Open Access

Alexander Wilhelm

• The majority of B-cell precursor acute leukemias in infants are associated with the chromosomal translocation t(4;11)(q21;q23), resulting in the fusion of the mixed-lineage leukemia (MLL) and ALL1-fused gene of chromosome 4 (AF4) genes. While the fusion protein MLL-AF4 is expressed in all t(4;11) patients and essential for leukemia progression, the distinct role of the reciprocal fusion protein AF4-MLL, that is expressed in only 50-80% of t(4;11) leukemia patients (Meyer et al., 2018), remains unclear. In addition, t(4;11) leukemia could so far exclusively be generated in vivo in the presence of AF4-MLL and independent of the co-expression of MLL-AF4 (Bursen et al., 2010). In a multifactorial approach inhibiting histone deacetylases (HDACs) and expressing the dominant negative mutation of Taspase1 (dnTASP1), both MLL fusion proteins were targeted simultaneously to evaluate a possible cooperative effect between MLL-AF4 and AF4-MLL during the progression of leukemia. Of note, neither HDACi nor dnTASP1 expression negatively affect endogenous MLL, but rather endorse its function hampered by the MLL fusion proteins (Ahmad et al., 2014; Bursen et al., 2004; Zhao et al., 2019). The mere expression of dnTASP1 failed to induce apoptosis, whereas dnTASP1 could elevate apoptosis levels significantly in HDACi-treated t(4;11) cells underlining the therapeutic potential of co-inhibiting both MLL fusion proteins. Next, the impact of inhibiting either MLL-AF4 or AF4-MLL in vivo was resolved using whole transcriptome analysis. In PDX cells obtained by the Jeremias Laboratory (Völse, 2020) that co-expressed both t(4;11) fusion proteins, the knock-down of MLL-AF4 revealed the down-regulation of pivotal hemato-malignant factors. The expression of dnTASP1 led to massive deregulation of cell-cycle genes in vivo. Considering that the inhibition of particularly MLL-AF4 but not AF4-MLL impaired leukemic cell growth in vivo (Völse, 2020), the results of this work suggest a cooperative effect between both fusion proteins, while the loss of AF4-MLL during leukemia progression appears not essential. Thereafter, a possible short-term role of AF4-MLL during the establishment of t(4;11) leukemia was analyzed. For this purpose, an in vitro t(4;11) model was constructed to investigate the transforming potential of transiently expressed AF4-MLL in cells constitutively expressing MLL-AF4, putatively reflecting the situation in vivo. Due to the lack of a leukemic background of the applied cell line, the aim was to investigate the long-term potential of AF4-MLL to significantly alter the epigenome rather than mimicking the development of leukemia. Strikingly, short-term-expressed AF4-MLL in cooperation with MLL-AF4 exerted durable epigenetic effects on gene transcription and chromatin accessibility. The here obtained in vitro data suggest a clonal evolutionary process initiated by AF4-MLL in a cooperative manner with MLL-AF4. Importantly, no long-term changes in chromatin accessibility could be observed by the transient expression of either MLL-AF4 or AF4-MLL alone. All in all, considering endogenous MLL, MLL-AF4 and AF4-MLL in a targeted treatment is a promising approach for a more tailored therapy against t(4;11) leukemia, and AF4-MLL is suggested to act in a cooperative manner with MLL-AF4 especially during the development of a t(4;11) leukemia.
