Open Access

Elisabeth Dernbach

• Die Endothelzellmigration ist ein wesentlicher Prozess für die Angiogenese, Neovaskularisierung und Reendothelialisierung. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Effekt von Schubspannung auf die Endothelzellmigration, die Beteiligung der Integrine und der Integrin-abhängigen Signaltransduktionswege mittels "scratched wound assay" untersucht. Die Schubspannungs-induzierte Endothelzellmigration war signifikant durch Integrin-blockierende RGD-Peptide oder neutralisierende Antikörper gegen die Integrin-Untereinheiten α5β1 reduziert, wohingegen Antikörper gegen αvβ3 oder α2β1 keinen Effekt hatten. Die Integrin-Expression von α5 und β1 war besonders in der migrierenden Zellfront der Wunde erhöht. Passend zu der wichtigen Rolle der Integrine in der Schubspannungs-induzierten Endothelzellmigration hemmte eine Blockade des Integrin-assoziierten Adapterproteins Shc durch eine dominant negative Mutante die Schubspannungs-induzierte Zellmigration. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die pharmakologische Hemmung der MAP Kinase ERK1/2 oder der PI3K die Schubspannungs-induzierte Endothelzellmigration verhinderte. Im Gegensatz dazu hatte die Hemmung der NO-Synthase keinen Effekt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die VEGF-vermittelte Endothelzellmigration untersucht. Im Gegensatz zu den Befunden, dass laminare Schubspannung NO-unabhängig die Endothelzellmigration stimuliert, konnte die VEGF-vermittelte Endothelzellmigration durch NOS-Inhibitoren blockiert werden. Des weiteren wurde die Beteiligung der Akt-mediierten eNOS Phosphorylierung in der VEGF- induzierten Endothelzellmigration ebenfalls mittels "scratched wound assay" untersucht, da bekannt ist, dass Akt die eNOS über eine Phosphorylierung an Serin 1177 aktivieren kann. Die Überexpression einer dominant-negativen Akt-Mutante verhindert die VEGF-induzierte Zellmigration. Im Gegensatz dazu stimulierte die Überexpression einer konstitutiv-aktiven Akt-Mutante die Endothelzellmigration, auch in Abwesenheit von VEGF. Die Überexpression eines phosphomimetischen eNOS-Konstruktes (S1177D) führte ebenfalls zu einer verstärkten Zellmigration, wohingegen die nicht mehr phosphorylierbare und somit nicht mehr aktivierbare eNOS-Mutante (S1177A) die VEGF-induzierte Endothelzellmigration komplett hemmte. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die VEGF- und Schubspannungsinduzierte Endothelzellmigration wesentlich zu der beschleunigten Reendothelialisierung von verletztem Endothel beiträgt, wie es beispielsweise nach einer Ballondilatation der Fall ist. Es konnte gezeigt werden, dass laminarer Blutfluss über die Integrine α5β1 NO-unabhängig die Migration mediiert und dass der Wachstumsfaktor VEGF über die Protein Kinase Akt NO-abhängig die Endothelzellmigration stimuliert.
• Endothelial cell (EC) migration is required for angiogenesis, neovascularisation and reendothelialisation. In the first part of this thesis, the effect of shear stress on EC migration and the contribution of the integrins and integrin-dependent signaling pathways in a scratched-wound assay was investigated. Laminar shear stressinduced EC migration was significantly reduced by integrin-receptor blocking with RGD peptides or with neutralizing antibodies against the integrin subunits α5 and β1, whereas antibodies against αvβ3 or α2β1 had no effect. Cell-surface levels of integrin α5 and β1 were specifically upregulated in migrating ECs at the wound edges. Consistent with the important role of integrins for shear stress-induced cell migration, blockade of the integrin-associated adaptor protein Shc by overexpression of a dominant negative construct inhibited shear stress-stimulated EC migration. Moreover, pharmacological inhibition of MAP Kinase ERK1/2 or phosphatidyl-inositol3-kinase prevented shear stress-induced cell migration. In contrast, inhibition of the nitric oxide (NO)-synthase had no effect. In the second part of this thesis, the signaltransduction of vascular endothelial growth factor (VEGF)-induced EC migration was investigated. In contrast that shear stressstimulated EC migration was independent of NO, VEGF-induced EC migration was blocked by NO-synthase inhibitors. Because it is well known that Akt activates endothelial NO synthase (eNOS) by phosphorylation of Ser 1177, the contribution of the Akt-mediated eNOS-phosphorylation in VEGF-induced cell migration was analyzed. Overexpression of a dominant negative Akt abrogated VEGF-induced cell migration, whereas overexpression of constitutively active Akt was sufficient to induce cell migration even in absence of VEGF. Moreover, transfection of an Akt site phospho-mimetic eNOS (S1177D) potently stimulated EC migration, whereas a nonphosphorylatable mutant (S1177A) inhibited VEGF-induced EC migration. Taken together, these results indicate, that VEGF and shear stress-induced migration of endothelial cells is regulated by different signaling pathways. Laminar blood flow enhances EC migration via the integrins α5 and β1 in a NO-independent manner, VEGF stimulates EC migration by activation of the protein kinase Akt in a NOdependent manner