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Christine Verena Baum

• Das Prostate-apoptosis-response-gene-4 (Par-4) sensibilisiert neoplastische Lymphozy-ten, deren Malignität durch eine Hemmung der Apoptosefähigkeit gekennnzeichnet ist, für apoptotische Stimuli. Vorhergehende Studien konnten zeigen, daß eine Überexpres-sion von Par-4 bei der Apoptoseinduktion durch Chemotherapeutika zu einer Downregulation von Bcl-2, einer Aktivierung von Caspase-3, einem verstärkten Abfall des Mi-tochondrialen Membranpotentials (MMP), sowie einer verstärkten PARP-Spaltung und dadurch zum programmierten Zelltod führt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere molekulare Mechanismen aufgezeigt werden, über die die apoptosesensibilisierende Wirkung von Par-4 vermittelt wird. Es konnte gezeigt werden, daß bei Behandlung mit Doxorubicin die Par 4 Überexpression außer zur stärkeren Aktivierung von Caspase-3 auch zur stärkeren Aktivierung von Caspase-8 und -9 führt. Außerdem kann eine Caspase 3 Inhibition bei Par-4 Überexpression durch eine alternative Aktivierung der Caspasen-6,-7,-8 und -9 umgangen werden. Dieses veränderte Caspasenaktivitätsmuster läßt sich mit einer Downregulation von Mitgliedern der Inhibitors of Apoptosis Proteins (IAPs) erklären. So konnte gezeigt werden, daß es bei Apoptoseinduktion unter Überexpression von Par-4 zur Downregulation von XIAP, cIAP1 und Survivin kommt. Diese Downregulation bleibt auch unter Caspase-3 Inhibition, sowie von XIAP und Survivin sogar unter allgemeiner Caspaseninhibition bestehen, das heißt sie ist nicht Caspase-3-, bzw. überhaupt nicht Caspasen-vermittelt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß es bei Überexpression von Par-4 unter Apoptoseinduktion mit Doxorubicin außer zum Abfall des MMPs auch zur verstärkten Ausschüttung von Cytochrom c und des Apoptosis In-ducing Factors (AIF) ins Cytosol kommt. Cytochrom c führt im Cytosol unter Bildung des Apoptosoms zur Aktivierung von Caspase-9, einem weiteren Mechanismus, der zur verstärkten Caspasenaktivität unter Par-4 Überexpression beiträgt. Die vermehrte Ausschüttung von Cytochrom c ist bedingt durch eine Translokation von tBid an die Mito-chondrienmembran. So ergaben die Untersuchungen, daß eine Par 4 Überexpression in neoplastischen T-Lymphozyten bei Behandlung mit Doxorubicin zur stärkeren Spaltung von Bid, einem Mitglied der proapoptotischen Bcl-2 Familie, sowie zur stärkeren Translokation des Bid Spaltproduktes (tBid) an die Mitochondrienmembran führt. Mit Hilfe der Immunfluoreszens konnte dargestellt werden, daß Bid in Par-4 überexprimierenden Zellen ein verändertes Verteilungsmuster im Cytosol aufweist und auf einen apoptotischen Reiz hin, verglichen mit den Par-4-negativen Zellen, vermehrt an die Mitochondrienmembran transloziert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß Bak und Bad, zwei weitere proapoptotische Mitgliederr der Bcl-2 Familie, durch Par 4 Überexpression Caspasen unabhängig verstärkt aktiviert werden. Bak wird durch das Bid-Spaltprodukt tBid aktiviert und führt ebenfalls zu einer verstärkten Cytochrom c Freisetzung ins Cytosol, wohingegen Bad seine proapoptotische Wirkung durch Bindung an antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie entfaltet. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, daß die Par-4 Überexpression in neoplastischen Lymphozyten bei Behandlung mit Doxorubicin zu einer Downregulation von Ras, welches zu den GTPasen zählt, führt. Diese Downregulation ist Caspasen-, jedoch nicht Caspase-3-abhängig. Hierbei besteht kein Zusammenhang zwischen der Expression von Ras und dem Tumorsupressorgen P53. Das heißt Par-4 entfaltet seine proapoptotische Wirkung über einen P53-unabhängigen Weg. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, daß Par 4 Überexpression in neoplastischen Lymphozyten zu einer verstärkten Sensibilität des Fas-Rezeptors führt, das heißt, es konnte bewiesen werden, daß der pro-apoptotische Effekt von Par 4 sowohl durch Chemotherapeutika, als auch über direkte Rezeptorstimulation ausgelöst werden kann. Insgesamt legt diese Arbeit die wesentlichen molekularen Mechanismen der pro-apoptotischen Wirkung von Par-4 in neoplastischen Lymphozyten dar.