• Die meisten akuten B-Zell Leukämien bei Säuglingen sind mit der chromosomalen Translokation t(4;11)(q21;q23) assoziiert, die zur Fusion der Gene für Mixed Lineage Leukemia (MLL) und ALL1-Fusion von Chromosom 4 (AF4) führt. Die derzeitige Behandlung der t(4;11) ALL überleben nur 10-30% der Patienten, wobei die Gruppe der Säuglinge unter drei Monaten am meisten gefährdet ist (Bueno et al., 2011; Felix et al., 2000; Hess, 2004; Isoyama et al., 2002; Pui et al., 2002). Nach einer t(4;11)-Translokation erwerben transformierte Zellen eine geringe Anzahl an weiteren somatischen Mutationen, was die Potenz von chromosomalen Translokationen bei Leukämien, sowie die Notwendigkeit neuer maßgeschneiderter Therapien unterstreicht (Britten et al., 2019; Dobbins et al., 2013; Pikman and Stegmaier, 2018; Steinhilber and Marschalek, 2017). Die Tatsache, dass AF4-MLL einen funktionellen N-Terminus des Transkriptionsverlängerungsfaktors AF4 und den C-Terminus von MLL trägt, der immer noch in der Lage ist Chromatin zu lesen und zu schreiben, legt nahe, dass AF4-MLL als epigenetischer Regulator mit einer starken transformierenden Aktivität fungieren könnte (Marschalek, 2011a; Park et al., 2010; Patel et al., 2009; Prieto et al., 2017; Rössler and Marschalek, 2013; Yokoyama, 2015; Yokoyama et al., 2013). Darüber hinaus wird der zielbestimmende N-Terminus von MLL durch AF4 ersetzt, was auf eine chromatinmodulierende Wirkung von AF4-MLL hinweist, die nicht auf die Zielgene von endogenem MLL beschränkt ist (Broeker et al., 1996; Erfurth et al., 2008; Marschalek, 2011b). Während das Fusionsprotein MLL-AF4 bei allen t(4;11)-Patienten exprimiert wird und für das Fortschreiten der Leukämie essenziell ist, wird die genaue Rolle des reziproken Fusionsproteins AF4-MLL, das nur bei 50-80% der t(4;11)-Leukämiepatienten exprimiert wird, kontrovers diskutiert (Agraz-Doblas et al., 2019; Kowarz et al., 2007; Marschalek, 2011b; Meyer et al., 2018; Muñoz-López et al., 2016; Prieto et al., 2017; Sanjuan-Pla et al., 2015; Trentin et al., 2009). Des Weiteren konnte t(4;11)-Leukämie bisher in vivo ausschließlich in Anwesenheit von AF4-MLL und unabhängig von der Koexpression von MLL-AF4 erzeugt werden (Prieto et al., 2017). Ziel dieser Arbeit ist es, das Verständnis der Rolle von reziprokem AF4-MLL im Zusammenspiel mit MLL-AF4 während der Entstehung und dem Fortschreiten von t(4;11)-Leukämie voranzutreiben. Ein großer Teil der Studien im Bereich der t(4;11)-ALL-Forschung konzentriert sich auf die Hemmung des MLL-Fusionsproteins MLL-AF4. Es fehlen Daten zur Bewertung des therapeutischen Nutzens der Hemmung des reziproken Fusionsproteins AF4-MLL allein oder zusammen mit MLL-AF4. Darüber hinaus beeinträchtigen MLL-AF4-spezifische Wirkstoffe häufig endogenes MLL und damit die gesamte Transkriptionsmaschinerie. Der derzeitige Behandlungsplan für MLL-r-Leukämiepatienten, einschließlich der stark betroffenen Gruppe von Kleinkindern, besteht aus mehreren potenten Medikamenten, die oft zu schweren Nebenwirkungen oder sogar zum Tod führen (Britten et al., 2019). In dieser Arbeit wird ein neuartiger therapeutischer Ansatz untersucht, der darauf abzielt, sowohl die MLL-Fusionsproteine zu hemmen als auch die Funktion des endogenen MLL zu erhalten. Zur Hemmung des reziproken Fusionsproteins AF4-MLL in vitro wurde die pro-B ALL-Zelllinie SEM, die sowohl MLL-AF4 als auch AF4-MLL exprimiert, mit einem Sleeping-Beauty-Expressionsplasmid zur induzierbaren Expression einer dominant negativen Mutante von Taspase1 (dnTASP1) transfiziert (Kowarz et al., 2015). Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Expression von dnTASP1 die Taspase1-vermittelte Spaltung in der Nähe des C-Terminus sowohl endogenes MLL als auch AF4-MLL wirksam hemmt (Sabiani et al., 2015). Darüber hinaus ist bekannt, dass insbesondere AF4-MLL nach dnTASP1-Expression durch das Proteasom abgebaut wird, während ungespaltenes MLL weiterhin katalytisch aktiv ist (Sabiani et al., 2015; Yokoyama et al., 2013). Die kürzlich nachgewiesene Fähigkeit von Histon-Deacetylase Inhibitoren (HDAC-Inhibitoren), die dominanten Auswirkungen von MLL-AF4 durch eine Reaktivierung von endogenem MLL zu verringern (Ahmad et al., 2014), ergänzt den in dieser Studie untersuchten dualen Therapieansatz. Während die alleinige Expression von dnTASP1 keine Apoptose auslösen konnte, erhöhte dnTASP1 in HDACi-behandelten t(4;11)-Zellen in vitro die Apoptoseniveaus signifikant, was auf ein therapeutisches Potenzial einer gemeinsamen Hemmung beider MLL Fusionsproteine hindeutet. Die induzierte Apoptose in mit HDACi behandelten SEM-Zellen war proportional zum Expressionsintervall von dnTASP1, wobei eine verlängerte Verabreichung von HDACis für 48 Stunden die Empfindlichkeit von SEM-dnTASP1-Zellen gegenüber Klasse I HDACi wie Mocetinostat und Entinostat verstärkte...