Open Access

Lisa Mareike Egerer

• Die Gentherapie bietet eine interessante alternative Behandlungsoption bei der Therapie der HIV-Infektion und könnte langfristig die Standardmedikation mit antiretroviralen Substanzen ergänzen oder ersetzen. Antivirale Genprodukte, die frühe Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen, bevor sich das Virus in das Genom der Zielzelle integriert hat, sind dabei besonders vielversprechend. Hierzu zählen insbesondere die von der C-terminalen heptad repeat Region des HIV-Hüllglykoproteins gp41 abgeleiteten C-Peptide, die hochwirksame Inhibitoren des Viruseintritts sind. Während des HIV-Eintrittsprozesses interagieren sie mit den viralen gp41 N-Helices und verhindern somit die Ausbildung des zur Fusion von viraler und zellulärer Membran erforderlichen Sechs-Helix-Bündels. Die Sekretion antiretroviraler C-Peptide durch genmodifizierte T-Lymphozyten in vivo birgt großes therapeutisches Potential: Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum können die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen vor HIV-Infektion schützen (Bystander-Effekt). Somit könnte selbst mit den heute zur Verfügung stehenden Methoden, mit denen lediglich ein Teil aller potentiellen HIV-Zielzellen modifiziert werden kann, die Virusreplikation effektiv unterdrückt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden daher C-Peptid-basierte in vivo sezernierte antivirale Eintrittsinhibitoren (iSAVE) für die HIV-Gentherapie entwickelt. Kurze Peptide, wie die antiviralen C-Peptide, werden von eukaryotischen Zellen aufgrund von Größenbeschränkungen beim Eintritt in den Sekretionsweg jedoch nur schlecht sezerniert. Um die effiziente Sekretion von iSAVE-Peptiden durch genmodifizierte humane Zellen zu erreichen, wurde das C-Peptid daher verlängert. Hierbei wurde das therapeutische Peptid einerseits um nicht antiviral aktive Gerüstelemente ergänzt. Andererseits wurden Concatemer-Konstrukte generiert, in denen zwei C-Peptide jeweils über einen flexiblen oder proteolytisch spaltbaren Linker verbunden sind. Die unterschiedlichen iSAVE-Peptid-Varianten wurden in vitro in transfizierten und transduzierten Zelllinien und in primären humanen T-Lymphozyten charakterisiert. Hierbei wurden Sekretionseffizienz und Prozessierung sowie antivirale Aktivität und Bystander-Inhibition der sezernierten Peptide untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Effizienz der C-Peptidsekretion stark mit der Peptidlänge korreliert, so dass durch Sequenzverlängerungen die Sekretion deutlich gesteigert werden konnte. Darüber hinaus waren N-Glykane für die effiziente Sekretion der C-Peptide unerlässlich. Die antiretrovirale Aktivität hingegen reduzierte sich mit zunehmender Peptidlänge dramatisch und wurde auch durch N-Glykane leicht beeinträchtigt, so dass weder die durch Gerüstelemente verlängerten C-Peptide, noch die ungespaltenen C-Peptid-Concatemere antiretrovirale Wirkung zeigten. Durch die Generierung proteolytisch spaltbarer C-Peptid-Concatemere konnten die strukturellen Erfordernisse für effiziente Sekretion mit hoher inhibitorischer Aktivität vereinbart werden. Die Prozessierung der Concatemere durch die Proprotein-Convertase Furin war allerdings nicht einfach zu erreichen. Nur das Einfügen eines flexiblen Linkers mit optimierter Furinerkennungssequenz zwischen den beiden C-Peptiden erlaubte die effiziente Spaltung in monomere Peptide mit hoher antiretroviraler Aktivität. Therapeutisch wirksame Peptidkonzentrationen dieser optimierten iSAVE-Peptide wurden sowohl von transfizierten und transduzierten Zelllinien als auch von primären humanen T-Zellen sezerniert. Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum konnten die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen in vitro vor HIV-1 Eintritt und Infektion schützen. Die generierten iSAVE-Peptide bilden damit eine hervorragende Grundlage für die weitere präklinische und klinische Entwicklung eines neuen Gentherapieansatzes zur Behandlung der HIV-Infektion.
• Gene therapy is an interesting alternative treatment option for the therapy of HIV infection and could potentially overcome the limitations of current antiretroviral drug therapy. Antiviral gene products that inhibit early steps in the viral life cycle prior to integration of the proviral DNA into the host cell genome are most promising. So-called C peptides derived from the C-terminal heptad repeat region of the viral glycoprotein gp41 are highly efficient inhibitors of virus entry. During the HIV entry process the C peptides interact with the viral gp41 N-helices, thereby preventing the six-helix bundle formation and subsequent membrane fusion. The secretion of antiviral C peptides from gene-modified T lymphocytes in vivo has great therapeutic potential, as peptides secreted into the extracellular space could protect the genetically modified cells as well as non-modified neighboring cells from HIV infection (bystander effect). Thus, virus replication could be effectively suppressed even if only a small fraction of cells is genetically modified. In the present study, C peptide-based in vivo secreted antiviral entry inhibitors (iSAVE) were developed for the gene therapy of HIV infection. However, short peptides like the antiviral C peptides are only inefficiently secreted from eukaryotic cells. In order to achieve efficient iSAVE peptide secretion the therapeutic C peptide was elongated either by scaffold elements without antiviral activity, or by the generation of peptide concatemers. The latter consist of two C peptides connected by a flexible or proteolytically cleavable linker. The different iSAVE peptide variants were characterized in vitro in transfected and transduced cell lines as well as in primary human T lymphocytes. Here, secretion efficacy and antiviral activity of the peptides were analyzed. The efficacy of peptide export correlated with peptide length, thus, elongation significantly improved secretion rates. Furthermore, N-glycans were required for efficient secretion. However, elongation and glycosylation dramatically decreased the antiviral activity and neither the the elongated peptides nor the non-cleaved concatemers inhibited virus entry. The generation of proteolytically cleavable C peptide concatemers allowed combination of the structural requirements for efficient secretion and a high antiviral activity. However, it was difficult to achieve processing of the concatemers by the proprotein convertase furin. Only after introduction of a flexible and optimized furin recognition sequence between the two C peptides efficient processing in monomers with high antiretroviral activity was observed. Therapeutic concentrations of these optimized iSAVE peptides were secreted from transfected and transduced cell lines as well as from primary human T cells. After secretion into the extracellular space the peptides exerted a clear bystander effect and protected genetically modified as well as non-modified cells from HIV infection. Therefore, the iSAVE peptides generated here provide an excellent basis for the further preclinical and clinincal development of a novel gene therapy approach for the treatment of HIV infection.