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Entwicklung von lentiviralen Vektoren für den Gentransfer in ruhende Zellen

  • Der lentivirale Gentransfer in humane blutbildende Stammzellen ist in Hinblick auf eine kurative Gentherapie von angeborenen und erworbenen Erkrankungen des hämatopoetischen Systems und er Krebstherapie von Bedeutung. Die Fähigkeit, sowohl zu proliferieren als auch in alle hämatopoetische Linien zu differenzieren, macht die pluripotenten CD34 - Stammzellen zu einem idealen Ziel für die dauerhafte Präsenz von Transgenen. Der Erfolg einer Gentherapie ist nicht nur abhängig von der Effizienz des Transfers des therapeutischen Gens in hämatopoetischen Stammzellen, sondern auch von der dauerhafte Expression des Transgens. Ein Modell zur Entwicklung einer somatischen ex vivo Gentherapie in hämatopoetischen Stammzellen ist die chronische Granulomatose (CGD). Die Krankheit beruht auf der genetisch bedingten Fehlfunktion der NADPH-Oxidase und ist mit wiederkehrenden, schweren und lebenslang auftretenden Infektionen verbunden. Eindringende Mikroorganismen wie Pilze und Bakterien werden aufgenommen, können jedoch in den phagozytierenden Vakuolen nicht abgetötet werden, da keine Sauerstoffradikale, Wasserstoffperoxid oder Folgeprodukte gebildet werden. Eine somatische Gentherapie, die eine autologe Knochenmarktransplantation mit genetisch modifizierten Zellen vorsieht, könnte CGD-Patienten die Möglichkeit einer kurativen Therapie eröffnen. Als Grundlage für die Entwicklung einer lentiviralen Gentherapie wurden zunächst lentivirale Vektoren konstruiert und mit diesen die Bedingungen der transienten Transfektion im Hinblick auf einen hohen Virustiter optimiert. Diese Vektoren wurden auf Basis des humanen Immundefizienzvirus (HIV) konstruiert und waren alle aufgrund von Deletionen in 3´ LTR selbst-inaktivierend. Das bedeutet, daß nach der reversen Transkription kein viraler Promotor mehr enthalten war, und damit die Transgen-Expression über einen internen Promotor initiiert wurde. Der pSIN-GFP Vektor enthielt grünes Fluoreszenzprotein (GFP) als Markergen und einen internen Cytomegalievirus(CMV)-Promotor. Durch Austausch der Promotor- /"Enhancer"-Sequenzen in der 5´LTR entstand der pCGWS Vektor, der unabhängig vom Tat- Transaktivator war. Die Expressionsrate konnte durch Insertion des posttranskriptionell regulatorisch wirkende Element (WPRE), das hinter das Transgene kloniert wurde, erhöht werden. Der pCIGWS Vektor wurde durch Einfügen einer multiple Klonierungsstelle und eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) zwischen dem internen Promotor und dem Transgen generiert. Dieser Vektor erlaubte jedoch nicht, wie gewünscht, die gleichzeitige Detektion der Expression eines Transgens und des Markerproteins. Die im Rahmen der Optimierung der Transfektionsbedingungen wurden unterschiedliche Verhältnisse der zur Virusproduktion notwendigen drei Plasmide zueinander ausgetestet. Die beobachteten Schwankungen des Virustiters waren bei den gewählten Verhältnissen nicht signifikant. Mit der Erhöhung der DNA-Menge an Hüllprotein Plasmid konnte auch in diesem Versuch eine vermehrte Bildung von Synzytien beobachtet werden, die sich negativ auf den Titer auswirkte. Die Behandlung der Transfektionsansätze mit Natriumbutyrat (NaBut) ergab eine deutliche Steigerung des Virustiters, wobei die Steigerung nicht mit dem Titer, der ohne NaBut erreicht wurde, korrelierte. Im Experiment zur Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Kulturmedien auf den Titer, wurden für die verwendeten Medien keine großen Unterschiede festgestellt. Bei den Experimenten zur Konzentrierung von infektiösen Viruspartikeln haben sich Ultrazentrifugation, "Low Speed"-Zentrifugation und Anionenaustauschchromatographie als Methoden bewährt. Mit diesen Verfahren konnten konzentrierte Viruslösungen generiert werden, die sehr hohe Transduktionseffizienzen auf Zellinien zeigten. Mit den angereicherten Viruspartikellösungen konnten auch CD34 -Stammzellen erfolgreich transduziert werden. Im Hinblick auf Angaben aus der Literatur konnten vergleichbare Transduktionseffizienzen erzielt werden, wobei hier fast ausschließlich ultrazentrifugierter Virusüberstand verwendet wurde. Mit der Etablierung des chromatographischen Verfahrens zur Anreicherung von Viren konnte ein alternatives System aufgezeigt werden. Am Modell der X-chromosomal gebundenen chronischen Granulomatose (X-CGD) konnte durch lentiviralen Transfer eines therapeutischen Gens (gp91phox) die funktionelle Rekonstitution der NADPH-Oxidase nachgewiesen werden. Dazu wurden lentivirale Vektoren konstruiert, die gp91phox als therapeutisches Gen enthielten. In molekularbiologischen Untersuchungen konnte zum einen die Integration des Transgens und zum anderen eine hohen Expression des gp91phox-Proteins gezeigt werden. In der durchflußzytometrische Untersuchung konnte für weniger als die Hälfte Zellen einer Modellzellinie (X-CGD PLB-985-Zellen) eine Transduktion nachgewiesen werden. In den funktionellen Untersuchungen wurde eine Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität von 80% und mehr im Vergleich zu PLB-985-Wildtypzellen detektiert. Die hohe funktionelle Rekonstitution bei geringer Transduktionseffizienz war auf eine hohe Expression aufgrund von Mehrfachintegration des Transgens zurückzuführen. Die Untersuchungen mit den lentiviralen gp91phox-Vektoren haben gezeigt, daß diese gute Voraussetzungen für die Entwicklung einer somatischen Gentherapie für CGD-Patienten mitbringen. Studien mit CD34 -Zellen und Stammzellen von X-CGD Patienten sind im weiteren notwendig, um die therapeutische Relevanz zu belegen. Neben der Fortentwicklung des Vektors muß auch die Methodik zur Generierung und Anreicherung der viralen Partikel, sowie das Transduktionsprotokoll der Stammzellen weiter optimiert werden.

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Metadaten
Author:Katja Lützenkirchen
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000001048
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2003/05/19
Year of first Publication:2002
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2002/07/29
Release Date:2003/05/19
GND Keyword:Lentiviren; Vektor <Genetik>; Gentransfer; Blutstammzelle; Gentherapie
Page Number:188
HeBIS-PPN:107419548
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht