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"Entwicklung und Anwendung eines Testes zum klinischen Monitoring einer Therapie mit rFVIIa bei thrombozytären Gerinnungsstörungen"

  • Bisherige zellfreie Labormethoden und in-vitro-Diagnostik zielen darauf ab, die Zeit von der Auslösung der Gerinnung bis zur Gerinnselbildung zu messen. Sie sind aber nicht für die Messung der Wirksamkeit von rFVIIa als Medikament geeignet, das für seine hämostatische Wirksamkeit die Funktionen von Blutzellen, besonders Plättchen, benötigt. Außerdem erfassen diese Gerinnungsteste nur einen bestimmten Abschnitt der Gerinnung und ein Zeitablauffenster, welches einen geringen Anteil (<5 %) des insgesamt gebildeten Thrombins erfasst und die Dynamik der Thrombingenerierung unberücksichtigt lässt. Die Plättchen und ihre Physiologie spielen aber die Hauptrollle in der Phospholipid-Präsentation die auf der Plättchenmembran erfolgt. Dies ist Voraussetzung für eine individuell ausreichende Thrombinbildung. Die Erfassung des endogenen Thrombinpotentials (ETP) in plättchenreichem Plasma, wie sie in dieser Arbeit verwendet wurde, überwindet diese methodischen Nachteile der etablierten Teste. Damit lässt sich eine individuelle Wirkungs- und Risikovorhersage erstellen, da hämostaserelevante Charakteristika wie z.B. Erkrankungen, Komedikation, Geschlecht, Umwelt- und lebensstilabhängige Faktoren, in die Untersuchungen einbezogen werden. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, die inter- und intraindivuellen Unterschiede in der Thrombinbildung in plättchenreichem Plasma (PRP) zeigt. Ausgehend von den dargestellten in-vitro Ergebnissen mit gesunden Probanden wurde die Wirksamkeit von rFVIIa im TGT, zusätzlich vergleichend und validierend mit Hilfe der Durchflusszytometrie (FACS), bei Patienten mit Thrombasthenie Glanzmann untersucht. Diese sind aufgrund einer thrombozytenfunktionsstörungsbedingten Blutungsneigung in den plasmatischen Gerinnungstesten unauffällig. Evaluiert wurden hetero- und homozygote Patienten mit unterschiedlichen zugrundeliegenden Mutationen. Zuerst wurden Proben von einer Familie in-vitro untersucht, dann eine Patientin, die im Rahmen eines zahnärztlichen Eingriffs (ex-vivo-in-vitro) unter Einbindung der klinischen Beobachtung überwacht wurde. Der TGT zeigt eine deutliche prohämostatische Wirksamkeit von rFVIIa bei allen Probanden und Patienten, FACS erfasst die zugrundeliegenden Zellfunktionen. Dabei werden Unterschiede zwischen gesunden Probanden, heterozygoten und homozygoten Patienten aufgezeigt, die diagnostisch und therapeutisch verwertbar sind. Unterschiedliche Mutationen und weitere ursächliche thrombozytäre Mechanismen schlagen sich in entsprechenden Änderungen der gemessenen FACS-Parameter nieder, die zum großen Teil mit den TGT-Werten für ETP und PEAK korrelieren. Die TGT-Werte zeigen, gerade für die Patientin EG, deren Behandlung mit rFVIIa überwacht wurde, eine stärkere Korrelation mit der Klinik als die FACSMethode. Diese wiederum erfasst die zellfunktionsbedingten Ursachen analytischer. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Messung und Auswertung der TGT-Parameter ETP und PEAK, in geringerem Maße LT und TTP, die prohämostatische Wirkung Zellfunktions-basierter Medikamente in plättchenreichem Plasma erfasst. Damit erlaubt sie über die Charakterisierung von Gerinnungsstörungen hinaus prädiktive Aussagen über die individuell angemessene Dosierung von rFVIIa (NovoSeven®).
  • Established cell-free laboratory and in-vitro diagnostic clotting assays measure the time from triggering coagulation to clot formation. However, they are not suitable for assaying the haemostatic efficacy of rFVIIa as a therapeutic agent that requires the function of blood cells and exceptionally, of platelets. Moreover, these coagulation tests measure only a limited part of the coagulation process through a time window which covers only a small part (< 5 %) of the thrombin formed, neglecting the dynamics of thrombin formation. What is more, the platelets and platelet physiology play the main role in presenting phospholipids on the platelet membrane, which is a prerequisite for an individually sufficient thrombin generation. Thus, the recording of the endogenous thrombin potential (ETP) in platelet-rich plasma (PRP), as it was used in the work presented here, overcomes these methodical disadvantages of the established laboratory tests. Using the ETP, an individual efficacy and risk prediction becomes feasible, incorporating characteristics of haemostatic relevance such as diseases, concomitant medication, sex, environmental and life-style related factors. In this work the thrombin generation test (TGT) was established and evaluated as a method that shows inter- and intraindividual differences regarding the thrombin generation in platelet-rich plasma. Based on the presented in-vitro results with healthy persons, the efficacy of rFVIIa in patients with Glanzmann’s Thrombasthenia (GT) was investigated using the TGT. The GT patients appear as normal in cell-free, plasma-based coagulation tests, due to their thrombocyte functions related bleeding tendency. The TGT results were compared to and validated against flow cytometry (FACS) tests. The evaluation comprised hetero- and homozygous patients with different underlying mutations. First, samples from a familiy were investigated, then from a patient in the course of a dental procedure (ex-vivo-in-vitro), where they were correlated with the clinical observations. The TGT showed a markedly prohaemostatic efficacy of rFVIIa for all healthy persons and patients, whereas FACS measured the underlying cellular functions. Thereby, differences between healthy persons, heterozygous and homozygous patients were detected that can be utilized for diagnostic or therapeutic purposes. Different mutations and other underlying thrombocyte-related mechanisms are reflected in the changes of the FACS parameters that correlate with the TGT values for ETP and PEAK. However, especially for patient EG who had her treatment monitored, the TGT showed a stronger correlation with the clinical observations than the FACS method. The latter is, in contrast, more analytical for determining causes related to cell functions. The results from the work presented here show that recording and evaluating the TGT parameters ETP and PEAK, to a lesser extent LT and TTP, reflects the prohaemostatic efficacy of therapeutic agents based on cellular function. Thus, beyond the characterisation of coagulation disorders the TGT permits predictive statements concerning appropriate individual doses of rFVIIa (NovoSeven®).

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Metadaten
Author:Wolfgang Wegert
URN:urn:nbn:de:hebis:30-68476
Referee:Carl M. Kirchmaier
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/08/20
Year of first Publication:2008
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2009/07/08
Release Date:2009/08/20
HeBIS-PPN:215054466
Institutes:Medizin / Medizin
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht