon efferocytosis. While changes of gene expression between efferocytic and non-efferocytic Mf appeared rather small at the transcriptional level, I observed considerable differences at the level of de novo synthesized proteins. This finding suggests a regulation at the level of translation. Furthermore, the tight connection between translational and metabolic changes was confirmed by enriched metabolism-associated terms of targets upregulated by efferocytosis at both RNA and de novo protein level. Interestingly, analysis of translationally regulated targets in response to inflammatory stimulation showed reduced translation for most targets, with only little impact of efferocytosis. Among those targets, I identified pro-resolving matrix metallopeptidase 12 (Mmp12) as a novel candidate, which showed translational repression during early inflammation and translational increase during the resolution phase. Noteworthy, a first indicator for a potential translation regulatory component of Mmp12 were the extremely high mRNA levels and not overly high de novo protein levels. Validation experiments recapitulated a slight elevation of Mmp12 mRNA expression and a significant downregulation of MMP12 intracellular protein levels in inflammatory Mf, as observed in the RNA-seq and de novo proteomics datasets. To investigate whether the discrepancy in mRNA and protein expression were due to changes in translation, I applied polysomal fractionation analysis to determine the translational status of Mmp12. Inflammatory Mf displayed a significantly lower relative Mmp12 mRNA abundance in the late polysomes compared to naïve Mf, suggesting reduced translational efficiency upon inflammatory stimulation. Consequently, extracellular MMP12 levels in the supernatant of inflammatory Mf decreased, although with a slight delay. The functional impact of attenuated Mmp12 translation upon inflammatory stimulation was assessed in migration assays. While siRNA-mediated knockdown of Mmp12 did not alter Mf migration on uncoated plates, it increased migration 3-fold on matrigel/elastin-coated plates. Importantly, the increase in migrated distance driven by siMmp12 could be lowered by the addition of exogenous recombinant MMP12 protein. In line with reduced Mmp12 translation and MMP12 protein in inflammatory Mf, I observed a significant increase in cell migration on matrigel/elastin-coated plates, while it remained unaltered on uncoated plates. Consequently, Mf elastase MMP12 degrades elastin, thereby cell migration along elastin fibers is diminished. In inflammatory Mf, Mmp12 is translationally downregulated, thereby enhancing the migratory capacity. In summary, the present study identifies a substantial contribution of translational regulation in the course of inflammation shown by high changes between inflammatory naïve and efferocytic Mf at the de novo proteomic level. Specifically, I was able to determine the translational regulation of pro-resolving Mmp12, which is repressed during early inflammation and recovers during the resolution phase. Functionally, translational control of MMP12 emerged as a strategy to alter the migratory properties of Mf, enabling enhanced, matrix- dependent migration of Mf during the early inflammatory phase, while restricting migration during the resolution phase.
• Entzündung ist eine regulierte Reaktion des Körpers, um Gefahren wie Infektion oder Verletzung zu kontrollieren. Eine effiziente Entzündungsauflösung ist wichtig, um die Entstehung chronischer Entzündungen zu verhindern und um eine Gewebehomöostase wiederherzustellen. Makrophagen (Mf) spielen eine zentrale Rolle sowohl bei der Entstehung als auch bei der Auflösung von Entzündung, weil sie Pathogene sowie Gewebetrümmer phagozytieren und eliminieren. Die Efferozytose von apoptotischen Zellen ist ein wesentlicher Auslöser für die Entzündungsauflösung und trägt zu einer pro-auflösenden Reprogrammierung von Mf bei. Trotz der Wichtigkeit von post-transkriptionellen Regulationsmechanismen während der Auflösungsphase sowie von Translationskontrolle als wichtige Komponente für die Modulation von Genexpression in Immunzellen, bleiben relevante Translationsveränderungen in weiten Bereichen ungeklärt. Ziel dieser Studie war die Identifizierung translationell regulierter Kandidaten in inflammatorischen primären Maus-Mf während der Efferozytose. Dazu habe ich eine totale RNA-Sequenzierung- sowie de novo Proteomik-Analysen durchgeführt, um globale transkriptionelle und translationelle Veränderungen zu analysieren. Die Sequenzierdaten bestätigten, dass Efferozytose eine pro- auflösende Signatur in inflammatorischen Mf induziert und deuteten auf eine Translationsregulation hin, weil die damit verbundene integrierte Stressantwort bei Efferozytose angereichert war. Während Genexpressionsveränderungen zwischen efferozytotischen und naïven Mf auf transkriptioneller Ebene vergleichsweise gering erschienen, beobachtete ich auf der Ebene de novo synthetisierter Proteine erhebliche Unterschiede. Dieser Befund deutet auf eine Translationsregulation hin. Des Weiteren wurde die enge Verbindung zwischen translationalen und metabolischen Veränderungen bestätigt, weil durch Efferozytose hochregulierte Kandidaten eine Anreicherung in Metabolismus- assoziierten Prozessen zeigten. Interessanterweise zeigte die Analyse translationell regulierter Kandidaten bei inflammatorischer Stimulation eine reduzierte Translation der meisten Kandidaten mit nur geringem Einfluss von Efferozytose. Hierunter zeichnete sich die pro-auflösende Matrix Metallopeptidase 12 (Mmp12) als ein bisher unbekannter Kandidat ab, der zu Beginn der Entzündung translationell reprimiert und in der Auflösungsphase erhöht wurde. Der extrem hohe mRNA Gehalt sowie der nicht übermäßig hohe de novo Proteingehalt sind indikativ für eine potenzielle Translationsregulation von Mmp12. Validierungsexperimente rekapitulierten eine leichte Erhöhung der Mmp12 mRNA Expression und eine signifikante Reduktion des intrazellulären Proteingehalts in inflammatorischen Mf, übereinstimmend mit den globalen Datensätzen. Um herauszufinden, ob die Diskrepanz zwischen mRNA- und Proteinexpression auf Translationsveränderungen zurückzuführen ist, habe ich Polysomfraktionierungsanalysen durchgeführt, die eine Bestimmung des Translationsstatus von Mmp12 erlauben. Inflammatorische Mf zeigten eine signifikant geringere Mmp12 mRNA Abundanz in den späten Polysomen verglichen zu naïven Mf, wodurch auf eine reduzierte Translationseffizienz geschlossen werden kann. Folglich war der extrazelluläre MMP12 Gehalt reduziert, jedoch mit leichter Verzögerung. Die funktionelle Auswirkung verminderter Mmp12 Translation im Entzündungskontext wurde mit Migrationsexperimenten untersucht. Während siRNA-vermittelter „Knockdown“ von Mmp12 die Migration auf unbeschichteten Platten nicht veränderte, erhöhte sich die Migration 3-fach auf Matrigel/Elastin-beschichteten Platten. Die Erhöhung der migrierten Distanz getrieben von siMmp12 konnte durch die Zugabe von exogenem rekombinantem MMP12 Protein gesenkt werden. Übereinstimmend mit reduzierter Mmp12 Translation und Proteingehalt in inflammatorischen Mf, beobachtete ich signifikant erhöhte Zellmigration auf beschichteten Platten. Daher degradiert die Mf Elastase MMP12 Elastin und beeinträchtigt dadurch die Migration entlang von Elastinfasern. In inflammatorischen Mf ist Mmp12 translationell runterreguliert, wodurch die Migrationskapazität gesteigert wird. Zusammenfassend identifiziert diese Studie einen substanziellen Beitrag der Translationsregulation im Entzündungsverlauf, aufgezeigt durch Veränderungen zwischen inflammatorischen naïven und efferozytotischen Mf auf der de novo Proteomik Ebene. Insbesondere konnte ich die Translationsregulation von pro- auflösendem Mmp12 ermitteln, welches in früher Entzündungsphase reprimiert wird und funktionell eine erhöhte, matrix-abhängige Migration von Mf ermöglicht.