Open Access

Robin Krause

• In der vorliegenden Arbeit wurden festkörperunterstützte Membranen in Verbindung mit schnellen Lösungswechseln als Methode zur Messung von elektrogenen Transportvorgängen in biologischen Membranen untersucht und charakterisiert. Parallel zu einem manuellen Messsystem wurde eine Technologie auf der Basis eines Pipettierroboters mitentwickelt und charakterisiert, die es erlaubt, automatisierte Messungen mit erhöhtem Durchsatz durchzuführen. Die Sensoren wurden als Sensorarray auf der Basis einer standardisierten 96er Mikrotiterplatte realisiert. Zur Lösungshantierung kam ein Pipettierroboter zum Einsatz, der mit einer selbstentwickelten Injektionseinheit bestückt wurde. In dieser Injektionseinheit ließen sich die verwendeten Lösungen überschichten, wodurch ein Lösungswechsel von einer substratfreien zu einer substrathaltigen Lösung durchgeführt werden konnte. Mit dem beschriebenen System konnten die in dieser Arbeit behandeleten Proteine EAAC1 und NhaA erfolgreich aktiviert und charakterisiert werden. Hinsichtlich der Transportaktivität wurden mit beiden Proteinen vergleichbare Ergebnisse erzielt wie mit dem manuellen Messsystem. Aus kultivierten CHO-Zellen, die den neuronalen Glutamattransporter EAAC1 rekombinant und fuktional exprimierten, wurden EAAC1-haltigen Cytoplasmamembranen in einem Aufreinigungsschritt (Membranpräparation) gewonnen. Die derart vorliegenden Membranfragmente konnten erfolgreich auf der festkörperunterstützten Membran angelagert werden. In der Abwesenheit von Natriumionen war der EAAC1 nicht aktiv, und er konnte durch den spezifischen kompetitiven Inhibitor TBOA inhibiert werden (Inhibitionskonstante Ki = 1µM). Es wurde beobachtet, dass die Transportströme des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine andere Kinetik aufwiesen als in der Anwesenheit von Kaliumionen, und die Affinität für L-Glutamat war in der Abwesenheit von Kaliumionen verringert (K0,5 = 144 µM). Analysen der Signalformen ergaben eine reduzierte Relokationsrate, wobei es wahrscheinlich ist, dass der EAAC1 ohne Kaliumionen einen Single-Turnover durchführt. Eine weitere Eigenschaft des EAAC1 ist die Fähigkeit, bestimmte Anionen zu leiten. Diese Anionenleitfähigkeit ist strikt Natriumabhängig und wird durch die Bindung von L-Glutamat getriggert. Wenn bei einem Experiment zusätzlich bestimmte Anionen (z.B. Chlorid oder Thiocyanat) anwesend waren, wies der Transportstrom des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine negative Komponente auf. Diese Komponente konnte auf den Einstrom der Anionen entlang des durch den Glutamattransport aufgebauten elektrischen Gradienten zurückgeführt werden. Des Weiteren konnte die Anionenleitfähigkeit mit Anionensprüngen in der Anwesenheit von L-Glutamat und Natriumionen direkt induziert werden. Damit wurden erstmals kanalartige Ionenströme an der festkörperunterstützten Membran nachgewiesen. Der Anionenstrom wies dabei die gleiche Abhängigkeit von der Glutamatkonzentration auf (K0,5 = 31 µM) wie der Transportstrom. Der Übergang in den leitfähigen Zustand und der Transport hängt demnach von dem gleichen L-glutamatgebundenen Zustand des EAAC1 ab. Dies konnte auch unter Verwendung des Inhibitors HIP-B gezeigt werden. HIP-B wurde erstmals an EAAC1 getestet und wies eine Inhibitionswirkung auf den Transportstrom auf, die nicht auf eine kompetitive Bindung zurückzuführen war. Die Anionenleitfähigkeit ließ sich mit HIP-B hingegen nicht inhibieren. Der bakterielle Natrium-Protonen-Austauscher NhaA lag rekonstituiert in Liposomen vor, die auf der festkörperunterstützten Membran angelagert wurden. Bedingt durch die RSO-Orientierung des NhaA, konnte der Natriumtransport entgegen der natürlichen Transportrichtung (extrazelluläre Natriumbindung) untersucht werden. Der Transportstrom wies eine ausgeprägte Abhängigkeit vom pH-Wert auf. Bei neutralen bzw. sauren pH-Werten (pH <= 7) war die Aktivität des NhaA gegenüber dem alkalischen Bereich (7 < pH < 9) erheblich reduziert. Dieses Verhalten entspricht Literaturangaben für die Intrazellulärseite des NhaA. Dennoch war der NhaA bei einem neutralen pH-Wert nicht vollständig inaktiv. Die Affinität für Natriumionen konnte bei einem pH-Wert von 8,5 zu K0,5 = 11 mM und bei pH 7,0 zu K0,5 = 180 mM bestimmt werden. Neben einer Verringerung der Wechselzahl sinkt im neutralen/sauren Bereich also auch die Affinität für Natriumionen. Durch die Verwendung von Liposomen, in denen der NhaA mit verschiedenen Lipid- zu Protein-Verhältnissen rekonstituiert wurde, konnte gezeigt werden, dass die Messströme auf die Aufladung der Liposomen zurückführbar sind. Der Transportstrom konnte mit der amiloridähnlichen Substanz 2-Aminoperimidin inhibiert werden (Ki = 3 µM). Eine Inhibitionswirkung war nur zu beobachten, wenn der pH-Wert kleiner als pH 8 war. Zusammmen mit der ausgeprägten pH-Wertabhängigkeit kann dieses Phänomen auf eine pH-induzierte Konformationsänderung des NhaA zurückgeführt werden.
