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Julia Kaiser

• In jüngster Zeit werden vom humanen Immundefizienzvirus-1-abgeleitete lentivirale Vektoren auch in der Gentherapie eingesetzt. Obwohl diese Vektoren nicht-mitotische Zellen transduzieren können, sind sie für einen Gentransfer in primäre ruhende Zellen oft nicht geeignet. In der Abteilung „Medizinische Biotechnologie“ des Paul-Ehrlich-Insituts wurde ein vom simianen Immundefizienzvirus SIVsmmPBj-abgeleiteter lentiviraler Vektor entwickelt, welcher im Gegensatz zu HIV-1-abgeleiteten Vektoren effizient in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte humane Fibroblasten und humane primäre Monozyten transduzieren kann (Mühlebach et al., 2005). Im dieser Arbeit wurde das Potenzial dieses neuen Vektors für mögliche Anwendungen in der Gentherapie untersucht, indem seine Transduktionsfähigkeit für weitere primäre Zellen bestimmt wurde. Dabei waren humane hämatopoetische Stammzellen von besonderem Interesse, da sie die Vorläuferzellen aller Zellen des Blutes sind und die Eigenschaft zur Selbsterneuerung besitzen. Die Effizienz des Gentransfers in unstimulierten Stammzellen mit dem SIVsmmPBj-Vektor war jedoch nicht höher als mit anderen lentiviralen Vektoren. Interessanterweise konnte aber ein Einfluss der lentiviralen Vektoren auf das in vitro-Differenzierungspotenzial der transduzierten Stammzellen in die verschiedenen Vorläuferzellen beobachtet werden: Nach Transduktion mit dem SIVsmmPBj- und einem HIV-2-abgeleiteten Vektor differenzierten die Stammzellen bevorzugt in granulozytäre Vorläuferzellen, während die Transduktion mit einem HIV-1-abgeleiteten Vektor die Anzahl aller Vorläuferzellen deutlich reduzierte und insbesonders die Differenzierung in Makrophagenvorläuferzellen verminderte. Zur Untersuchung ihres Differenzierungs-potenzials in vivo wurden transduzierte hämatopoetische Stammzellen zur Repopulierung des Knochenmarks von NOD/SCID-Mäusen eingesetzt. Hierbei wurde jedoch kein Einfluss der verschiedenen lentiviralen Vektoren auf die Differenzierung der Stammzellen beobachtet. Allerdings konnte nur in einem sehr geringen Anteil der transplantierten Zellen eine Expression des übertragenen Gens nachgewiesen werden, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass die transduzierten Zellen die Fähigkeit zur Repopulierung verloren hatten. Insgesamt ist jedoch zu sagen, dass entgegen der Erwartungen der neue Vektor keinen Vorteil gegenüber HIV-1-Vektoren zur Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen aufweist. Weiter wurde die Transduktionsfähigkeit des SIVsmmPBj-Vekors für humanen B-Lymphozyten, Makrophagen und dendritische Zellen untersucht. Auf ruhenden B-Lymphozyten besaß der SIVsmmPBj-Vektor keinen Transduktionsvorteil gegenüber einem HIV-1-abgeleiteten Vektor, während Makrophagen und dendritische Zellen mit signifikant höherer Effizienz transduziert werden konnten. Die hohe Transduktionseffizienz des SIVsmmPBj-Vektors für Monozyten und dendritische Zellen eröffnet die Möglichkeit einer Anwendung in der Immuntherapie, da dendritische Zellen die professionellsten und effektivsten Antigen-präsentierenden Zellen sind. Daher wurde die generelle Eignung des SIVsmmPBj-Vektors für immuntherapeutische Anwendungen untersucht. Ein Tumor-assoziiertes Antigen (Mart-1) wurde in Monozyten übertragen und die transduzierten Zellen zu reifen dendritischen Zellen maturiert. Diese Zellen besaßen die Fähigkeit, Antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen zu generieren, deren Funktion durch Sekretion von Zytokinen, in Einzelfällen auch durch spezifische Lyse von Mart-exprimierenden Tumorzellen nachgewiesen wurde. Weiterhin wurde gezeigt, dass nach Transduktion von Monozyten und deren Differenzierung zu Makrophagen auch diese prinzipiell in der Lage sind, Antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen zu generieren. Obwohl hier keine vergleichenden Untersuchungen zur Effizienz des T-Zell-Primings durchgeführt werden konnten, ist die prinzipielle Eignung des SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektors für eine Immuntherapie damit nachgewiesen. Schließlich wurde untersucht, ob die Maus oder nicht-menschliche Primaten als Tiermodelle für eine mögliche Weiterentwicklung des Vektors in Frage kommen. Murine Monozyten konnten jedoch nicht effizient transduziert werden. Hingegen erwies sich der SIVsmmPBj-Vektor als gut geeignet zur Transduktion von simianen Monozyten, so dass ein Affenmodell für Anwendungen des SIVsmmPBj-Vektors, wie beispielsweise zur Tumor-Immuntherapie oder für Vakzinierungsstudien, in Frage kommt.
