Open Access

Björn-Philipp Kloke

• SIVsmmPBj-derived lentiviral vectors are capable of efficient primary human monocyte transduction, a capacity which is linked to the viral accessory protein Vpx. To enable novel gene therapy approaches targeting monocytes, in this thesis it was aimed to generate enhanced lentiviral vectors that meet the required standards for clinical applications with respect to gene transfer efficiency and safety. The vectors were tested for their suitability in a relevant therapeutic gene transfer approach. At first, it was investigated whether vectors derived from another Vpx-carrying lentivirus reveal the same capacity for monocyte transduction as SIVsmmPBj-derived vectors. A transduction experiment using HIV-2-derived vectors in comparison to PBj-derived vectors revealed a comparable transduction capacity, thus disproving the assumed uniqueness of the PBj vectors. The further generation and analysis of expression constructs for the vpx genes of HIV-2 and SIVmac demonstrated a similar functionality in monocyte transduction as the Vpx of PBj. As VpxPBj, both Vpx proteins facilitated monocyte transduction of a vpx-deficient PBj-derived vector system. For the generation of enhanced SIVsmmPBj and HIV-2 vector systems, only the transfer vectors were optimized, since the packaging vectors available already meet current standards. At first, several modifications were introduced into an available preliminary PBj-derived transfer vector by conventional cloning. The modifications included insertions of cPPT/CTS and WPRE as well as the deletions of the remaining pol sequence, the second exons of tat end rev, and the U3-region within the 3’LTR to generate a SIN vector. Thus, beside safety enhancement, the vector titers were also increased from 9.1x105 TU/ml achieved after concentration with the initial transfer vector up to 1.1x107 TU/ml with the final transfer vector. The PBj vector retained its capability of monocyte transduction when supplemented with Vpx. This conventional method of vector enhancement is time-consuming and may result in only sub-optimal vectors, since it depends on the presence of restriction sites which may not allow deletion of all needless sequences. Moreover, mutations may accumulate during the high number of cloning and amplification steps. Therefore, a new and easier method for lentiviral transfer vector generation was conceived. Three essential segments of the viral genome (5‘ LTR, RRE, ΔU3-3’ LTR) are amplified on the template of the lentiviral wild-type genome and fused by Fusion-PCR. Further necessary elements namely the cPPT/CTS-element, MCS, and PPT are included into the resulting vector by extension of the nucleotide primers used for the PCRs. The amplified and fused vector-scaffold can easily be integrated into a plasmid backbone, followed by insertion of the expression cassette of choice. By applying this approach, two novel lentiviral transfer vectors, based on the non-human SIVsmmPBj and the human HIV-2, were derived. Vector titers achieved for PBj and HIV-2 vectors supplemented with Vpx reached up to 4.0x108 TU/ml and 5.4x108 TU/ml, respectively. The capacity for monocyte transduction was maintained. Thus, safe and efficient, state of the art HIV-2- and PBj-derived vector systems are now available for future gene therapy strategies. Finally, the new vectors were used to set up an approach for gene correction of gp91phox-deficient monocytes for the treatment of X-linked chronic granulomatous disease (xCGD). The administration of autologous, gene-corrected monocytes to counteract systemic and acute infections could lead to a decreased infection load, dissolve granulomas and therefore improve the survival rate of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) which is the current treatment of choice for this disease. First, methods for analysis of gp91phox function were established. Next, they were employed to demonstrate the capacity of monocytes, obtained from healthy humans or mice, for phagocytosis, oxidative burst, and Staphylococcus aureus killing. The in vivo half-life of murine monocytes in the bloodstream and their distribution to specific tissues was determined. Lastly, HIV-1 vectors were used to transfer the gp91phox gene into monocytes from gp91phox-deficient mice. This resulted in the successful restoration of the oxidative burst ability in the cells. In summary, the general suitability of the new vectors for treatment of CGD by monocyte transduction was demonstrated. The results of the mouse experiments provide the foundation for future challenge experiments to evaluate the capability of gene-corrected monocytes to kill off microbes in vivo.
