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Study of sample-preparation steps prior to MALDI-TOF analyses in proteomics : physico-chemical investigations and method improvements

  • Seit der erstmaligen Beschreibung der MALDI (Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionisation) durch Michael Karas und Franz Hillenkamp, welche die massenspektrometrische Analyse auch großer Proteine über 100 kDa erlaubt, fand diese Technik sowohl unter den Massenspektrometrie-Gruppen als auch in Biochemischen Laboratorien rasche Verbreitung. MALDI kann inzwischen auf eine breite Palette von Biomolekülen angewendet werden und stellt heute - neben Elektrospray (ESI) -eine der beiden gebräuchlichsten massenspektrometrischen Methoden überhaupt dar. In ähnlicher Weise erlangte das Gebiet der Proteomics, der "systematischen Erforschung der zahlreichen und unterschiedlichsten Eigenschaften von Proteinen in paralleller Weise mit der Zielsetzung einer detaillierten Beschreibung der Struktur, Funktion und Steuerung biologischer Systeme im gesunden und krankhaften Zustand" eine Schlüsselstellung in der Biologie und damit einen erheblichen Einfluss auf alle Gebiete der Biologie, der Pharmazie und medizinisch verwandter Bereiche. In der Tat sind Proteine an allen biologischen Aktivitäten beteiligt und weisen die vielfaltigsten Eigenschaften auf, die in ihrer Gesamtheit zu unserem Verständnis biologischer Systeme beitragen. Die systematische Untersuchung dieser Eigenschaften macht das Gebiet der Proteomics aus und beinhaltet die Erforschung der Sequenz, Menge, Modifikationen, Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, der biologischen Aktivität, sub-zellulären Verteilung und dreidimensionalen Struktur. .... Letztlich wäre es für den Analytiker wünschenswert, aiie Schritte der MS-basierten Proteomics im Detail zu verstehen und damit vollständig zu beherrschen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb die drei entscheidenden Probenvorbereitungsschritte der MALDI-MS - gestützten Pmteomics näher untersucht. Proteinverdau: Der gebräuchliche Ansatz der MS-basierten Proteomics beinhaltet im ersten Schritt den (enzymatischen) Verdau der Proteinprobe, meist mit Trypsin aufgrund seiner sauber definierten Schnittstellen auf der C-terminalen Seite der basischen Aminosäuren Arginin (R) und Lysin (K) bei pH um 8. Dazu wurden in den vergangenen Jahrzehnten etliche Protokolle entwickelt, die auf eine möglichst vollständige Proteolyse und damit hohe Ausbeute an Spaltpeptiden abzielen. Probenaufreinigung: Als Bindeglied zwischen Proteinisolierung und MS-Analyse kommt der Aufieinigung des beim Verdau anfallenden Peptidgemischs entscheidende Bedeutung zu, da die Reinheit der Proben letzten Endes ausschlaggebend für die Qualität der Spektren ist. Auch hier sind kontinuierliche Anstrengungen zur Verbesserung im Gange, wobei in den letzten Jahren insbesondere auch spezielle Aufreinigungsmethoden für den Mikro-Maßstab beschrieben wurden, die den Bedürfnissen der Proteomics besonders entgegenkommen. Probenpräparation: Der letzte entscheidende Schritt vor der MALDI-Analyse besteht im ,,Spotting", dem Auftrag der zu analysierenden Probe zusammen mit der Matrix und deren Co-Kristallisation auf dem Probenteller. Hier bestimmen u.a. die Wahl der Matrix, der verwendeten Lösungsmittel sowie die Zugabe verschiedener Additive das Ergebnis. Obwohl der Einfluss der Matrix und Additiven auf den Desorptionsprozess einleuchtend und aus empirischen Erfahrungen seit langem bekannt ist, fehlt einem rationalen Vorgehen hier insofern die Grundlage, als dass leider noch immer kein Desorptions- und Ionisationsmechanismus gesichert ist. .... Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die vorliegenden Untersuchungen viele interessante Details und neue Ideen lieferten, die zur Verbesserung der MALDI-TOF-Analytik bei Proteomics beitragen können, so etwa: - die Portierung der einfachen, schnelle und preiswerten Probenaufreinigung mittels PVDF- und Nitrozellulosemembranen auf titerplattenbasierte Robotersysteme, bei denen eine automatisierte Zugabe der geeigneten Membranstücke, gefolgt von einfachen Wasch- und Extraktions-Schritten das Probenhandling wesentlich erleichtern sollten, - eine mögliche Verbesserung der Proteinidentifizierung durch Selektion eher hydrophiler Peptide durch neue Materialien wie HILIC, da die Mehrzahl der zur herangezogenen Peptide eher hydrophoben Charakter besitzt, - die weitere Verwendung und Erweiterung der im Rahmen dieser Arbeit erstellten Datenbanken zur Aufklärung der Zusammenhänge zwischen Peptidsequenz, der damit verbundenen physikochemischen Eigenschaften und Selektivitäts- / Unterdrückungseffekten bei der MALDI-MS.
