Open Access

Thomas Brühl

• Die postnatale Neovaskularisierung ist eine wichtige Vorraussetzung um Gewebe vor kritischer Ischämie zu schützen. Eine der Grundlagen dieses Prozesses bilden die Angiogenese, bei der neue Kapillaren durch Proliferation und Migration von Endothelzellen aus bereits vorhandenen Blutgefäßen entstehen. Ein zweiter Eckpfeiler ist die Vaskulogenese, die unter anderem durch zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPC) vermittelt wird. Homeobox-Gene der Klasse 1 (Hox) sind Transkriptionsfaktoren, die während der Embryonalentwicklung an der Organogenese und der Entwicklung des kardiovaskulären Systems beteiligt sind. Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass Homeobox-Proteine auch im adulten Organismus bei der transkriptionellen Regulation von Genen der Angio- und Vaskulogenese eine wichtige Rolle spielen. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse zeigen eine essentielle Rolle von HoxA9 für die postnatale Neovaskularisierung sowie für die funktionelle Integrität von Endothelzellen und endothelialen Progenitorzellen. HoxA9-defiziente Mäuse hatten einen signifikant verringerten Blutfluss nach einer Hinterlauflauf-Ischämie. Für die reduzierte Neovaskularisierung des ischämischen Gewebes, genügte der Verlust eines einzigen HoxA9-Wildtypallels. Außerdem zeigen HoxA9-defiziente Endothelzellen in vitro eine stark gehemmte Migration sowie eine verringerte Gefäßstrukturbildung. Zusätzlich war auch deren Interaktion mit EPC im Matrigel verschlechtert. Eine Bestätigung dieser Beobachtung zeigten Untersuchungen an endothelialen Vorläuferzellen, die ebenfalls einen Verlust angiogener Funktionen bei verminderter HoxA9-Expression aufwiesen. Neben der postnatalen Neovaskularisierung konnten erste Untersuchungen embryonaler Allantois zeigen, das HoxA9 vermutlich auch in der embryonalen Gefäßbildung beteiligt ist. Diese Theorie wird durch eine nicht-Mendelsche Verteilung der postnatalen Genotypen nach Kreuzung heterozygoter HoxA9-Mäuse unterstützt. Als molekulare Ursachen der Hemmung angiogener Funktionen bei Endothelzellen, konnte die Regulation verschiedener Gene nachgewiesen werden. So ist HoxA9 für die Expression der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS), des VEGF-Rezeptors 2 (VEGF-R2), der Adhäsionsmoleküle VE-Cadherin und Integrin v3 sowie des EphB4-Rezeptors von essentieller Bedeutung. Diese von HoxA9 regulierten Gene spielen für die Angio- und Vaskulogenese alle eine entscheidende Rolle. Der EphB4-Rezeptor, die eNOS und der VEGF-R2 werden durch eine direkte Bindung von HoxA9 an den jeweiligen Promotor auf transkriptioneller Ebene reguliert. Bei den Genen Integrin v3 und VE-Cadherin erfolgt die Regulation durch HoxA9 indirekt über andere Gene oder posttranskriptionell. Zusätzlich zum Nachweis der Kontrolle der Genexpression, konnte für den EphB4-Rezeptor nachgewiesen werden, dass dieser von großer Bedeutung für die HoxA9-regulierte Migration ist. Außerdem besitzt der EphB4-Promotor eine für die Regulation der EphB4-Expression durch HoxA9 wichtige Bindungsstelle. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass HoxA9 Schubspannungs-abhängig reguliert wird und dabei auch in die Regulation der Schubspannungs-induzierten Migration und die Schubspannungs-abhängige Expression der untersuchten Zielgene von HoxA9 eingreift. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass HoxA9 endotheliale Gene vielfältig reguliert, eine entscheidende Rolle bei der Modulation verschiedener endothelialer Funktionen spielt und essentiell für die postnatale Neovaskularisierung ist.
• Postnatal neovascularisation, which is important to protect tissues from critical ischemia, includes both angiogenesis and vasculogenesis. Thereby angiogenesis is due to proliferation and migration of mature endothelial cells (EC) out of pre-existing, blood vessels, whereas vasculogenesis depends on the integration of circulating endothelial progenitor cells (EPC). Homeobox morphoregulatory genes encode for transcription factors, which regulate cell proliferation and migration and play an important role in organogenesis and the development of the cardiovascular system during embryogenesis. However, previous publications and recent data of our group demonstrate also principal role of homeobox genes (Hox) for an angiogenic phenotype in the adult organism. Homeobox genes are organised in four genomic clusters with a DNA-binding motif, the homeodomain. Endothelial cells express homeobox genes from several clusters such as HoxA, HoxB and HoxD, which regulate cell adhesions molecules like N-CAM, L-CAM or putative Eph-receptors. But there is no evidence for direct regulation from Eph-receptors via Homeobox genes. In addition recent studies showed that HoxD3 induce angiogenesis in EC by expression of Integrin v3 and HoxB3 stimulate capillary structures in an animal model. An alternatively splice variant of HoxA9 was detected as an endothelial-specific homeobox gene. In addition to mature EC, EPC play an important role for adult blood vessel formation. EPC derive from hematopoietic stem cells (HSC) and are released from the bone marrow. Ectopic expression of transcription factor HoxB4 promote the differentiation from earlier primitive progenitors to definitive HSC in vitro. In addition HoxB4 have a high potency to enable high-level ex vivo HSC expansion and increase in vivo the regenerative potential of HSC to improve hematopoiesis. Laminar shear stress is an important endogenous stimulus to maintain endothelial cell function. Shear stress regulates the expression of endothelial specific proteins such as VEGF receptor 2 (KDR) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Homeodomain transcription factors are master regulatory genes, which are involved in differentiation. In particular, homeobox A9 (HoxA9) promotes angiogenic functions and may act as an endothelial regulatory factor. Therefore, we investigated the role of HoxA9 for shear stress-induced gene expression. Shear stress time- and dose-dependently increased HoxA9 protein expression. Knock-down of HoxA9 by RNA interference (RNAi) in HUVEC significantly regulated eNOS, EphB4, KDR, Integrin v3 and VE-Cadherin, whereas the expression of CD31 and von Willebrand factor were unchanged. To determine a direct regulatory role of HoxA9 for eNOS, EphB4, KDR, Integrin v3 and VE-Cadherin, we analyzed the binding of HoxA9 to their promoters by chromatin-immunoprecipitation (ChIP). Wild-type HoxA9 bound to the eNOS-, EphB4-, KDR-, Integrin 3 - promoter, whereas a HoxA9 mutant lacking the DNA binding domain did not. HoxA9 did not bind the VE-Cadherin- or Integrin v-promoter. Moreover, overexpression of HoxA9 wt significantly enhanced eNOS-, EphB4-, KDR-, Integrin v3 - and VE-Cadherin - promoter activity in a luciferase assay.