• Although lentiviral vectors enable gene transfer into non-proliferating cells, quiescent cells in the G0 phase of the cell cycle have been shown to remain resistant to lentiviral transduction. However, in the division “Medical Biotechnology” at the Paul-Ehrlich-Institut a lentiviral vector derived from SIVsmmPBj, an SIV strain from sootey mangabey monkeys, has been developed, which enables transduction of quiescent (G0) primary human monocytes refractory to transduction by HIV-1-derived vectors. At first, the potential of the SIVsmmPBj-vector has been investigated for possible approaches in gene therapy by transducing several different primary cells. Human CD34+ hematopoietic stem cells have been of special interest, because they are the precursors of all blood cells and possess the capacity of self-renewal. However, the efficiency of gene transfer in unstimulated stem cells using the SIVsmmPBj vector was not higher than by using other lentiviral vectors. Interestingly, an influence of the lentiviral vectors on the in vitro differentiation potential of the transduced stem cells could be observed. After transduction with the SIVsmmPBj and with an HIV-2-derived vector, the stem cells differentiated preferentially into granulocytic precursors, while transduction with an HIV-1-derived vector decreased the overall number of precursors, thereby especially decreasing/inhibiting the differentiation into precursors of macrophages. For analysis of the differentiation potential in vivo, transduced hematopoietic stem cells have been used for the repopulation of bone marrow of NOD/SCID mice. Here, no influence of the different lentiviral vectors could be detected. Admittedly, only a very low amount of the transplanted cells expressed the delivered transgene, thus it cannot be excluded that the transduced cells had lost their repopulating capacity. Altogether, it could be shown that the SIVsmmPBj vector has no advantage over HIV-1- or HIV-2-derived vectors. Furthermore the transduction capacity of SIVsmmPBj vectors for human B lymphocytes, macrophages and dendritic cells has been investigated. For resting B lymphocytes no advantage of transduction capacity for the SIVsmmPBj vector could be observed. Contrary to this, the SIVsmmPBj vector could transduce human macrophages and immature dendritic cells with high efficiency in contrast to the HIV-1-derived vector. The high transduction efficiency of the SIVsmmPBj vector on monocytes and dendritic cells enables the possibility of an immunotherapeutic approach, because dendritic cells are the most potent antigen presenting cells. To investigate the application of the SIVsmmPBj vector in immunotherapy, the tumour-associated antigen Mart-1 was inserted into the vector, which was then used to transfer the transgene into monocytes. After maturation into dendritic cells, it could be shown, that the cells still possess the ability to stimulate antigen specific cytotoxic T cells, which was proven by the secretion of cytokines and, in individual cases, by the specific lysis of Mart-expressing tumour cell lines. Furthermore it could be shown in principle, that macrophages, which had been differentiated from transduced monocytes, still have the ability to stimulate antigen specific cytotoxic T cells. A cellular vaccine based on mDCs derived from genetically modified monocytes may be suitable for cancer immunotherapy. With a view to an in vivo analysis of the applications of SIVsmmPBj vectors, possible murine or simian animal models have been investigated. Therefore, murine or simian monocytes have been isolated and transduced with the SIVsmmPBj vector. Only simian monocytes could be transduced efficiently, so that a simian animal model for studying the applications of SIVsmmPBj vectors in immunotherapeutical approaches is suitable.