• In this work solid supported membranes were used in combination with rapid solution exchanges to investigate and characterise electrogenic transport processes at biological membranes. Parallel to a manual measuring system a technology on the basis of a pipetting robot was codeveloped and characterised to accomplish automated measurements with increased throughput. Therefore the sensors were realised as a sensor array on the basis of a standardised 96 micro titer plate. A pipetting robot, equipped with a self-developed injection unit, was used for liquid handling. In this injection unit the used solutions could be stacked, whereby a rapid solution exchange could be performed from a substrate-free to a substrat containing solution. With the described system the proteins EAAC1 and NhaA, used in this work, could successfully be activated and characterised. Regarding the transport activity of both proteins comparable results were obtained as with the manual measuring system. Membrane fragments containing the neuronal glutamate transporter EAAC1 were prepared from cultivated CHO cells expressing fuctional EAAC1 recombinantelly. These membrane fragments could successfully be adsorbed on the solid supported membrane. In the absence of sodium ions the EAAC1 was not active, and it could be inhibited by the specific competitive inhibitor TBOA (inhibition constant of Ki = 1µM). It was observed that the transport current of the EAAC1 in the absence of potassium ions exhibited different kinetics than in the presence of potassium ions, and the affinity for L-glutamate was reduced in the absence of potassium ions (K0,5 = 144 µM). Analyses of the signals resulted in a reduced relocation rate, whereby it is possible that the EAAC1 without potassium ions performs a single turnover. A further characteristic of the EAAC1 is to be conductive for certain anions. This anion conductivity is strictly sodium dependent and triggered by L-glutamate. If permeating anions (e.g. chloride or thiocyanate) were present during an experiment, the transport current of the EAAC1 in the absence of potassium ions exhibited a negative component. This component could be attributed to the influx of the anions along the electrical gradient build by the transport of glutamate. Moreover the anion conductivity could be induced directly by anion concentration jumps, if L-glutamate and sodium ions were present. Thus channel-like currents at a solid supported membrane were proven for the first time. The anion current showed the same dependency on the glutamate concentration (K0,5 = 31 µM) as the transport current. This means the transition to the conductive state and the transport process depend on the same glutamate bound state of the EAAC1. This could also be shown using the inhibitor HIP-B. HIP-B was tested for the first time at EAAC1 and exhibited an inhibition effect on the transport current, which was not due to a competitive binding. The anion conductivity could not be inhibited with HIP-B. The bacterial sodium proton exchanger NhaA was reconstituted in liposomes, which were adsorbed on the solid supported membrane. Under the RSO orientation of the NhaA, sodium transport could be examined against the natural transport direction (extracellular sodium binding). The transport current exhibited a pronounced dependence on the pH value. At neutral and/or sour pH values (pH <= 7) the activity of the NhaA was substantially reduced in relation to the alkaline range (7 < pH < 9). This behavior corresponds to literature data for the intracellular side of the NhaA. The NhaA was not completely inactive at a neutral pH value. The affinity for sodium ions could be determined to K0,5 = 11 mM at a pH value of 8.5 and to K0,5 = 180 mm at pH 7.0. Apart from a decrease of the turnover thus also the affinity for sodium ions decreases within the neutral/sour range. By the use of liposomes, in which the NhaA was reconstituted with different lipid to protein ratios, it could be shown that the currents are reducible on the loading of the liposomes. The transport current could be inhibited by the amilorid-like substance 2-aminoperimidine (Ki = 3 µM). An inhibition effect was only observed, if the pH value was lower than pH 8. This effect and the pronounced pH value dependency attribute this phenomenon to an pH-induced confomational change of the NhaA.