  • The systematic investigation of the protein inventory, protein characteristics and interactions constitutes the field of Proteomics. Proteomics promises to become a key technology for the investigation of complex biological Systems and already has a profound impact on biological, pharmaceutical and medical research. Mass spectrometry has a number of intrinsic characteristics, which make it an attractive tool for Proteomics. It has high precision, sensitivity and resolution, it is highly open to automation, and requires only low- to mid-femtomole sample quantities to yield fast and reliable molecular mass and sequencing information. As a result of its simplicity, excellent mass accuracy, high resolution and sensitivity, MALDI-TOF has become a method of choice for the analysis of proteins. In Proteomics application, MS is applied in combination to many other techniques of separation, digestion and purification, which involve various reagents and working conditions. These front procedures have a great and significant impact on the outcome of MALDI-based analyses and many concerted efforts to adapt the sample preparation steps to MS analyses have been made. In the present work, sample-preparation steps of digestion, purification and spotting were deeply investigated. By the help of a complete database that was created along the work, the impact of each different work condition on MALDI measurements was observed and analysed. As well, some method improvements and alternative protocols were proposed. The study of the in-gel and in-solution tryptic digestions: The peptide recoveries of standard proteins as well as the physico-chemical parameters of the recognised peptides were investigated. A major result of this investigation was the observation that in-gel and in-solution digestions do not yield the same peptide populations and could be used as complementary approaches. It was observed that the complex character of gel matrix is not a limiting factor of the tryptic digestion. On the other hand, by digestion-background studies and sample-dilution series - performed with digestion blanks - the in-solution digestion background appeared even more restricting than the in-gel digestion one. The purification-step-study was based on five different purification protocols applied to standard and membrane proteins. The first observations were that no universal method of purification exists and that purification is often necessary in spite of frequent peptide losses. It also showed up that the choice of the purification procedure (or combination) has a significant impact on the results and that it cannot be regarded yet as a routine step within the sarnple preparation. Furthermore, alternatives to the expensive and tedtous procedures (PVDF and nitrocellulose membranes as well as "Spin & Pellet" protocol) are proposed. In another study, it was elucidated that chromatographic reverse-phase (RP) media could turn into ion-exchange surfaces by binding SDS molecules. The work on the final sample preparation (spottin- step was made with the airn to improve the application of the two most widely used matrices: alpha-cyano-4-hydxoxycinnamic acid (HACC) and 2,5-hydroxybenzoic acid (DHB). In a first step sarnple-dilution series were carried out to investigate the limit of detection for the peptide-mass-fingerprint (PMF) technique, for this purpose samples were diluted with in-gel or in-solution digestion blanks. In addition, the effect of the use of various acids added to the final matrix-analyte preparation was investigated. The results emphasized the sensitivity, the adaptability and the versatility of the matrix DHB. Besides the fact that this matrix yielded significant improvements for several acids added, it often resulted in the identification of a larger nurnber of peptides as weil as more intense peptide signais than HACC does. The benefits of the use of ceaain acids such as H3PO4, HClO4 or HPF6 with DHB or HCOOH and HClO4 with HACC were generally demonstrated. This study consequently constitutes an analytic work that establishes a better view and understanding of sarnple manipuiations in MS-based Proteomics, it proposes to use more versatile protocols than those applied in standard tools and also delivers some clear improvements of current methods.

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Metadaten
Author:Marianne André
URN:urn:nbn:de:hebis:30-46924
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Michael Karas, J.C. Tabet
Advisor:Michael Karas
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2007/08/08
Year of first Publication:2006
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2007/01/01
Release Date:2007/08/08
Page Number:136
First Page:1
Last Page:116
Note:
Diese Dissertation steht leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext im WWW zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:317540386
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Pharmazie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
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