Open Access

Anne-Kathrin Thiemens

• Die akute Nierenschädigung ist ein häufiges klinisches Erscheinungsbild, das trotz der heutigen Erkenntnisse über pathophysiologische Abläufe in der Niere mit einer erhöhten Morbidität und Mortalität assoziiert ist. Die eigene Fähigkeit der Niere zur Regeneration stellt ein Potenzial dar, das durch die Unterstützung pro-regenerativer Faktoren das Patientenüberleben verbessern kann. Das Wissen, dass die akute Nierenschädigung ein reversibles Ereignis darstellt, bestärkt den Einsatz der Forschung pro-regenerative Einflussfaktoren zu bestimmen, deren Zusammenhang darzustellen und eine mögliche Strategie zur innovativen Therapie zu entwickeln. Um eine akute Nierenschädigung darzustellen und anschließend auf regenerative Prozesse zu untersuchen, wurde ein Cisplatin-induziertes in vitro-Schädigungsmodell an primären Tubulusepithelzellen (mTEZ) aus Wildtyp Mäusen etabliert. Nach Isolation und Kultivierung primärer mTEZ erfolgte die Schädigung mit Cisplatin, die anhand eines Zytotoxizitätsnachweises quantifiziert wurde. Makrophagen zeichnen sich durch ihre funktionale Vielfalt in physiologischen als auch pathophysiologischen Abläufen aus. Ihre Plastizität ermöglicht es ihnen, sich entsprechend des umgebenden Milieus mit ihrem Phänotyp anzupassen und folglich in Form eines pro-regenerativen Makrophagen Proliferation und Reparaturprozesse zu unterstützen. Für die Untersuchung einer Makrophagen-vermittelten, pro-regenerativen Wirkung auf geschädigte mTEZ wurden primäre Zellen aus dem Knochenmark von Mäusen isoliert und zu Makrophagen differenziert. Zur Ausprägung eines pro-regenerativen Makrophagen Phänotyps erfolgte die Stimulation der kultivierten Makrophagen durch Inkubation mit Interleukin-10 (IL-10) und die Herstellung eines konditionierten Mediums (KM). Lipocalin-2 (Lcn-2) ist bekannt als früher Biomarker im Rahmen der akuten Nierenschädigung, aber zeichnet sich zusätzlich durch seine pro-proliferative Wirkung und regenerative Funktion aus. Lcn-2 ist ein Protein, das Eisen mit hoher Affinität bindet und in Makrophagen als alternativer Eisen-Transportmechanismus dient. In der vorliegenden Untersuchung stellte sich bei Stimulation mit IL-10 ein pro-regenerativer Makrophagen Phänotyp dar, der sich durch eine erhöhte Eisenfreisetzung und dem erhöhten Nachweis von Eisen-beladenen Lcn-2 im KM auszeichnete (holo-Lcn-2). Um den Zusammenhang von Lcn-2 aus IL-10-stimulierten Makrophagen und die regenerativen Eigenschaften auf mTEZ zu untersuchen, wurde ein Versuchsaufbau etabliert, indem mTEZ mit Cisplatin geschädigt und anschließend ein KM von IL-10-stimulierten Wildtyp (WT) oder Lcn-2 knockout Makrophagen hinzugefügt wurde. Zusätzlich wurde ein rekombinantes holo-Lcn-2 hergestellt, das als Zugabe zu KM von Lcn-2 knockout Makrophagen der Wiederherstellung und der Untersuchung eines Lcn-2-abhängigen Mechanismus diente. Als Merkmal einer Zellregeneration wurden die epitheliale Integrität und die Reorganisation des Zytoskeletts bestimmt. Ergänzend konnte mit Hilfe der Expression von Proliferationsmarkern sowie einer Echtzeitmessung der Proliferationsrate eine zunehmende Proliferation geschädigter mTEZ nach Zugabe von KM aus Makrophagen in Abhängigkeit von Lcn-2 bewiesen werden. Anschließend wurde eine Analyse des Eisengehalts im Zelllysat von mTEZ durchgeführt. Hierbei konnte ein signifikanter Anstieg des Eisengehaltes in mTEZ nach Zugabe von KM aus WT Makrophagen als auch durch Ergänzung von rekombinanten holo-Lcn-2 zu KM aus Lcn-2 knockout Makrophagen nachgewiesen werden. In der Korrelation zwischen Eisenmenge im Zelllysat der mTEZ und der Proliferationsrate ergab sich eine zunehmende Proliferation mit Anstieg des Eisengehaltes der Zelle. Zusammenfassend ergaben unsere Untersuchungen, dass KM aus pro-regenerativen Makrophagen die Überlebensfähigkeit von mTEZ nach Cisplatin-Schädigung steigert. Es zeigte sich auch eine durch Lcn-2 geförderte epitheliale Integrität sowie ein pro-proliferativer Effekt. Die regenerativen Effekte an mTEZ wurden durch Lcn-2 aus KM von IL-10-stimulierten Makrophagen über seine Eisen-bindende Funktion vermittelt. Über die Ausschüttung von Lcn-2 vermitteln pro-regenerative Makrophagen vermutlich die Zell-Regeneration von mTEZ, indem Lcn-2 toxisches Eisen von geschädigten und apoptotischen Zellen aus der Umgebung bindet, es Zielzellen als holo-Lcn-2 zur Verfügung stellt und hierdurch die Proliferation induziert.
