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Susanne Würsching

• Die HIV-Infizierung von Zellkulturen in vitro ist essentiell für das Verstehen der Kinetik der Virusreplikation, für die Aufdeckung von Resistenzentwicklungen gegenüber antiretroviraler Medikamente und für die Entwicklung neuer antiretroviraler Therapiestrategien. Voraussetzung hierfür ist ein geeignetes Monitoring der HIV-Infektion von in vitro infizierten Zellen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Monitoring der HIV-Replikation von in vitro infizierten Zellen mittels der Real-Time TaqMan™ PCR. Die Ergebnisse der Real-Time TaqMan™ PCR wurden mit denen eines p24 ELISAs verglichen. Der p24 ELISA diente als etablierte Standardmethode zum Monitoring einer in vitro HIV-Infektion. HUT 78-Zellen wurden in vitro mit vier unterschiedlichen HIV-1 IIIb Infektionsdosen (MOI 0,05; MOI 0,01; MOI 0,002; MOI 0,0005) infiziert. Mittels der Real-Time TaqMan™ PCR wurde die HIV-1 gag cDNA quantifiziert. Mittels ELISA erfolgte die Quantifizierung des HIV-p24. Zusätzlich dazu wurde die Anzahl an proviralen HIV-1 Transkripten in den Zellkulturen mittels der TaqMan™ PCR quantifiziert. Die Quantifizierung der HIV-1 gag cDNA und des p24 ergaben nahezu identische Kurvenverläufe der Infektionskinetiken. Beide Nachweismethoden zeigten vergleichbare Daten bezüglich des exponentiellen Ansteigens und der sich daran anschließenden Plateauphase der HIV-Replikation. Die Sensitivität beider Nachweismethoden war ebenfalls vergleichbar. Ein großer Unterschied lag in den Messbereichen beider Methoden. Bei der Real-Time TaqMan™ PCR konnte eine Linearität über 7 log-Stufen demonstriert werden. Dies hatte den Vorteil, dass die Zellkulturproben vor der Quantifizierung der HIV-1 gag cDNA nicht verdünnt werden mussten. Im Gegensatz dazu war der Messbereich des HIV-p24 ELISAs sehr eng und erforderte in den meisten Fällen eine Verdünnung der Messproben. Bezüglich des Arbeitsaufwandes und der aufkommenden Kosten ergaben sich für die Quantifizierung der HIV-1 gag cDNA mittels der Real-Time TaqMan ™ und für die Quantifizierung des p24 mittels ELISA nahezu identische Werte. Der Verlauf der Werte an proviralen HIV-1 Transkripten ähnelt dem der HIV-1 gag cDNA Kinetik. Mittels der Quantifizierung der proviralen HIV-1 Kopien kann jedoch keine Aussage über die HIV-Replikation getroffen werden. Abschließend ist zu sagen, dass die Real-Time TaqMan™ PCR eine zuverlässige und sensitive Methode ist, eine HIV-1 Replikation von in vitro infizierten Zellen zu quantifizieren und den Replikationsverlauf zu beschreiben. Die Real-Time TaqMan™ PCR stellt eine alternative Methode zum HIV-p24 ELISA dar, um eine in vitro HIV-Replikation zu dokumentieren.
• To describe the kinetics of viral replication, to understand the loss of activity of anti-HIV drugs and to develop new antiretroviral strategies against HIV in vitro HIV-infection is very important. A reliable method to monitor in vitro HIVreplication is required. In this study we monitored viral replication of in vitro HIV-1 infected cells by realtime TaqMan™ PCR. The results of real-time TaqMan™ PCR were compared with results of p24 ELISA. p24 ELISA was used as standard method to monitor HIV-1 replication in cell culture. HUT 78 T-lymphoblastoid cells were infected with four different doses of HIV-1 IIIb concentrations (MOI 0,05; MOI 0,01; MOI 0,002; MOI 0,0005). The course of HIV-1 replication was monitored by determination of p24 concentrations and by quantitation of HIV-1 gag cDNA. The quantitation of HIV p24 resultet from p24 ELISA. HIV-1 gag cDNA was quantitated by real-time TaqMan™ PCR. Additionally, the number of HIV-1 proviral copies was assessed by TaqMan™ PCR. As well the quantification of p24 as the quantification of HIV-1 gag cDNA revealed comparable kinetics of infection. Both methods provided similar data on the exponential increase and on plateauing of HIV-1 replication. Furthermore, the sensitivity of both methods was equal. The measuring range of both methods was great different. A 7 log linearity of TaqMan™ HIV-1 gag PCR was demonstrated without dilution of the specimen, in contrast to p24 ELISA. Because of ist narrow range of detectable p24 concentrations, sample dilution was necessary. The kinetics of proviral copy number following in vitro inoculation of cells with HIV-1 was similar to the kinetics of HIV-1 cDNA copy numbers, although determination of the number of proviral copies by TaqMan™ PCR does not measure HIV-1 replication. In conclusion, real-time TaqMan™ PCR was demonstrated as a reliable and sensitive tool to quantify and monitor HIV-1 replication in cell culture. Real-time TaqMan™ PCR is an alternative method to monitor HIV-1 replication in vitro.