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Enela Dzafic

• Die Funktion von Membranproteinen ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl zellulärer Prozesse. Um diese verstehen zu können, ist das Verständnis der Beziehungen zwischen der Struktur, der Dynamik und der Wechselwirkung mit der Umgebung der Membranproteine notwendig. Spektroskopische Methoden, wie beispielsweise FTIR- und CD-Spektroskopie sind in der Lage, diese Informationen zu geben. In der vorliegenden Dissertation haben sie bedeutende Beiträge zum Verständnis der durch die Aktivierung induzierten Konformationsänderungen der Na+/H+ Antiporter geleistet. Die hohe Empfindlichkeit einer selbstkonstruierten FTIR-ATR-Perfusionszelle ermöglichte es, über eine Proteinprobe verschiedene Wirkstoffmoleküle perfundieren zu lassen und die dadurch verursachten strukturellen Änderungen spektroskopisch zu charakterisieren. Die Konformationsänderungen, die den Aktivierungsprozess begleiten, wurden bei zwei verschiedenen Na+/H+ Antiportern, NhaA und MjNhaP1, untersucht. Sie werden bei unterschiedlichen pH-Bereichen aktiviert bzw. deaktiviert. Der Na+/H+ Antiporter NhaA aus E. coli hat seine maximale Transportaktivität bei pH 8,5 und ist bei pH < 6,5 vollständig inaktiv. Trotz bekannter 3D-Struktur dieses Proteins für die inaktive Konformation bei pH 4 bleiben die Konformationsänderungen, die mit der Aktivierung des Proteins einhergehen, immer noch ungeklärt. Die Analyse der FTIR- und CD-Spektren von NhaA ergab in beiden Zuständen Anteile an beta-Faltblatt, an Schleifen und ungeordneten Strukturen, wobei die alpha-helikale Struktur dominiert. Die FTIR Spektren des inaktiven und aktiven Zustands zeigen zwei Komponenten, die auf die Präsenz zweier alpha-Helices mit unterschiedlichen Eigenschaften abhängig vom Aktivitätszustand hindeuteten. Die temperaturinduzierten strukturellen Änderungen und die Reorganisation des Proteins während des Entfaltungsprozesses bestätigten, dass die Aktivierung des Proteins eine Änderung in den Eigenschaften der alpha-Helices zur Folge hat. Aktivierung führt zu einer thermischen Destabilisierung dieser Struktur. Auch für die beta-Faltblattstruktur, welche den Hauptkontakt zwischen den Monomeren bildet, wurde ein unterschiedliches thermisches Verhalten zwischen dem inaktiven und aktiven Zustand beobachtet. Daraus konnte gefolgert werden, dass Aktivität nur dann möglich ist, wenn NhaA als Dimer vorliegt. Die Ergebnisse des (1)H/(2)H Austauschs zeigen, dass die Lösungsmittelzugänglichkeit des Proteins sich mit der Aktivierung ändert. Die Aktivierung des Proteins induziert eine offene, für die Lösung zugänglichere Konformation, in welcher die Aminosäureseitenketten in der hydrophilen Region des Proteins schneller Wasserstoff durch Deuterium austauschen, und in welcher zusätzliche Aminosäureseitenketten, die sich im inaktiven Zustand in der hydrophoben Region des Proteins befinden, mit der Aktivierung der Lösung exponiert werden. Die Aufnahme reaktionsinduzierter Differenzspektren ergab eindeutige spektroskopische Signaturen für die Zustände „inaktiv“ und „aktiv“. Die Differenzspektren der pH-Titration