• The prostate-apoptosis-response-gene (Par-4) sentisizes neoplastic lymphatic cells, whose malignancy is characterized by inhibition of programmed cell death, to apoptotic stimuli. Previous studies demostrated, that upon chemotherapeutic treatment Par-4 overexpression promotes apoptosis by decreasing the level of Bcl-2, enhancing activation of caspase-3, disrupting the mitochondrial membrane potential, as well as promoting PARP-cleaving activity. This study reveals further molecular mechanisms which increase the sensitivity to apoptotic stimuli by expression of Par-4. It could be shown that upon treatment with doxorubicin overexpression of Par-4 not only enhances the activity of caspase-3, but also of caspase-8 and -9. Upon inhibition of caspase-3 overex-pression of Par-4 enables the cells to alternatively activate caspase-6, -7, -8 and -9. The altered caspase-activity can be explained by the down-regulation of members of the inhibitors of apoptosis proteins (IAPs). It could be demonstrated, that overexpression of Par-4 leads to a down-regulation of the protein expression of XIAP, cIAP1 and survivin, which persists also upon inhibition of caspase-3. The down-regulation of XIAP and survivin persists also upon inhibition of general caspase activation, this provides evidence for caspase independency. Moreover it could be demonstrated, that upon incubation with doxorubicin Par-4 not only enhances disruption of the mitochondrial membrane potential, but also enhances release of cytochrome c and the apoptosis inducing factor (AIF) into the cytosol. Cytochrome c associates to the apoptosome to activate caspase-9, another mechanism leading to an enhanced caspase activation. The observed increased efflux of cytochrome c is related to the increased translocation of tBid to the mitochondrial membrane. Thus it could be demonstrated that upon treatment with doxorubicin Par-4 overexpression in neoplastic T-lymphocytes enhances truncation of Bid and translocation of truncated Bid (tBid) to the mitochondrial membrane. Using im-munofluoreszense it could be shown that Par-4 overexpression alone is able to alter the pattern of distribution of Bid in the cytosol and that chemotherapeutical treatment of Par-4-positive cells leads to an increased colocalisation of Bid and the mitochondria. Further more overexpression of Par-4 enforces activation of Bak and Bad, two pro-apoptotic members of the Bcl-2-family, an activation independent on caspase activition. Bak is activated by truncated Bid (tBid) and leads to a stronger efflux of cytochrome c from the mitochondria. The pro-apoptotic effect of Bad develops by binding to anti-apoptotic members of the Bcl-2 family. In addition it could be shown that in neoplastic lymphocytes upon treatment with doxorubicin Par-4 overexpression down-regulates Ras, one of the GTPases. This down-regulation is caspase, but not caspase-3 dependent. The expression of Ras is thereby not connected to the expression of the tumor-suppressor-gene P53. This result indicates, that the pro-apoptotic effect of Par-4 is P53 independent. Moreover it could be demonstrated, that Par-4 overexpression in neoplatic lymphocytes sentisizes to stimulation of the Fas-receptor. This provides evidence that Par-4 shows its pro-apoptotic effect not only upon treatment with chemotherapeutics but also upon direct receptor stimulation. In summary these investigations reveal essential molecular mechanisms of the pro-apoptotic function of Par-4 in neoplastic lymphocytes.