Open Access

Dennis Sebastian Weck

• Entzündungsprozesse sind essentiell zur Abwehr exogener und endogener Pathogene sowie bei der Geweberegeneration. Ihre Dysregulation ist an unzähligen Krankheitsprozessen beteiligt. Die Auslösung einer Entzündung ist besonders gut untersucht bei Toll-like Rezeptoren, die Strukturen von Mikroorganismen erkennen können und durch Signalkaskaden beispielsweise ΝF-κB aktivieren. LncRNAs regulieren die Genexpression und wurden dabei bereits im Rahmen von Entwicklung, Proliferation, Karzinogenese und Entzündung nachgewiesen. ASC sind für die regenerative Medizin aufgrund ihrer einfachen Gewinnung und ihrer Differenzierbarkeit höchst interessant. Zudem haben sie einen Einfluss auf inflammatorische Prozesse. Daher könnte es relevant sein, welche Rolle lncRNAs während Entzündungsprozessen bei ASC spielen. Daraus könnten sich auch potentielle Ansätze für Diagnostik und Therapie entwickeln. Es wurde ein Entzündungsmodell mit ASC etabliert, welche mit Bakterientoxinen stimuliert wurden. Das Modell wurde mit einem im nephrologischen Labor etablierten Modell mit renalen Epithelzellen hinsichtlich der Entzündungsantwort verglichen. Diese Entzündungsantwort wurde anhand der Zytokinproduktion auf mRNA- und Proteinebene quantifiziert. Anschließend erfolgte eine RNA-Sequenzierung und Vergleich der RNA bei stimulierten und nicht-stimulierten ASC. Die detektierten veränderten lncRNAs wurden mittels qPCR validiert. Zuletzt wurde durch knockdown einer ausgewählten lncRNA versucht, Einfluss auf die Entzündungsprozesse zu nehmen. Die vorgelegte Arbeit zeigt deutlich, dass ASC eine stärkere Entzündungsantwort als renale Epithelzellen zeigen. Als Mittelweg aus maximaler Entzündungsantwort und realistischen Stimulationsbedingungen wurde eine Stimulation mit 10 ng/ml LPS für 4 h gewählt. Nach der RNA-Sequenzierung zeigte die funktionelle Analyse der veränderten codierenden RNA Hinweise auf Entzündungsprozesse, Zellmigration, Chemotaxis, Differenzierung, Proliferation sowie Alkoholismus, Atherosklerose, Diabetes mellitus und Insulinresistenz. Diese Ergebnisse lassen sich mit dem aktuellen Stand der Forschung in Einklang bringen und legen die Bedeutung von Entzündung und ASC in diesen Bereichen dar. Bei den lncRNAs ergab die Sequenzierung insgesamt 48 expressionsveränderte Transkripte, H19 konnte hierbei erfolgreich validiert werden. Diese lncRNA war im Rahmen der LPS-induzierten Entzündung expressionsvermindert. Aufgrund donorspezifischer Einflussfaktoren auf die Genexpression bei ASC wie Körpergewicht und Morbidität sowie allgemeiner interindividueller Schwankung der Expression von lncRNA sind aber weitere Untersuchungen zur Detektion relevanter lncRNAs erforderlich. Die Transfektionsversuche zeigten Hinweise darauf, dass der H19-knockdown möglicherweise die LPS-vermittelte Entzündungsantwort bei ASC verstärkt. Zusammenfassend wurde ein Modell zur Untersuchung von lncRNA bei LPS-induzierter Inflammation in ASC etabliert sowie im Rahmen dessen H19 als relevante lncRNA detektiert, die den Ausgangspunkt für weitere Forschung darstellt.
• Inflammation is essential for the defense against exogenous and endogenous pathogens and tissue regeneration. Dysregulation of inflammation is part of numerous diseases. The initiation of inflammation was heavily researched on toll like receptors, which sense parts of microorganisms and activate ΝF-κB through their signaling pathways. LncRNAs regulate gene expression and have been observed in the context of development, proliferation, carcinogenesis and inflammation. ASC are of interest for regenerative medicine, as they are easy to harvest, able to differentiate into multiple cell types and relevant for inflammation. Therefore the role of lncRNAs in inflammation of ASC is interesting, as they may offer potential for diagnostic and therapeutic applications. An inflammation model with ASC has been established, in which the cells were stimulated with bacterial toxins. This model was compared with an already in the nephrological laboratory established cell model with renal epithelial cells regarding the inflammatory response. The latter was quantified via cytokine production on mRNA- and protein-level. The RNA of stimulated and unstimulated ASC was compared via RNA-sequencing. The detected differentially expressed lncRNA was validated via qPCR. A knockdown of a selected lncRNA was performed via transfection with siRNA to influence inflammation. This work presented here demonstrated that ASC show a stronger inflammatory response than ciPTC. As a good balance between maximum inflammatory response and realistic stimulation conditions, a stimulation with 10 ng/ml LPS for 4 hours was chosen for further experiments. The functional analysis of the differentially expressed coding RNA detected by RNA-sequencing showed relevance of the LPS-mediated signaling in ASC for inflammation, cell migration, chemotaxis, differentiation, proliferation, alcoholism, atherosclerosis, diabetes and insulin resistance. To all these processes and diseases a link to LPS-mediated in flammation has been described. A total of 48 non-coding transcripts were differentially expressed as detected by RNA-sequencing. H19, which was shown to be downregulated via RNA-sequencing, was successfully validated by qPCR. Because of donor specific factors on gene expression like body weight and morbidity as well as a generally interindividually fluctuation of expression of lncRNA more research is necessary to discover further relevant lncRNA. The transfection hinted that knockdown of H19 may fortify the LPS-mediated inflammatory response of ASC. In summary, a model for LPS-mediated inflammation of ASC for research on lncRNA was established and in this context H19 was detected as relevantlncRNA, which serves as the basis for further research.