zeigten, dass der pH-Wert einen dramatischen Effekt sowohl auf die Sekundärstruktur als auch auf den Protonierungszustand der Aminosäureseitenketten hat. Die pH- und Na+-induzierte Aktivierung des Proteins führt zur Umwandlung der transmembranen alpha-helikalen Struktur bezüglich Länge, Ordnungsgrad und/oder Anordnung und zur einer Protonierungsänderung der Aminosäureseitenketten von Glutaminsäure oder Asparaginsäure. Die pD induzierten Sekundärstrukturänderungen lieferten zusätzlich Informationen über die Umgebungsänderung der Aminosäureseitenkette des Tyrosins mit der Aktivierung. Der Vergleich der durch die Bindung des Natriums und des Inhibitors induzierten Differenzspektren zeigte, dass die Bindungsstellen des Natriums und des Inhibitors unterschiedlich sind. Die FTIR- und CD-Ergebnisse für den Na+/H+ Antiporter MjNhaP1 aus M. jannaschii, der im Gegensatz zu NhaA bei pH 6 aktiv und bei pH Werten > 8 inaktiv ist, zeigten, dass ähnlich wie NhaA das Protein im aktiven Zustand bei pH 6 hauptsächlich aus alpha-Helices aufgebaut ist. Es bestand die Möglichkeit, zwei verschiedene Probenpräparationen (Protein in Detergenz bzw. in 2D-Kristallen) zu untersuchen und miteinander zu vergleichen. Die Erhöhung des pH-Werts bei der in Detergenz solubilisierten Probe führte zu einer Abnahme der alpha-helikalen und einer Zunahme der ungeordneten Strukturen. Das äußerte sich auch in den Untersuchungen zur thermischen Stabilität und im (1)H/(2)H Austauschexperiment. Die thermische Stabilität der alpha-Helices nahm mit der Inaktivierung dramatisch ab. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass bei der Aktivierung von MjNhaP1 die beta-Faltblattstruktur nicht involviert ist, aber diese von fundamentaler Bedeutung für die Gesamtstabilität des Proteins und wahrscheinlich für den Hauptkontakt zwischen den Monomeren verantwortlich ist. Im Gegensatz zu NhaA ist die Monomer Monomer Wechselwirkung nicht für die Aktivität von MjNhaP1 notwendig. Aufgrund des höheren Anteils von ungeordneter Struktur im inaktiven Zustand der in Detergenz solubilisierten Probe beobachtet man in diesem Zustand einen höheren (1)H/(2)H Austausch. Der Vergleich mit den Ergebnissen des (1)H/(2)H Austausches von 2D-Kristallen ermöglichte die Lokalisation der ungeordneten Struktur an der Außenseite des Proteinmoleküls im inaktiven Zustand. Die pH-induzierten Differenzspektren zeigten, dass die Aktivierung zu einer Helikalisierung des Proteins und einer Protonierungsänderung der Aminosäureseitenketten von Asparaginsäure und/oder Glutaminsäure unabhängig von der Probenpräparation führt. Der Vergleich von NhaA und MjNhaP1 zeigt, dass die Aktivierung in beiden Fällen mit einer Konformationsänderung und Änderung der Protonierung oder der Umgebung von einer oder mehreren Seitenketten von Asparaginsäure oder Glutaminsäure verbunden ist. Dabei sind die Strukturänderungen der beiden Proteine während der Aktivierung ähnlich, bei Inaktivierung jedoch deutlich unterscheidbar. Die pH-induzierten Strukturänderungen wurden bei NhaA und MjNhaP1 durch die Mutanten G338S und R347A, die keine pH-Abhängigkeit der Aktivität zeigen, bestätigt.