• Despite current knowledge of pathophysiological processes in the kidney, the acute kidney injury is a frequent clinical manifestation and associated with high morbidity and mortality. The kidney´s own ability to regenerate represents a potential to improve patients’ outcome by supporting underlying pro-regenerative factors in the context of therapeutic treatment. Considering that acute kidney injury is a reversible event encourages the research on pro-regenerative factors, their interconnections and develop innovative therapeutic options. To demonstrate acute damage of kidney injury and subsequently examine regenerative processes, a cisplatin-induced model was established consisting of primary murine tubule epithelial cells derived from wild-type mice (mTEC) in vitro. Isolation and culturing of primary mTEC was followed by cisplatin-induced injury, which was quantified by survival assays. Macrophages are characterized by their functional diversity in both physiological and pathophysiological processes. Their influence on the course of acute kidney injury includes the onset of damage as well as the later regenerative phase. Their plasticity allows them to adapt their phenotype according to the environment and, consequently, to support proliferation and repair as pro-regenerative macrophages. To investigate a macrophage-mediated pro-regenerative effect on damaged kidney cells, primary bone marrow-derived cells were isolated and differentiated into macrophages. Stimulation of cultured macrophages was performed by incubation with IL-10 to express a pro-regenerative macrophage phenotype and to collect the conditioned medium (CM). In addition, macrophages fulfill a central role in iron metabolism by storage and supply of iron through the regulation of their iron gene profile and the production of iron specific proteins. Lcn-2 is an early biomarker in the context of acute kidney injury but is also characterized by its pro-proliferative effect and regenerative function. Lcn-2 is an iron-binding protein that binds iron with high affinity and serves as an alternative iron transport mechanism in macrophages. In the present study a pro-regenerative, iron-release macrophage phenotype depending on macrophage IL-10-stimulation was confirmed. In addition, pro-regenerative macrophages were characterized by increased release of iron-loaded Lcn-2. The next survey was to investigate the effect of Lcn-2 from IL-10-stimulated macrophages on damaged kidney cells and the assessment of its regenerative and proliferative properties in response to iron. In this context, an experimental setup was established by damaging mTEC with cisplatin and then adding CM of IL-10-stimulated WT or Lcn-2 knockout macrophages. Further, a recombinant holo-Lcn-2 was produced and used in addition to CM from Lcn-2 kockout macrophages to restore and investigate an Lcn-2-dependent mechanism. As a feature of cell regeneration, epithelial integrity and reorganization of cell structures as functional cytoskeleton were determined. Additionally, expression of proliferative markers and real-time measurement of proliferation rate demonstrated increasing proliferation of damaged mTEC after addition of CM from macrophages in a Lcn-2-dependent manner. Knowing that macrophages with their iron-releasing activity and Lcn-2 as an iron transport protein actively influence the available iron in the microenvironment, an analysis of the iron content in the cell lysate of mTEC was then performed. Here, a significant increase in iron content in mTEC was demonstrated after addition of KM from WT macrophages as well as by supplementation of recombinant holo-Lcn-2 to CM from Lcn-2 knockout macrophages. In the correlation between the iron amount in cell lysate of mTEC and the proliferation rate, the extent of iron content resulted in increasing proliferation. In summary, our studies revealed that CM derived from pro-regenerative macrophages increased mTEC survival after cisplatin injury in a Lcn-2 dependent manner. Here, Lcn-2 promoted epithelial integrity and showed a pro-proliferative effect. The regenerative effect on mTEC was mediated by Lcn-2 from CM of IL-10-stimulated macrophages via its iron-binding function. Through the release of Lcn-2, pro-regenerative macrophages presumably mediate regeneration by Lcn-2 binding of toxic iron from damaged cells and providing it to target cells as holo-Lcn-2, thereby inducing proliferation.