Open Access

Christian Mäurer

• Das “Protein Associated with Myc” spielt in den verschiedenen physiologischen Vorgängen eine Rolle. Dazu zählen Prozesse der Synaptogenese und Schmerzverarbeitung ebenso wie eine Regulation des Pteridin- und cAMP-Stoffwechsels. Auf welche Weise PAM die unterschiedlichen Effekte vermittelt, ist bislang nur in Ansätzen verstanden. Um die Wirkmechanismen von PAM aufzuklären, wurden in dieser Arbeit seine biochemischen Funktionen untersucht. Die These, dass PAM als E3 Ubiquitinligase aktiv ist, konnte in vitro mittels biochemischer Versuche zweifelsfrei bestätigt werden. Sowohl das nativ aufgereinigte, humane PAM, als auch der heterolog expremierte C-Terminale Bereich (C-PAM), der die katalytisch aktive RING Finger Domäne enthält, wiesen die Fähigkeit zur Ubiquitinkettenbildung und Autoubiquitinierung auf. Bei der Identifikation eines möglichen Zielproteins rückte das Protein TSC2 und der damit verbundene TSC2 / mTOR Signalweg in den Fokus. Für das gewählte Modell-System HeLa Zellen ließ sich eine Interaktion von PAM und TSC2 durch Ko-Immunopräzipitationen und Immunzytochemie nachweisen. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass das vollständige, native PAM, nicht aber die isolierte RING Finger Domäne, TSC2 polyubiquitinieren und zum proteasomalen Abbau markieren kann. TSC2 ist ein negativer Regulator der mTOR Kinaseaktivität, in dem es den stimulatorischen Einfluss von Rheb auf mTOR inhibiert. PAM wird in HeLa Zellen durch das Phospholipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aktiviert. Nach S1P Behandlung der Zellen war eine Phosphorylierung der Proteinkinase mTOR nachweisbar. Diese ging mit einer Aktivierung der Kinaseaktivität einher, wie die rapamycinsensitive Phosphorylierung der mTOR Zielproteine p70S6K und 4E-BP1 zeigte. Durch Gabe von Rezeptor-Agonisten/-Antagonisten konnte eine Beteiligung des S1P1 und S1P2 Rezeptors ausgeschlossen werden. Der zunächst vermutete Mechanismus eines S1P induzierten, PAM-abhängigen Abbaus von TSC2 konnte trotz vielfältiger Herangehensweisen nicht nachgewiesen werden. Eine Phosphorylierung als Indikation einer Inaktivierung war ebenfalls nicht detektierbar. Auch die GAP Aktivität von TSC2 auf Rheb, wird in in vitro Versuchen durch die Interaktion mit PAM nicht vermindert. Durch eine Verminderung der TSC2 Expression mittels spezifischer siRNA zeigte sich, dass TSC2 nicht in die S1P-abhängige mTOR Aktivierung involviert ist. Auch regulatorische Proteinkinasen wie AKT, ERK oder PI3K, die durch S1P aktiviert werden können, sind an dem Signalweg nicht beteiligt, wie die Hemmung dieser Enzyme mit spezifischen Inhibitoren zeigte. Dagegen konnte eine Beteiligung von PAM und Rheb zum einen mittels Proteintransfektion bestätigt werden, zum anderen ließen sich die S1P Effekte durch Hemmstoffe verhindern, die für eine Aktivierung von PAM, respektive Rheb, nötig sind. Durch Nukleotidbindungsstudien war ein Einfluss von PAM auf den GTP-Beladungszustand von Rheb nachweisbar. Sowohl in einem GTPS Bindungsversuch als auch in einem GDP Dissoziationsexperiment erhöhte PAM konzentrationsabhängig die GTP Bindung bzw. den GDP/GTP Austausch an Rheb. In dieser Arbeit wird damit erstmalig eine duale Funktion eines Proteins als Ubiquitinligase und GEF beschrieben. So konnte die postulierte Aktivität von PAM als Ubiquitinligase bestätigt und TSC2 als Zielprotein identifiziert werden. Gleichzeitig wurde ein TSC2 unabhängiger Weg der mTOR Aktivierung aufgeklärt, an dem PAM und Rheb beteiligt sind. Als möglicher Mechanismus kommt eine Aktivität von PAM als Guanin-Nukleotid Austausch Faktor (GEF) auf Rheb in Frage. Durch Beschreibung von PAM als negativem Regulator von TSC2 und Aktivator von Rheb trägt diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zur TSC2 / mTOR Forschung bei. Umgekehrt ermöglicht sie eine neue Sichtweise auf partiell PAM-abhängige Vorgänge wie Synaptogenese und Nozizeption, indem sie TSC2 / mTOR in diese Prozesse integriert.