• Vektoren, die vom simianen Immundefizienzvirus (SIV) smmPBj abgeleitet sind, besitzen die Fähigkeit primäre humane Monozyten zu transduzieren. Diese Fähigkeit ist von dem viralen Protein Vpx abhängig. Da Monozyten ein attraktives Ziel für die Gentherapie darstellen, sollten sichere und effiziente lentivirale Vektorsysteme konstruiert werden, die den Ansprüchen klinischer Applikationen gerecht werden. Anschließend sollten die Vektoren in die Entwicklung einer neuen potentiellen Anwendungsmöglichkeit integriert werden. Zunächst wurde untersucht, ob auch Vektorensysteme anderer Lentiviren, die ebenfalls ein vpx-Gen besitzen, zur Transduktion von Monozyten in der Lage sind. Es stellte sich heraus, dass HIV-2-abgeleitete Vektoren die gleiche Transduktionsfähigkeit wie PBj-abgeleitete Vektoren besitzen, was die bis dahin angenommene Einzigartigkeit der PBj-Vektoren widerlegt. Zudem wurde für die Vpx-Proteine von SIVmac und HIV-2 gezeigt, dass sie wie VpxPBj eine Transduktion von Monozyten durch PBj-abgeleitete Vektoren ermöglichen. Zur Herstellung von PBj- und HIV-2-abgeleiteten Vektoren wurden optimierte Transfervektoren generiert. Verpackungsvektoren waren für beide Vektorsysteme bereits verfügbar. In einem ersten Schritt wurde zunächst durch aufeinanderfolgende Klonierungsschritte der bereits vorhandene, einfache PBj-Transfervektor verbessert. Hierbei wurden sowohl Verbesserungen vorgenommen, die wichtig für die Sicherheit des Systems sind (self-inactivating (SIN)-Konfiguration, Minimierung der viralen Sequenzen) als auch Elemente integriert, die die Vektorproduktion und damit die Effizienz des Gentransfers verbessern (central polypurine tract / central termination sequence (cPPT/CTS), woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE)). Mit den graduellen Verbesserungen der PBj-abgeleiteten Transfervektoren war es möglich den Titer im Vergleich zum Ausgangskonstrukt von 9,1x105 TU/ml auf 1,1x107 TU/ml nach Konzentration zu steigern. Generell ist eine sukzessive Optimierung von Transfervektoren aufgrund vieler notwendiger Klonierungsschritte und oft fehlender Restriktionsschnittstellen sehr aufwändig und kompliziert. Durch die eingeschränkten Restriktionsmöglichkeiten können überflüssige virale Sequenzen oft nicht einfach entfernt werden. Diese Probleme konnten in dieser Arbeit durch die Entwicklung einer Klonierungsstrategie, die die Herstellung von lentiviralen Transfervektoren stark vereinfacht, gelöst werden. Hierbei werden drei essentielle Segmente (5‘-LTR, RRE, ΔU3-3’ LTR) des Transfervektors, ausgehend von der viralen Wildtypsequenz, mittels PCR amplifiziert. Alle weiteren notwendigen Elemente, wie cPPT/CTS oder PPT, werden über Verlängerungen der verwendeten PCR-Primer integriert. Die Primer enthalten zudem komplementäre Sequenzen, durch welche die drei Segmente anschließend durch die Methode der Fusions-PCR verknüpft werden können. Das entstandene PCR-Fragment kann dann in ein bakterielles Plasmid integriert und eine Expressionskassette eingefügt werden. Mit dieser neuen Methode der Generation von Transfervektoren wurden von HIV-2- und SIVsmmPBj-abgeleitete Vektoren mit Titern bis zu 5,4x108 TU/ml bzw. 4,0x108 TU/ml generiert. Für alle optimierten Vektoren wurde die Fähigkeit, Monozyten in Abhängigkeit vom vpx-Gen effizient zu transduzieren, erhalten. Somit sind neue HIV-2- und PBj-abgeleitete lentivirale Vektoren entwickelt worden, die einen hohen Grad an Sicherheit und Effizienz für den Gentransfer in Monozyten aufweisen. Folglich konnte eine neue potentielle Anwendungsmöglichkeit für diese Vektoren entwickelt werden. Diese beruht auf der Gen-Korrektur von gp91phox-defizienten Monozyten zur Behandlung der X-chromosomal gebundenen Form der Septischen Granulomatose. Eine Reinfusion von autologen, gp91phox-korrigierten Monozyten könnte einen antibakteriellen und antimykotischen Effekt im Patienten zeigen und wäre so möglicherweise in der Lage akute Infektionsphasen einzuschränken oder vorhandene Granulome aufzulösen. Dies könnte zusätzlich die statistische Überlebensrate der gegenwärtig bevorzugten Therapie der Hämatopoetischen Stammzelltransplantation verbessern. Hierfür wurden zunächst verschiedene Methoden zur Analyse von murinen und humanen Monozyten etabliert und mit ihrer Hilfe die Fähigkeit der Phagozytose, des Oxidativen Burst sowie ein moderates Staphylococcus aureus „Killing“ in vitro bestätigt. Zusätzlich wurde die Biodistribution und die Halbwertszeit von Maus-Monozyten bestimmt. Daraufhin wurde das gp91phox-Gen in Monozyten von gp91phox-Knock-out-Mäusen ex vivo transferiert. Hierfür mussten HIV-1-Vektoren eingesetzt werden, da sich die in dieser Arbeit konstruierten HIV-2- oder SIVsmmPBj-Vektoren als ineffizient zur Transduktion von Maus-Monozyten erwiesen haben. Für eine zukünftige Anwendung am Menschen kämen umgekehrt nur die neuen Vektoren in Frage. Mit den HIV-1-Vektoren konnte das korrekte gp91phox-Gen in murine Monozyten eingebracht und die Fähigkeit zum „Oxidativen-Burst“ wiederhergestellt werden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass in dieser Arbeit sichere und effiziente lentivirale Vektoren für den Gentransfer in primäre Monozyten generiert wurden. Die Analyse humaner und muriner Monozyten und Experimente zur Übertragung des gp91phox-Gens lassen erwarten, dass die Korrektur von gp91phox-defizienten Monozyten hilfreich für die Therapie der Septischen Granulomatose sein könnte, und dass das gp91phox-Knock-out-Mausmodell zur Erprobung dieses Ansatzes geeignet ist.