Open Access

Susanne Miehe

• In the first part of this study, we have identified the two steroid hormones progesterone and norgestimate as novel TRPC channel blockers. Both substances blocked TRPC-mediated Ca2+ influx with micromolar activities in fluorometric measurements. TRPC channel inhibition did not seem to be a general steroid effect since another progestin, the norgestimate metabolite levonorgestrel, was not effective. Norgestimate was 4- to 5-fold more active on the TRPC3/6/7 subfamily compared to TRPC4/5, whereas progesterone was similarly potent. This selectivity of norgestimate was confirmed by patch clamp recordings. As norgestimate blocked channels directly gated by DAG with a fast kinetic, we assume the compound acts on the channel protein itself. This view was further substantiated by the lack of effects on IP3R-mediated Ca2+ release from the endoplasmic reticulum, which is activated in parallel with TRPCs by Gq/11-coupled receptor stimulation. Norgestimate did not only block ectopically expressed TRPC channels but also native, TRPC-mediated currents in rat aortic smooth muscle cells with similar activity. The usefulness of norgestimate as a tool compound for the investigation of physiological TRPC functions was tested in isolated vessel rings. Consistent with TRPC6 being an essential component of the alpha-1-adrenoceptor-activated cation channel, we demonstrated a direct vasorelaxant, endothelium-independent effect of norgestimate on rat aortic rings precontracted with phenylephrine. Thus, our results provide further experimental support for a role of TRPC6 in alpha-1-adrenergic vessel constriction. In the second part of this study, we screened a human aorta cDNA-library for novel TRPC4-interacting proteins with a modified yeast two-hybrid (Y2H) system in which the TRPC4-C-terminus was expressed as tetrameric bait protein, thereby mimicking the native channel conformation. Of the eleven interacting proteins found SESTD1 was chosen for further analyses since it contains a phospholipid-binding Sec14p-like domain and thus could be involved in regulation of TRPC channels by phospholipids. After the biochemical validation of the found interaction, the first spectrin domain of SESTD1 was then identified to interact with the CIRB domain of TRPC4 in directed Y2H tests. SESTD1 also co-immunoprecipitated with the closely related TRPC5 protein in which the SESTD1-binding domain is highly conserved. Independent of the CIRB site, co-immunoprecipitation with TRPC6 and the distantly related TRPM8 channel was observed indicating the existence of other sites in these channel proteins that mediate interaction with SESTD1. Analysis of SESTD1 gene expression in human tissues showed that its transcripts are ubiquitously expressed and tissues with significant coexpression with TRPC4 and -5 were identified. We have generated two polyclonal antisera directed against SESTD1 that consistently detected SESTD1 protein in brain, aorta, heart, and in smooth muscle and endothelial cells. The functional consequences of the found interaction were investigated by examination of the TRPC5-mediated Ca2+ influx in a clonal HM1 cell line stably expressing the channel. Since SESTD1 overexpression had no detectable effects on TRPC5-mediated Ca2+ influx, most likely due to expression of endogenous SESTD1, we knocked-down the native protein with specific siRNA. This procedure reduced TRPC5-mediated Ca2+ influx following receptor stimulation by 50%. Parallel biotinylation experiments did not reveal any differences in cell surface expressed TRPC5-protein, suggesting that reduction of TRPC5 activity resulted from a loss of a direct SESTD1 effect on the channel. In addition, in immunofluorescence experiments we observed that reduced SESTD1 protein levels resulted in a redistribution of the multifunctional protein ß-catenin from the plasma membrane to the cytosol. This result may point to an involvement of SESTD1 in formation and maintenance of adherens junctions. SESTD1 contains a phospholipid-binding Sec14p-like domain and we were the first to demonstrate its Ca2+-dependent binding to phosphatidic acid and all physiological phosphatidylinositol mono- and bisphosphates in vitro. The physiological function of this binding activity is not known at present, but it could play a role in regulation of associated TRPC channels. TRPC4 and -5 channels are activated by phospholipid hydrolysis and also bind phospholipids directly. The identification of SESTD1 as novel TRPC-interacting protein could thus be an important step forward in the investigation and better comprehension of the complex molecular mechanisms of TRP channel regulation by lipids.
• Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden zwei Gestagene, Progesteron und Norgestimat, als neue TRPC-Kanalinhibitoren identifiziert. Sie hemmten den TRPC-vermittelten Ca2+-Einstrom in fluorometrischen Messungen im mikromolaren Konzentrationsbereich. Ein Metabolit des Norgestimats, das Levonorgestrel, war hingegen nicht wirksam. Diese unterschiedliche Wirkung der strukturell nahe verwandten Substanzen schließt eine unspezifische Hemmung von TRPCs durch diese Steroide aus. Norgestimat hemmte die Vertreter der TRPC3/6/7-Unterfamilie vier- bis fünfmal stärker als TRPC4/5 während die Wirkung von Progesteron auf beide Unterfamilien vergleichbar war. Patch Clamp-Untersuchungen bestätigten die Selektivität von Norgestimat. Da Norgestimat Kanäle, die direkt durch DAG aktiviert werden, mit einer schnellen Kinetik blockte, nehmen wir an, dass es die Kanalproteine direkt hemmt. Dafür spricht auch, dass es keinen Effekt auf die IP3R-vermittelte Ca2+-Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum hatte, die parallel zu TRPCs durch Gq/11-gekoppelte Rezeptorstimulation aktiviert wird. Norgestimat hemmte heterolog exprimierte Kanäle und native, TRPC-vermittelte Ströme in glatten Gefäßmuskelzellen aus Rattenaorten mit vergleichbarer Aktivität. Die Eignung von Norgestimat als pharmakologisches Werkzeug zur Untersuchung physiologischer TRPC-Funktionen testeten wir in isolierten Gefäßringen. An vorkontrahierten Aortenringen aus der Ratte konnte nach Gabe von Norgestimat eine endothel-unabhängige Relaxation beobachtet werden. In Übereinstimmung mit bekannten Literaturdaten legt auch dieses Ergebnis nahe, dass TRPC6-Kanäle an der Regulation des Gefäßtonus beteiligt sind. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine cDNS-Bibliothek aus humanen Aorten mit Hilfe eines modifizierten Hefe Zwei-Hybrid Systems durchmustert. Als Köderprotein diente der C-Terminus des TRPC4-Kanalproteins, der als tetrameres Fusionsprotein, d.h. in seiner nativen Konformation, vorlag. Elf Proteine wurden isoliert, von denen das SESTD1-Protein für weitergehende Untersuchungen ausgewählt wurde, weil es eine phospholipidbindende Sec14p-Domäne besitzt. Damit könnte es an der TRPC-Kanalregulation durch Phospholipide beteiligt sein. Seine Interaktion mit TRPC4 wurde mit proteinbiochemischen Methoden bestätigt. In gerichteten Interaktionsstudien in Hefezellen wurde die erste Spektrindomäne von SESTD1 als Bindungspartner der CIRB-Domäne von TRPC4 identifiziert. SESTD1 band auch das nahe verwandte TRPC5-Protein, in dem die SESTD1-Interaktionssequenz hoch konserviert ist. Die CIRB-unabhängige Koimmunopräzipitation von SESTD1 mit TRPC6 und dem entfernter verwandten TRPM8-Kanalprotein weist jedoch darauf hin, dass diese TRP-Kanäle noch weitere SESTD1-Bindungsstellen besitzen müssen. Die Analyse der SESTD1-Transkriptexpression in verschiedenen humanen Geweben zeigte, dass SESTD1 ubiquitär und damit überlappend mit TRPC4 bzw. -5 exprimiert wird. Für den Nachweis des SESTD1-Proteins wurden zwei polyklonale Antikörper hergestellt, mit denen es in Übereinstimmung mit diesen Daten in Gehirn, Herz, Aorta, Glattmuskel- und Endothelzellen nachgewiesen werden konnte. Zur funktionellen Charakterisierung der gefundenen Interaktion wurden mögliche Wirkungen von SESTD1 auf den TRPC5-vermittelten Ca2+-Einstrom exemplarisch in einer klonalen HM1-Zelllinie untersucht, die den Kanal stabil exprimiert. Die Überexpression von SESTD1 in dieser Zelllinie hatte keinen signifikanten Effekt auf den TRPC5-vermittelten Ca2+-Einstrom. Deshalb wurde die Menge des endogenen SESTD1-Proteins mittels spezifischer siRNA stark reduziert, wodurch auch der TRPC5-vermittelte Ca2+-Einstrom nach Rezeptorstimulation um etwa die Hälfte verringert wurde. Biotinylierungsstudien zeigten, dass die Menge des TRPC5-Proteins an der Plasmamembran nicht verändert war, was wiederum einen direkten Einfluss von SESTD1 auf die Kanalaktivität nahelegt. Immunfluoreszenzstudien zeigten außerdem, dass die siRNA-vermittelte Reduzierung der SESTD1-Proteinexpression zu einer Umverteilung des multifunktionellen ß-Catenin-Proteins von der Plasmamembran in das Zytosol führte. SESTD1 ist also möglicherweise an der Bildung und/oder Aufrechterhaltung von Zell-Zell-Kontakten beteiligt. SESTD1 besitzt eine phospholipidbindende Sec14p-Domäne und wir zeigen erstmalig, dass es Phosphatidylsäure und alle physiologisch vorkommenden Phosphatidylinositolmono- und -diphosphate in vitro bindet und diese Bindung Ca2+-abhängig moduliert wird. Die physiologische Relevanz dieser Bindung ist bisher nicht bekannt. Phospholipide sind in komplexer Weise an der Regulation von TRPC4/5 beteiligt. Sie stellen das Substrat für die zur Kanalaktivierung essentiellen Hydrolysefunktionen von PLC dar und binden darüber hinaus direkt an die Kanalproteine. Die Identifizierung von SESTD1 als TRPC-interagierendes Protein könnte ein wichtiger Schritt zur mechanistischen Aufklärung der Kanal-Lipid-Wechselwirkung sowie ihrer funktionellen Konsequenzen sein.