• Protein Associated with Myc (PAM) is involved in a variety of physiological events. These include but are not limited to synaptogenesis, nociception as well as regulation of pteridine synthesis and cAMP metabolism. Until now, only few is known about the mechanisms by which PAM mediates those different effects. To elucidate the mechanism of action of PAM, different biochemical approaches very used in this thesis. Using in vitro biochemical assays, it could b shown, that PAM is an active E3-ubiqutine ligase. Both, the natively purified human PAM as well as the heterogeneously expressed C-terminal part (C-PAM) containing the catalytic active RING finger domain, were able to catalyse ubiquitinchain formation and autoubiquitination. During the identification process of potential target proteins, the TSC2 protein together with the linked TSC2-mTOR signaling attracted notice. An interaction of PAM and TSC2 could be shown using co-immunoprecipitation and immunocytochemistry in the chosen model system HeLa cells. It was shown for the very first time, that native, fulllength PAM but not the isolated RING finger domain can lead to polyubiquitination and proteasomal degradation of TSC2. By inhibiting the stimulatory Rheb protein, TSC2 is a negative regulator of the mTOR kinase activity. PAM is activated by the phospholipid Sphingosine 1 Phosphate (S1P) in HeLa cells. After S1P treatment, a phosphorylation of mTOR was detectable. This was accompanied by an activation of mTOR as shown by the rapamycine sensitive phosphorylation of the mTOR targets p70S6K and 4E-BP1. An involvement of the S1P1 as well as of the S1P3 receptor could ruled out by using S1P receptor agonists/antagonists. The expected mechanism of an S1P induced TSC2 degradation by PAM could not be validated. In addition, a phosphorylation of TSC2 was not detectable. Also the GAP activity of TSC2 towards Rheb was not altered in in vitro assays. Using TSC2 specifc siRNA is could be shown, that TSC2 is not involved in the S1P mediated mTOR activation. Regulatory kinases that can be activated by S1P such as AKT, ERK or PI3K are not involved as shown by inhibition of these enzymes using specific inhibitors. In contrast to this, an involvement of PAM and Rheb could be validated using proteintransfection, on the other hand were S1P mediated effects sensitive to inhibitors known to be necessary for an activation of PAM or Rheb respectively. Using nucleotide-binding and –exchange essays an impact of PAM on the GTP-level of Rheb was detectable. PAM enhanced the GDP/GTP exchange on Rheb in a GTPgS as well as in in GDP dissociation assay in a concentration dependent manner. In this thesis, a dual role of a protein as an E3-ubiquitin ligase and Guanine Nucleotide Exchange Factor (GEF) is described for the very first time. The postulated ligase activity of PAM was confirmed and TSC2 identified as a target protein. In parallel a TSC2 independent pathway leading to mTOR activation was identified. A GEF activity of PAM towards Rheb was found as a potential mechanism. By description of PAM as a negative regulator of TSC2 and an activator of Rheb, this thesis provides an important contribution to the field of TSC2-mTOR research. On the other hand new perceptions on PAM dependent events like synaptogenesis or nociception emerge by integrating TSC2-mTOR into these processes.