• The function of membrane proteins is crucial for many cellular processes. Understanding the function of a protein requires information about its structure, dynamics and interaction with the environment. Spectroscopic techniques like FTIR- and CD-spectroscopy are widely used to get such information. In the present dissertation these methods provide detailed insights about conformational changes of Na+/H+ antiporters. The use of a novel FTIR-ATR-perfusion-cell to record reaction-induced FTIR-difference spectra enabled us to detect even small changes in secondary structure and dynamics of the protein caused by changes of pH and binding of effector molecules. The conformational changes accompanying the activation of the protein were studied for two different Na+/H+ antiporters, i.e., NhaA and MjNhaP1. These two proteins are active in Na+ and H+ transport in different pH ranges. Na+/H+ antiporter NhaA from E. coli has the highest transport activity at pH 8.5 and is completely inactive below pH 6.5. The structure of NhaA is known for the inactive state at pH 4, however, the conformational changes upon activation and the structure of active state are not yet known. FTIR- and CD-spectra analysis revealed that protein secondary structure is composed mainly of alpha-helical structure, but also of some beta-sheet, loops and unordered structures. The FTIR-spectra of inactive and active state showed two spectral components, which indicate the presence of alpha-helices with different properties. The temperature-induced structural changes and reorganisation of the protein during the unfolding process demonstrate that activation of the protein causes a change in the properties of alpha-helices. Thermal stability of this structure decreases with activation. The structure of beta-sheet, which is responsible for the main contact between monomers, shows different thermal behaviour for the inactive and the active state. While the temperature profiles for alpha-helices and &#946;-sheet structure are the same in the active state, they differ in the inactive state. Hence we could conclude that activity of NhaA is associated with the existence of NhaA as a dimer. Protein dynamics and flexibility in the inactive and the active state were analyzed by probing water and H+ accessibility by 1H/2H exchange experiments. In the hydrophilic region of the protein, the amino acid side chains exchange faster in the active state than in the inactive state as a result of the conformational change concomitant with activation. In the transmembrane region, activation also leads to conformational changes resulting in an open conformation which is more accessible for the solution. The recording of reaction induced difference spectra yielded unique spectroscopic signatures for the “inactive” and “active” states. The difference spectra of pH-titration showed that the pH value has a dramatic effect on the secondary structure as well as on the protonation state of the amino acid side chains. The pH- and Na+-induced activation of the protein leads to structural rearrangement of transmembrane alpha-helices in terms of length, order and/or orientation accompanied by changes in protonation state of glutamic- and/or aspartic acid side chains. pD induced secondary structure changes gave additional information about changes in the environment of tyrosine side chain with activation. Comparison of difference spectra induced by binding of sodium and an inhibitor of transport indicated different binding sites. MjNhaP1 a Na+/H+ antiporter from M. Jannaschii, in contrast to NhaA, is active at pH 6 and inactive at pH 8. Similar to NhaA, the analysis of FTIR- and CD-spectra showed that the secondary structure of MjNhaP1 in the active state is mainly formed by alpha-helices. In this case it was possible to investigate and compare the results of two different sample preparations (detergent and 2D crystals). Increasing the pH-value of detergent-solubilised protein caused a decrease in alpha-helical content and increase in unordered structure content in the secondary structure. The study of thermal stability and water accessibility supported these results. Thermal profiles indicated a dramatic decrease in stability of alpha-helical structure with inactivation of the protein. These results showed also that beta-sheet part of the secondary structure is not involved in activation of the protein, but nevertheless is crucial for its overall structural stability. In analogy to NhaA, the &#946; sheet structure probably forms the main contact between monomers, but in contrast to NhaA the monomer-monomer interaction is not essential for its activity. The inactive state of the detergent-solubilised protein, having a higher fraction of unordered structure, resulted in higher 1H/2H exchange than the active state. Comparing this with the results of 2D crystals allowed the localisation of unordered structure in the inactive state to be on the outside regions of the protein molecule. pH-induced difference spectra showed that activation is accompanied by helicalisation of the protein as well as by protonation of glutamic- and/or aspartic acid side chains, and is independent of sample preparation. The results of NhaA and MjNhaP1 demonstrated that in both cases the activation is associated with conformational and protonation changes of amino acids. The secondary structure changes of both proteins are similar during activation, but clearly distinguishable for inactivation. The observed pH-induced structural changes of NhaA and MjNhaP1 are proven with the mutants G338S and R347A, which do not show pH-dependent activity. The difference spectra of the mutants help to assign IR bands due to activation of the protein.