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Sergio Richter

• In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue virus-freie Transfektionsmethode für den vaskulären Gentransfer an einem ex vivo Modell an Koronararterien etabliert werden. Es wird gezeigt, daß durch ultraschall-induzierte Destruktion von Microbubble-Vektoren (UIMD) ein lokaler Transfer von Plasmid-DNA in die Gefäßwand mit hoher Effizienz und Sicherheit erzielt werden kann. Die Praktikabilität dieser Methode wird durch einen erfolgreichen eNOS-Gentransfer in die Gefäßwand unter Beweis gestellt. Dabei führen schon niedrige Plasmid-DNA-Konzentrationen zur Expression eines funktionell aktiven, rekombinanten eNOSmt-Proteins mit basal erhöhter NO-Produktion. Dies läßt sich bei der endothelialen Funktionstestung durch eine signifikante und nachweislich NO-vermittelte Reduktion der durch Prostaglandin F2α -induzierten Vasokonstriktion nachweisen. Zunächst konnte in dieser Arbeit erfolgreich gezeigt werden, daß es möglich ist, durch Zusatz von Plasmid-DNA bei der elektromechanischen Sonifikation von Humanalbumin Microbubble-Vektoren herzustellen, in deren Albuminschale die Plasmid-DNA inkorporiert ist. In einem nächsten Schritt konnte gezeigt werden, daß an dem in dieser Arbeit entwickelten ex vivo-Perfusions-Modell an Koronararterien durch ultraschallinduzierte Destruktion intravasal verabreichter Microbubble-Vektoren vor allem die Endothelzellschicht effizient mit Reporterplasmiden (LacZ) transfiziert werden kann. Dabei wurde zunächst ein Standardverfahren etabliert, bei dem die Koronararterien mit Microbubble-Vektoren bei einer Geschwindigkeit von 2 ml/min perfundiert und in einem definierten Ultraschallsektor für 5s im harmonic imaging-Modus gescannt wurden. Die Transfektionseffizienz korreliert dabei positiv mit der Konzentration an Microbubble-Vektoren im Perfusat. Experimente zum Einfluß der Perfusion auf die UIMD-Transfektion zeigten, daß die Perfusion mit 2ml/min verglichen mit statischen Versuchsbedingungen einen positiven Einfluß auf die Transfektionseffizienz nimmt. Eine Steigerung der Flußrate um den Faktor 5 geht jedoch mit einer signifikanten Abnahme der Expression rekombinanter ß-Galaktosidase mit verminderter Enzymaktivität in der Gefäßwand einher. Unter gleichen experimentellen Bedingungen konnte durch längere Ultraschallexpositionszeiten die Transgenexpression wiederum gesteigert werden. Ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Arbeit war es nachzuweisen, daß die UIMD-Transfektionsmethode an Leitarterien wie den Koronargefäßen ein sicheres Verfahren zum endothelialen Gentransfer darstellt und keine morphologischen oder funktionellen Endothelschäden hervorruft. Dies konnte histologisch und durch endothel-abhängige Funktionsmessungen an Gefäßringen von transfizierten Koronargefäßen erfolgreich gezeigt werden. Zudem ergaben Messungen der LDH-Enzymaktivität bei transfizierten Gefäßen kein Hinweis auf einen zytotoxischen Effekt der UIMD-Transfektionsmethode. In einem letzten Schritt konnte gezeigt werden, daß sich die UIMD-Transfektionsmethode exzellent für einen vaskulären eNOS-Gentransfer eignet. Erfolgreiche Transfektion gesunder Koronararterien mit dem phosphomimetischen eNOS-Konstrukt geht mit einem verminderten Gefäßtonus einher und führt zu einer etwa 60%igen NO-vermittelten Reduktion der durch Prostaglandingabe provozierten Gefäßkontraktion. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die ultraschall-unterstützte Transfektion mit Plasmid-DNA-beladenen Microbubbles ein sehr effizientes und nichttoxisches Verfahren zum non-viralen Gentransfer in die Gefäßwand von größeren Leitarterien darstellt. Die Herausforderung an die Zukunft wird sein, an verschiedenen in vivo Modellen die Praktikabilität dieser Methode sicherzustellen und zu zeigen, daß die hohe Transfektionseffizienz und Sicherheit auch in vivo gewährleistet ist. Dann könnten durch intravasale Injektion über katheter-basierte Verfahren oder sogar durch intravenöse Gabe gezielt vaskularisierte Organbereiche nicht-/ minimalinvasiv therapeutisch angegangen werden. So wäre nicht nur eine gentherapeutische Anwendung der UIMD-Methode bei kardiovaskulären Erkrankungen denkbar, sondern auch in der Onkologie als optionale Therapiemöglichkeit bei malignem Tumorleiden. Zum Beispiel könnte durch Transfektion mit anti-Tumoroder anti-Angiogenese- Genen lokal das Tumorwachstum gehemmt werden.
• Background: Progress in cardiovascular gene therapy has been hampered by concerns regarding the safety and practicality of viral vectors and the inefficiency of current nonviral transfection. This approach had the purpose to determine whether ultrasound-targeted destruction of plasmid DNA-loaded albumin microbubbles (UTMD) is an efficient and safe nonviral transfection technique for local vascular gene delivery. Methods and Results: Perfluoropropane-filled microbubbles were produced by sonication of 5% human serum albumin in the present of plasmid DNA encoding for ß-galactosidase or the phosphomimetic active endothelial nitric oxide synthase (eNOS S1177D). In this way plasmid DNA can be easily incorporated directly into the albumin microbubble shell. Application of diagnostic ultrasound (2.2MHz, 173fps, MI=1.2, USE=5s) to porcine coronary arteries perfused with plasmid DNA-loaded albumin microbubbles resulted in a marked vascular transgene expression without any functional impairment of vasoreactivity. Thus, plasmid DNA remains functional after the sonication procedure and ultrasound-targeted microbubble destruction. Detection of ß-galactosidase in LacZ-transfected arteries revealed a predominant staining of the endothelial cell layer. ß-galactosidase activity was significantly (~12-fold) enhanced in coronary arteries transfected with ultrasound-targeted destruction of LacZloaded microbubbles compared to transfection with plasmid DNA-loaded microbubbles without ultrasound or ultrasound-induced transfection with plasmid DNA alone. An increase in concentration of plasmid DNA-microbubbles correlated with an increase in UTMD-transfection efficiency, whereas an increase in flow velocity (2ml/min) enhanced transgene expression that however decreased using higher perfusion rates of 10ml/min. Western blotting revealed transgene expression of eNOS S1177D in protein extracts from UTMD-transfected coronary arteries. Vascular responsiveness was tested using prostaglandin F2α (PGF2α) and the NOS inhibitor Nω-monomethyl-L-arginine (LNMA). Compared to coronary artery segments treated with the expression plasmid alone, the PGF2α-mediated precontraction was inhibited (~60%) in segments transfected with eNOS S1177D and the contractile response to the application of LNMA was markedly enhanced. Conclusion: The UTMD-technique enhances gene expression and transfection efficiency of naked plasmid DNA without any apparent toxicity in ultrasound-targeted transfection of coronary arteries in vitro and may represent an improved avenue for therapeutic vascular gene delivery in vivo.