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Marion Yvonne Lorenz

• Dem Nahrungsmittelallergiker bietet sich zum jetzigen Zeitpunkt lediglich eine Möglichkeit für ein symptomfreies Leben, er muss die allergieauslösenden Nahrungsmittel aus seinem Speiseplan eliminieren. Neben der Entwicklung von immuntherapeutischen Maßnahmen wird unabhängig davon auf pflanzentechnologischer Seite die Reduktion der allergenen Potenz pflanzlicher Lebensmittel diskutiert, um die Lebensqualität von Nahrungsmittelallergikern zu verbessern. Die Kooperation zwischen dem Institut für Biochemie der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg und dem Paul-Ehrlich-Institut leistet einen Beitrag zu dieser Diskussion. Mit der Tomate als Modellpflanze wurde die allergene Potenz pflanzlicher Nahrungsmittel mit Hilfe der RNAi-Technologie reduziert. Diese Dissertation befasst sich mit der Identifikation und Charakterisierung der Zielproteine für das RNAi vermittelte „gene silencing“. Im Fokus der Untersuchungen steht das Lipid Transfer Protein der Tomate. Bei der Charakterisierung des Tomaten LTP wurden die IgE-bindenden Epitope sowie die Stabilität bei Pepsinverdau und bei der Verarbeitung zu tomatenhaltigen Produkten untersucht. Das Tomaten LTP besteht aus einer Multigenfamilie. Durch seine zweidimensionale Auftrennung konnten Informationen über das Vorkommen und Expressionsniveau möglicher Isoformen gewonnen werden. Die rekombinante Herstellung von zwei ausgewählten Isoformen ermöglichte einen Vergleich der IgE-Bindungskapazität und der biologischen Potenz. Die in Erlangen erzeugten gentechnisch veränderten Pflanzen wurden dem Paul-Ehrlich-Institut für eine Allergenitätsbewertung zur Verfügung gestellt. Die Gewinnung von Erkenntnissen über die Effizienz der Methode und die Stabilität des „gene silencing“ über mehrere Generationen hinweg standen hier im Mittelpunkt. Die Untersuchungen zur Prävalenz der IgE-Bindung an die drei bekannten Tomatenallergene Profilin (Lyc e 1), Invertase (Lyc e 2) und das LTP der Tomate, erfolgten bei einer Patientengruppe bestehend aus 70 Seren von Tomatenallergikern aus Deutschland (n=36) und Spanien (n=34). Als häufigstes Symptom nach dem Verzehr von Tomate wurde das OAS angegeben. Die Häufigkeit der IgE-Bindung an Lyc e 1 lag bei ca. 36%, für Lyc e 2 bei ca. 56% und für das LTP der Tomate bei ca. 24%. Bei der Unterscheidung der deutschen und spanischen Patientengruppe ergaben sich höhere Prävalenzen der IgE-Bindung an alle drei Allergene bei der spanischen Patientengruppe. Das Tomaten LTP wurde als Minorallergen Lyc e 3 in die IUIS Allergendatenbank aufgenommen. Die Aufreinigung von nLyc e 3 erfolgte durch eine zweistufige Chromatographie aus Tomatenschalenextrakt, die Identifizierung als LTP mittels N-terminaler Sequenzierung sowie die Verifikation der Sekundärstruktur mittels CD-Spektroskopie. Biochemische Untersuchungen zeigten eine hohe Stabilität von Lyc e 3 in Tomatenschalenextrakt nach Pepsinverdau. Auch im Schalenextrakt von gekochten und in getrockneten Tomaten wurde immunreaktives Lyc e 3 identifiziert. Die Konformation des Lyc e 3 ist an der IgE- und IgG-Bindung maßgeblich beteiligt. Natürliche Lyc e 3 Isoformen konnten nicht über die zweidimensionale Gelelektrophorese identifiziert werden. Eine Sequenzierung des Proteins mittels nano-HPLC-nano ESI-MS/MS bestätigte die Präsenz ausschließlich einer dominanten Isoform im Tomatenschalenextrakt. Bei der Klonierung und Expression zweier ausgewählter Lyc e 3 Isoformen (Lyc e 3.1 und Lyc e 3.2) wurden unterschiedliche Strategien verfolgt. Durch Überexpression eines Thioredoxinfusionsproteins im Vektor pET-32a in E.coli Origami und die Abspaltung des Thioredoxinanhangs durch Thrombin konnte ausreichend Protein für die nachfolgenden Untersuchungen produziert werden. Jedoch zeigten die rekombinanten Proteine, vermutlich durch eine an dem Zielprotein verbleibende Anhangssequenz, bei der Messung der CD-Spektren einen Unterschied zu der natürlichen Präparation. Die Herstellung von rekombinanten Isoformen ohne Anhangssequenz mit einer Sekundärstruktur analog der natürlichen Präparation blieb erfolglos. Ein Vergleich der IgE-Bindungskapazität der rekombinanten Proteine, gemessen in der dosisabhängigen ELISA-Inhibition, konnte auf Grund ihrer identischen Sekundärstruktur durchgeführt werden. Da rLyc e 3.2 eine höhere IgE-Bindungskapazität zu besitzen scheint, wurde mit dieser Isoform eine dosisabhängige ELISA-Inhibition mit nLyc e 3 trotz unterschiedlicher Sekundärstruktur durchgeführt. Die IgE-Bindungskapazitäten sind für die herangezogenen Seren sehr individuell. Zur Bestimmung der allergenen Potenz der rekombinanten und natürlichen Präparationen diente der basophile Histamin Freisetzungstest. Die natürliche Präparation besitzt tendenziell die stärkste allergene Potenz. Die allergene Potenz der rekombinanten Isoformen ist jedoch wie die IgE-Bindungskapazität für jeden Patienten sehr spezifisch. Im Rahmen der Analyse der gentechnisch veränderten Pflanzen wurden WT und RNAi-Pflanzen mittels Immunoblot, dosisabhängiger ELISA-Inhibition und im basophilen Histamin Freisetzungstest untersucht. Im Immunoblot konnte keine Bindung von allergenspezifischen Antikörpern bei den RNAi-Pflanzen im Vergleich zum WT festgestellt werden. Bei der dosisabhängigen ELISA-Inhibition mit Lyc e 1 oder Lyc e 3 auf der Festphase war die IgE-Bindungskapaziät der RNAi Pflanzen um ein zehnfaches (Lyc e 1-RNAi) bzw. ein zehn- bis hundertfaches (Lyc e 3-RNAi) reduziert. Eine Bestätigung der Ergebnisse mit den Lyc e 3-RNAi Pflanzen lieferten ein basophiler Histamin Freisetzungstest und ein in vivo Hauttest. Durch die zusätzliche Analyse von Tochtergenerationen wurde deutlich, dass die Reduktion der Allergenexpression stabil war. Im Rahmen dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die RNAi-Technologie eine geeignete Methode ist, um die Expression von Allergenen gezielt und stabil zu unterdrücken. Sie könnte eine Möglichkeit darstellen, die allergene Potenz von Nahrungsmitteln zu verringern und die Lebensqualität von Nahrungsmittelallergikern zu verbessern.